百里醌類似物ATQTHB對肺癌細(xì)胞株A549增殖與凋亡的影響

馬 剛，納 莉，王 婷，黃 菱，李凱璇

肺癌是威脅人類健康的重大疾病，是目前發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，預(yù)后差，5年生存率低于15%[1]。黑種草子是阿拉伯地區(qū)及我國新疆、云南、西藏等地的特色植物?，F(xiàn)代研究表明，黑種草子具有止咳平喘、抗腫瘤、保肝、降脂等多方面藥理功效[2-4]。百里醌是黑種草子的主要成分之一。文獻(xiàn)報道百里醌對肺癌、胰腺癌等多種腫瘤細(xì)胞有抑制增殖、促進(jìn)凋亡的作用[5]。ATQTHB是由MUJAHID YUSUFI等學(xué)者[6]首先合成并報道的百里醌類似物之一，研究發(fā)現(xiàn)ATQTHB對胰腺癌細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用。ATQTHB對肺癌細(xì)胞是否也具有抑制增殖的作用，目前尚未見到文獻(xiàn)報道。本研究以人肺腺癌A549細(xì)胞為主要研究對象，研究百里醌類似物ATQTHB對其增殖是否具有抑制作用，為抗腫瘤藥物篩選提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和人正常肺上皮細(xì)胞系BEAS-2B均購自中國細(xì)胞資源庫保藏中心。CCK-8試劑盒購買自北京索萊寶公司；流式凋亡檢測試劑盒采購自北京達(dá)科為生物公司；小鼠抗人Bcl-2單克隆抗體、小鼠抗人BAX多克隆抗體購買自美國Abcam公司；內(nèi)參Actin抗體、HRP-兔抗小鼠IgG抗體購自北京金杉中橋公司。RPMI 1640和胎牛血清(FBS)購自美國invitrogen公司。Percoll試劑和PBS緩沖液購自北京索萊寶公司。CCK-8檢測采用全波長分光光度儀(美國Thermo公司)；流式檢測采用美國貝克曼庫爾特有限公司CytoFLEX流式細(xì)胞儀；Western blot實驗電泳、轉(zhuǎn)膜及曝光系統(tǒng)是美國Bio-rad公司設(shè)備。

1.2 實驗設(shè)計：①委托藥明康德公司人工合成百里醌類似物ATQTHB，純度95%。②隨后，采用CCK-8細(xì)胞增殖實驗分析不同濃度的ATQTHB(18.75、37.5、75、150、200、300、400、600 μg/mL)對肺癌A549細(xì)胞增殖是否具有抑制作用以及最適干預(yù)濃度。③采用最適濃度干預(yù)，分為5組：空白對照組、A549細(xì)胞組、A549細(xì)胞+ATQTHB干預(yù)組、人正常肺上皮細(xì)胞(BEAS-2B)組、BEAS-2B細(xì)胞+ATQTHB干預(yù)組。采用CCK-8法分析細(xì)胞增殖抑制情況，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡水平，采用western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)水平。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 CCK-8檢測細(xì)胞增殖：取對數(shù)生長期A549細(xì)胞或BEAS-2B細(xì)胞分別種入96孔板， 200 μl每孔含有 1×104個細(xì)胞， 培養(yǎng)24 h后分別加入200 μl終濃度為18.75、37.5、75、150、200、300、400、600 μg/mL的ATQTHB溶液，對照孔僅加入完全培養(yǎng)基。孵育48 h后吸去上液，加入50 μg/mL的CKK-8溶液100 μl，培養(yǎng)4 h后吸去上液，加入150 μl DMSO，脫色搖床振蕩10 min后用酶標(biāo)儀檢測 570 nm/490 nm 密度值(OD值)。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：經(jīng)上述各組處理后收集細(xì)胞，用PBS清洗2遍，4 ℃、400×g離心5 min。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL，采用流式凋亡試劑盒中FITC-Annexin V和PI的4 ℃避光孵育30 min后，PBS清洗2遍，4 ℃，400×g離心5 min。細(xì)胞重懸于300 μl PBS緩沖液，經(jīng)100目濾網(wǎng)過濾后，用Beckman公司CytoFLEX流式細(xì)胞儀上樣檢測。使用LEGENDplex軟件(美國Biolegend公司)分析數(shù)據(jù)。

1.3.3 Western blot分析：提取總蛋白后制備等量樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。5%脫脂牛奶封閉2 h，洗膜后分別加入一抗：小鼠抗人Bcl-2抗體、小鼠抗人BAX抗體，4 ℃孵育過夜。取出平衡室溫后加入兔抗小鼠 HRP-IgG二抗，室溫孵育1 h，加入增強化學(xué)發(fā)光顯色液，立即采用ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光拍照。條帶灰度掃描分析用Image J灰度分析軟件，結(jié)果以目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參灰度值表示。本研究以Actin為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度百里醌類似物ATQTHB對A549細(xì)胞增殖的影響：分別采用濃度為18.75、37.5、75、150、200、300、400、600 μg/mL的ATQTHB溶液作用于A549細(xì)胞，CCK-8結(jié)果表明，各個濃度均具有顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用(P<0.05)。濃度在18.75～300 μg/mL，抑制細(xì)胞增殖程度在各濃度之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。當(dāng)百里醌類似物ATQTHB濃度為400 μg/mL時，肺癌A549細(xì)胞增殖抑制作用強于300 μg/mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；濃度在400～600 μg/mL時差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，ATQTHB最佳抑制細(xì)胞增殖濃度應(yīng)為400 μg/mL，無顯著劑量依賴性，見圖1(目錄后)。

2.2 百里醌類似物ATQTHB具有抑制A549細(xì)胞增殖的作用：采用上述最適濃度400 μg/mL ATQTHB分別干預(yù)肺癌A549細(xì)胞和人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B，結(jié)果表明，與A549細(xì)胞組相比，ATQTHB干預(yù)對A549細(xì)胞增殖具有顯著抑制作用(P<0.05)；而ATQTHB干預(yù)后，人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B增殖具有下降趨勢，但與未干預(yù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖2(目錄后)。

2.3 流式檢測ATQTHB對A549細(xì)胞凋亡的影響：與A549組相比，A549+ATQTHB 400 μg/mL干預(yù)組的A549細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與BEAS-2B組相比，BEAS-2B+ATQTHB 400 μg/mL干預(yù)組的細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3(目錄后)。

2.4 Western blot檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果：與A549細(xì)胞組相比，A549細(xì)胞+ATQTHB 400 μg/mL干預(yù)組的抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著減少(P<0.05)，而促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)；與BEAS-2B細(xì)胞組相比，BEAS-2B+ATQTHB組兩種蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖4(目錄后)。

3 討論

百里醌具有明顯的抗腫瘤效應(yīng)，但因百里醌的半數(shù)抑制濃度(IC50)過高，成為其向藥品研發(fā)過程中的瓶頸，因此學(xué)者們把百里醌抗腫瘤的研究轉(zhuǎn)向了百里醌類似物[7]。本研究旨在評價百里醌類似物ATQTHB對肺癌細(xì)胞增殖的作用。研究發(fā)現(xiàn)ATQTHB能夠顯著抑制人肺癌A549細(xì)胞的增殖，最適濃度為4 00 μg/mL，并且呈現(xiàn)劑量的非依賴性。ATQTHB能夠抑制肺癌細(xì)胞的增殖，這與之前文獻(xiàn)中報道的百里醌類似物ATQTHB對乳腺癌具有較好的抑制作用的結(jié)果一致[8]。但是為何會出現(xiàn)劑量非依賴性、以及百里醌類似物的毒副作用等諸多問題尚不清楚，需要后續(xù)實驗支撐。

為了更好地分析ATQTHB的抑制增殖作用是針對肺癌細(xì)胞而非針對正常肺上皮細(xì)胞，本研究采用兩種細(xì)胞同時開展400 μg/mL ATQTHB干預(yù)實驗，發(fā)現(xiàn)ATQTHB能有效抑制肺癌細(xì)胞增殖，而對正常肺上皮細(xì)胞增殖沒有明顯抑制作用，提示ATQTHB如果用于治療肺癌，可能會在產(chǎn)生較小副作用的情況下發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。有研究表明，ATQTHB可明顯誘導(dǎo)人胰腺癌細(xì)胞系BxPC-3的凋亡[1]。也有文獻(xiàn)報道，百里醌能夠通過調(diào)控趨化因子和炎癥因子的釋放而發(fā)揮抗腫瘤作用[9]。此外，百里醌有效成分能夠有效調(diào)節(jié)肺損傷的氧化應(yīng)激[10]，而該抗氧化應(yīng)激作用可能是基于Nrf-2途徑實現(xiàn)的[11]。本研究中涉及的具體機制仍需要在接下來的研究中闡明。為了進(jìn)一步說明ATQTHB導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖抑制的原因，本研究檢測了細(xì)胞凋亡率。結(jié)果表明，ATQTHB可通過促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡發(fā)揮抑制肺癌細(xì)胞增殖的作用，這與之前文獻(xiàn)中報道的百里醌對其他腫瘤的作用相類似[12-13]。研究表明，納米組成的百里醌活性成分對于胰腺癌細(xì)胞的增殖具有顯著抑制作用[12]。而另一項研究也發(fā)現(xiàn)，百里醌的衍生產(chǎn)物具有抗乳腺癌的作用[13]。

本研究檢測了凋亡相關(guān)分子Bcl-2和BAX，結(jié)果表明，ATQTHB能夠減少A549細(xì)胞抑制凋亡的Bcl-2、增加促凋亡的BAX的表達(dá)量，進(jìn)一步表明ATQTHB可通過調(diào)控Bcl-2與BAX促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡，從而抑制肺癌細(xì)胞增殖。在一項針對SK-OV-3卵巢癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，百里醌活性成分能夠通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[14]。百里醌類似物能夠通過促進(jìn)凋亡而抑制直腸癌細(xì)胞Caki-1的增殖，而其機制與JAK2/STAT3介導(dǎo)的Bcl-2和Bax調(diào)控有關(guān)[15]。本研究中涉及的凋亡具體相關(guān)分子通路機制，仍需要后續(xù)進(jìn)一步研究去證實。