周翔魚，曹羿堃，李 娜，儲(chǔ)晨晨，華 冰，王 佳，張秋麗

變態(tài)反應(yīng)是由IgE介導(dǎo)的I型速發(fā)型超敏反應(yīng)，肥大細(xì)胞作為變態(tài)反應(yīng)速發(fā)相應(yīng)答的優(yōu)先靶細(xì)胞， IgE 與其高親和力受體 FcεRI結(jié)合，使機(jī)體處于致敏狀態(tài)[1-2]。類胰蛋白酶(TPS)和組胺(HIS)的釋放量可作為肥大細(xì)胞脫顆粒的標(biāo)志物[3]。此外，介導(dǎo)I型超敏反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞存在抑制性Fc受體-CD32b(FcγR2b)，由胞內(nèi)免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIMs)介導(dǎo)發(fā)揮重要的免疫負(fù)向調(diào)節(jié)作用[4]。本研究以人LAD2肥大細(xì)胞為靶細(xì)胞，采用雜交瘤技術(shù)制備IgG1型大鼠抗人 IgE-Fc單克隆抗體(anti-IgE-Fc mAb)，探究一種新型抑制肥大細(xì)胞脫顆粒效應(yīng)的體液免疫策略。

1 資料與方法

1.1 一般資料：2020年2月于寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買10只8～10周SPF級(jí)雌性SD大鼠，體重(180±1.58)g，自由攝食飲水。

1.2 試劑：Y3 Ag1.2.3骨髓瘤細(xì)胞和人LAD2 肥大細(xì)胞，均購(gòu)自深圳豪地華拓生物科技有限公司。人IgE Fc蛋白(hum-IgE Fc)由空軍軍醫(yī)大學(xué)祝道成教授惠贈(zèng)。

1.3 方法

1.3.1 抗IgE-Fc單克隆抗體制備：將100 μg hum-IgE Fc蛋白每間隔2周免疫SD大鼠，共致敏4次后取脾臟組織，制備脾細(xì)胞懸液與Y3 Ag1.2.3骨髓瘤細(xì)胞以5∶1混合，在50% PEG4000作用下，經(jīng)HAT和HT培養(yǎng)基中篩選融合雜交瘤細(xì)胞。有限稀釋法篩選雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)hum-IgE Fc、OVA和β-內(nèi)酰胺酶包被ELISA板鑒定anti-IgE-Fc mAb特異性。收集上清，ELISA試劑盒測(cè)定IgG1和IgM濃度。

1.3.2 LAD2細(xì)胞脫顆粒變化：實(shí)驗(yàn)分組為Compound 48/80組(Comp 48/80)、Comp 48/80+hum-IgE Fc、Comp 48/80+anti-IgE-Fc mAb和Comp 48/80+hum-IgE Fc+anti-IgE-Fc mAb，分別體外培養(yǎng)48 h，0.05 μm Comp 48/80刺激各組45 min，陰性對(duì)照(Control)不做任何處理。甲苯胺藍(lán)染色觀察各組LAD2細(xì)胞脫顆?，F(xiàn)象并收集上清液，ELISA試劑盒測(cè)定HIS和TPS濃度變化。

1.3.3 TPS和CD32b蛋白表達(dá)變化：采用Western blot法檢測(cè)，即取各組細(xì)胞在裂解蛋白酶作用下提取總蛋白，通過BCA試劑盒對(duì)其濃度進(jìn)行檢測(cè)；上樣電泳后220 V恒壓轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入Rabbit-anti-TPS(1∶500)、Rabbit-anti-CD32b(1∶1 000)和mouse-β-actin(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜；HRP標(biāo)記二抗(1∶20 000)，室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光液，曝光，Image J軟件分析蛋白條帶。

2 結(jié)果

2.1 anti-IgE-Fc mAb制備及亞類鑒定：經(jīng)HAT培養(yǎng)液篩選后呈團(tuán)狀生長(zhǎng)，細(xì)胞間雜交成功。采用有限稀釋篩選出分泌anti-IgE-Fc mAb 的特異性雜交瘤株2F4和6D12；ELISA結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，IgG1表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，IgM差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，即抗原特異性雜交瘤細(xì)胞分泌anti-IgE Fc單克隆抗體亞類為IgG1型。

2.2 LAD2 細(xì)胞脫顆粒實(shí)驗(yàn)：與對(duì)照組相比，各組LAD2 肥大細(xì)胞均釋放大量酸性顆粒呈紫紅色，脫顆粒程度增加，HIS和TPS釋放濃度均顯著增加(P<0.05)。與Comp 48/80組比較，Comp 48/80+hum-IgE Fc組和Comp 48/80+anti-IgE-Fc mAb組脫顆粒程度無明顯變化，HIS和TPS釋放差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而Comp 48/80+hum-IgE Fc+anti-IgE-Fc mAb組釋放酸性顆粒減少，HIS和TPS釋放濃度明顯降低(P<0.05)，見表1，圖1(封三)

2.3 LAD2細(xì)胞TPS和CD32b蛋白表達(dá)變化：Western blot 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Comp 48/80組、Comp 48/80+hum-IgE-Fc和Comp 48/80+anti-IgE-Fc mAb組TPS蛋白表達(dá)均上調(diào)(P<0.05)，CD32b表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Comp 48/80+hum-IgE Fc+anti-IgE-Fc mAb組與Comp 48/80組、Comp 48/80+hum-IgE-Fc組相比TPS表達(dá)下調(diào)，CD32b表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。結(jié)果提示，anti-IgE-Fc mAb在游離的IgE-Fc存在時(shí)可抑制人肥大細(xì)胞脫顆粒，這種作用可能是由CD32b介導(dǎo)。

3 討論

臨床治療變態(tài)反應(yīng)疾病的各種IgG型單克隆抗體受到越來越多的關(guān)注，其中的作用機(jī)制亟待闡明。本研究通過構(gòu)建重組人IgE Fc蛋白制備動(dòng)物源性單克隆IgG1類抗體，經(jīng)過人源化轉(zhuǎn)換并進(jìn)行鑒定分離純化，篩選2株特異性IgG1型抗IgE Fc單克隆抗體的穩(wěn)定雜交瘤細(xì)胞株。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Compound 48/80為肥大細(xì)胞非特異性激活劑，誘導(dǎo)人肥大細(xì)胞劇烈的脫顆粒反應(yīng)(P<0.05)。Compound 48/80和hum-IgE Fc共同刺激肥大細(xì)胞后，肥大細(xì)胞酸性顆粒含量變化較單獨(dú)Compound 48/80作用不明顯，培養(yǎng)液上清液中HIS和TPS釋放濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且LAD2肥大細(xì)胞TPS及CD32b分子表達(dá)均無明顯變化(P>0.05)。由于hum-IgE- Fc蛋白不存在抗體Fab段的抗原互補(bǔ)決定區(qū)，不能有效識(shí)別結(jié)合特異性抗原，F(xiàn)c結(jié)合FcεRI后不發(fā)生受體變構(gòu)和交聯(lián)，無法啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)人肥大細(xì)胞活化脫顆粒[5-6]，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。采用Compound 48/80與anti-IgE-Fc mAb聯(lián)合作用于LAD2肥大細(xì)胞，顆粒含量變化較單獨(dú)Compound 48/80作用不明顯，培養(yǎng)液上清中HIS和TPS釋放濃度，TPS及CD32b分子表達(dá)無明顯變化(P>0.05)。研究表明，IgG1類anti-IgE-Fc mAb的Fab抗原結(jié)合區(qū)可競(jìng)爭(zhēng)性與人IgE- Fc段抗原結(jié)合，肥大細(xì)胞上是否存在已裝配的IgE分子，由于IgG1類抗體的Fc段不能與FcεRI相互作用[7]。因此，單獨(dú)刺激LAD2細(xì)胞時(shí)無脫顆粒效應(yīng)。采用制備的anti-IgE-Fc mAb聯(lián)合Compound 48/80和hum-IgE- Fc致敏LAD2肥大細(xì)胞，酸性顆粒釋放卻明顯減少，上清液中HIS和TPS釋放濃度降低，TPS蛋白下調(diào)，CD32b表達(dá)卻增加(P<0.05)。有研究發(fā)現(xiàn)，肥大細(xì)胞表面表達(dá)CD64、CD32b等IgG1受體，IgG1-Fc與CD64結(jié)合時(shí)產(chǎn)生靶細(xì)胞活化效應(yīng)，但無關(guān)肥大細(xì)胞脫顆粒信號(hào)途徑的激活[8]。IgG1是CD32b的配體之一，能夠誘導(dǎo)CD32b表達(dá)上調(diào)，IgG1-Fab可以特異性地識(shí)別游離的或已結(jié)合在肥大細(xì)胞上的IgE-Fc區(qū)，在IgG1-Fc區(qū)同時(shí)與CD32b結(jié)合，才可以啟動(dòng)胞內(nèi)ITIMs，引起的肥大細(xì)胞脫顆粒反應(yīng)以及胞內(nèi)顆粒組裝，進(jìn)而減輕I型超敏反應(yīng)的炎性反應(yīng)[9-10]?？梢?，CD32b的免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用有助于抑制I型超敏反應(yīng)的病情進(jìn)展。

本研究結(jié)果提示，以游離的IgE-Fc作為變應(yīng)原誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)特異性抗原的IgG1型體液免疫，有望成為I型超敏反應(yīng)的免疫治療策略之一。但本研究中諸多機(jī)制有待于進(jìn)一步闡明，如CD32b抑制性信號(hào)通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白分子還沒有明確，這種抑制肥大脫顆粒作用機(jī)制究竟發(fā)生于顆粒組裝還是運(yùn)輸，或是膜融合及胞吐環(huán)節(jié)也尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。