內質網(wǎng)應激和自噬在骨骼肌再生中的作用研究進展

李春杰，江振洲

(中國藥科大學藥物科學研究院，江蘇 南京 210009)

在日常生活中，由于機械創(chuàng)傷、超負荷、運動、毒素、肌肉營養(yǎng)不良或者其它疾病狀態(tài)等原因，骨骼肌容易產(chǎn)生急性或慢性損傷。肌肉損傷后具有再生修復能力，肌再生由位于基底膜和肌膜之間的肌源性干細胞，即骨骼肌衛(wèi)星細胞(muscle satellite/stem cells,MuSCs)介導，對損傷后完整肌肉功能的恢復至關重要。MuSCs在正常情況下處于靜止狀態(tài)，受損后，MuSCs被激活并快速增殖成為肌源性前體細胞(也稱為成肌細胞)，成肌細胞在經(jīng)歷分化、遷移和融合后最終形成新的肌纖維以修復受損骨骼肌[1]。

內質網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)是維持鈣穩(wěn)態(tài)以及蛋白質正確折疊、加工和運輸?shù)闹匾獔鏊鵞2]。在多種生理病理條件下，ER穩(wěn)態(tài)的破壞會導致未折疊/錯誤折疊蛋白質的堆積，進而引起內質網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)。為了緩解ERS，恢復ER穩(wěn)態(tài)，細胞啟動未折疊蛋白質反應(unfolded protein response,UPR)[3]。ERS作為自噬的潛在誘因，能夠代償性誘導自噬，以清除積累的錯誤折疊的蛋白質[4]。近年來的多項研究發(fā)現(xiàn)，ERS和自噬被激活，且在MuSCs介導的肌源性再生過程中發(fā)揮重要的調控作用，對損傷后功能性肌肉的再生修復至關重要。本文主要針對近年來ERS和自噬在骨骼肌再生中的作用及研究進展做一綜述。

1 MuSCs是骨骼肌肌再生的基礎

骨骼肌損傷后的再生過程可分為三個階段：①伴隨著大量MuSCs激活、增殖的炎癥階段；②伴隨著成肌細胞分化、融合形成大量多核肌管的再生階段；③伴隨著再生肌纖維成熟的重塑階段[5]。骨骼肌損傷早期經(jīng)歷炎癥反應，纖維結構被破壞，出現(xiàn)大量壞死以及炎性因子和炎性細胞浸潤。肌再生依賴于MuSCs的激活和增殖，隨后成肌細胞分化并最終融合為多核肌管。在肌再生后期重塑階段，肌管經(jīng)歷肥大和重塑后生成成熟的肌纖維并恢復其收縮能力，對肌肉功能的完全恢復至關重要。

MuSCs介導的肌再生由一系列轉錄因子的順序表達調控[6]。配對盒轉錄因子(paired box gene 7,Pax7)在靜息狀態(tài)下的MuSCs中表達，在維持MuSCs池自我更新以及防止細胞早熟分化中發(fā)揮關鍵作用[7]。肌源性調控因子(myogenic regulatory factors,MRFs)由肌源性分化因子(myogenic differentiation factor,MyoD)、肌源性因子5(myogenic factor 5,Myf5)、肌源性調控因子4(myogenic regulatory factors 4,MRF4)和肌生成素(myogenin，MyoG)組成，在肌肉發(fā)育和再生過程中發(fā)揮重要作用[8]。骨骼肌損傷后，大多數(shù)MuSCs激活后迅速增殖并成為成肌細胞，誘導Myf5和MyoD的表達，啟動肌源性再生程序。在肌源性分化過程中，Pax7的表達下調，同時MyoG和MRF4的表達增加。最后，成肌細胞融合形成多核肌管，成肌細胞/肌管再與殘存的肌纖維融合，成肌細胞/肌管之間也相互融合以修復受損的肌纖維。成肌細胞在經(jīng)歷分化遷移融合形成多核肌纖維的過程中，MyoD的表達下調，肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain,MyHC)開始表達。MyHC作為骨骼肌中一種重要的骨架蛋白，是肌纖維形成的標志蛋白[9]。此外，一小部分MuSCs在激活后保持自我更新并返回靜息狀態(tài)，保留了衛(wèi)星干細胞的特征，進行緩慢分裂以維持MuSCs池[10]。在肌源性再生過程中，不同MRFs之間的相互協(xié)調決定了MuSCs的狀態(tài)和命運。

2 ERS調控肌再生

在多種生理病理條件下，如Ca2+失衡、炎癥、氧化應激、葡萄糖缺乏或缺氧，ER穩(wěn)態(tài)會被破壞，導致未折疊/錯誤折疊蛋白質在ER腔內堆積，從而引起ERS。為了緩解ERS并恢復蛋白質穩(wěn)態(tài)，細胞啟動UPR[3]。UPR由3個信號分支組成，分別由3種ER跨膜蛋白啟動：需肌醇酶1α(inositol-requiring enzyme 1α,IRE1α)、蛋白激酶R樣ER激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)以及激活轉錄因子6(activating transcription factor 6,ATF6)[3]。在非應激狀態(tài)下，這些蛋白通過與一種重要的ER分子伴侶，免疫球蛋白重鏈結合蛋白/葡萄糖調節(jié)蛋白78(immunoglobulin heavy chain binding protein/glucose-regulated protein 78,BiP/GRP78)結合而保持在相對不活躍的狀態(tài)。當ER管腔內由于錯誤折疊/未折疊蛋白質堆積而處于應激狀態(tài)時，GRP78優(yōu)先與錯誤折疊的蛋白質結合而與3種ER跨膜蛋白分離，導致3種跨膜蛋白寡聚狀態(tài)發(fā)生變化而磷酸化激活。激活的3種跨膜蛋白進而級聯(lián)激活下游信號通路，增加ER分子伴侶的表達，并降低蛋白質整體翻譯水平，以緩解ERS并恢復細胞穩(wěn)態(tài)[11]。

已發(fā)表的研究表明，ERS誘導的UPR途徑在骨骼肌再生過程中發(fā)揮重要的調控作用。在成肌細胞分化過程中，ERS介導分化不全的成肌細胞選擇性凋亡，有助于存活的成肌細胞更好的分化形成肌管。此外，PERK和IRE1α信號分支上的相關蛋白通過正向或負向調控肌源性再生中相關因子的轉錄，在骨骼肌再生過程中發(fā)揮著重要的調控作用。

2.1 ERS誘導分化不全成肌細胞選擇性凋亡 成肌細胞分化過程中伴隨著分化不全的成肌細胞的選擇性凋亡，這對骨骼肌再生是必須的。在肌源性分化過程中UPR的ATF6分支以及caspase-12的活性增加，介導易受應激影響的成肌細胞選擇性凋亡，而抑制ATF6或caspase-12則減少成肌細胞凋亡并抑制多核肌管的形成[12]。ERS誘導劑衣霉素(tunicamycin)和毒胡蘿卜素(thapsigargin)誘導分化不全的成肌細胞選擇性凋亡，使得存活的細胞更有效地分化為功能性肌管，優(yōu)化骨骼肌再生[13]。Wei等[14]研究發(fā)現(xiàn)， miR-181a-5p能夠激活ERS誘導的凋亡信號并促進肌源性分化，同時，thapsigargin也能夠通過上調miR-181a-5p的表達水平，促進成肌細胞分化。

2.2 PERK信號分支調控肌再生 內質網(wǎng)應激發(fā)生時，激活的PERK磷酸化真核翻譯起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α,eIF2α)，促進激活轉錄因子4(activating transcription factor 4,ATF4)翻譯，增加ER分子伴侶的表達，緩解ERS[15]。ERS過于嚴重時，ATF4則誘導C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP/DDIT3)轉錄上調，促進細胞凋亡[16]。Wang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，低強度體外沖擊波通過激活UPR的PERK/eIF2α分支能夠促進L6大鼠成肌細胞形成肌管，而PERK抑制劑GSK2656157則抑制了肌管的形成。最近的一項研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠成肌細胞分化過程中，PERK/eIF2α/ATF4信號通路瞬時激活，而敲除PERK或使用GSK2606414可降低MyoD的轉錄和翻譯水平，導致成肌細胞在誘導分化后保持未分化，甚至呈現(xiàn)圓形形態(tài)，表明UPR的PERK信號分支是肌再生的關鍵因素[18]。Xiong等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在氯化鋇誘導小鼠骨骼肌損傷后，MuSCs中PERK、IRE1α以及ATF4的mRNA水平升高，而敲除PERK抑制肌損后的再生修復，表現(xiàn)為MyoD、myogenin的表達減少、新生肌纖維數(shù)量和大小減少以及肌肉質量減少，表明PERK對肌損后再生修復至關重要。

PERK信號分支對肌再生似乎有雙重調控作用。早期的一項研究表明，在小鼠成肌細胞分化過程中，p-PERK和p-eIF2α以及CHOP水平瞬時增加，CHOP的過表達通過直接抑制MyoD基因轉錄延遲了成肌細胞的分化；而敲低CHOP促進了成肌細胞的分化以及多核肌管的形成，表明CHOP的表達有助于維持衛(wèi)星細胞干性，而CHOP的下調是成肌細胞激活進入肌源性分化程序所必需的[20]。Zismanov等[21]研究發(fā)現(xiàn)，eIF2α在靜止MuSCs中為磷酸化狀態(tài)，在MuSCs被激活進入肌源性程序時則迅速去磷酸化。使用小分子化合物Sal003抑制eIF2α去磷酸化可促進體外培養(yǎng)過程中MuSCs的自我更新；而誘導eIF2α突變體eIF2αS51A(S51位點磷酸化缺陷)的表達導致MuSCs激活，伴隨著Myf5和MyoD的表達增加。該研究表明eIF2α的磷酸化是維持MuSCs靜息狀態(tài)所必需的，有助于MuSCs的自我更新，而eIF2α的去磷酸化是肌再生后期成肌細胞分化、融合形成多核肌管所必需的。Jheng等[22]研究也表明，eIF2α的磷酸化引起的翻譯衰減可能通過減少MyoD的表達使肌發(fā)生受損。

2.3 IRE1α信號分支調控肌再生 IRE1α具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和核糖核酸內切酶(RNase)雙酶活性，是啟動UPR最保守的信號傳感器[23]。在內質網(wǎng)應激期間，IRE1α通過二聚/寡聚和自磷酸化被激活，通過其RNase活性介導UPR的一個關鍵信號分支?；罨腎RE1α能夠促進X-box結合蛋白1(X-box-binding protein 1,XBP1)mRNA中26個堿基內含子特異性剪切。剪接的XBP1(Spliced XBP1,sXBP1)作為轉錄因子，增加多種ER分子伴侶的表達，從而驅動參與調節(jié)蛋白質折疊、分泌和ER相關降解(ER-associated degradation,ERAD)的主要UPR程序。此前，有報道稱MyoD和myogenin能夠調控XBP1的轉錄，表明XBP1和肌再生之間可能存在某種聯(lián)系[24]。Jheng等[22]研究表明，XBP1作為一種轉錄因子，能夠誘導肌再生相關蛋白的表達，調控肌管形成，在肌再生后期發(fā)揮重要作用。Tokutake等[25]研究發(fā)現(xiàn)，XBP1通過誘導細胞周期蛋白依賴性激酶5(cyclin-dependent kinase 5,CDK5)能夠調控肌源性轉錄因子MyoD和MRF4的表達，在成肌細胞分化過程中起著關鍵作用；成肌細胞中IRE1α和XBP1的敲除顯著抑制肌源性分化過程。最新的一項研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠成肌細胞分化過程中，p-IRE1α蛋白表達水平增加，而敲除IRE1α誘導肌生長抑制素(myostatin)表達上調，從而導致成肌細胞分化、融合形成多核肌管的過程受阻；而IRE1α的過表達通過下調Myostatin的表達有助于控制肌管肥大和重塑[26]。該研究還發(fā)現(xiàn)，在心肌毒素誘導的小鼠肌損后再生過程中，p-IRE1α、p-eIF2α和GRP78蛋白表達水平以及XBP1 mRNA剪接增加，而敲除IRE1α導致急性肌損后肌肉再生受損以及Myostatin信號增強，表明IRE1α可能通過下調Myostatin參與調控骨骼肌損傷后的再生修復。IRE1α驅動的轉錄因子XBP1也可能負性調控MyoD的表達而抑制肌源性分化過程。研究發(fā)現(xiàn)，sXBP1的過表達通過激活一種負調控MyoD活性的轉錄因子即肌肉，小腸和胃表達因子1(muscle,intestine and stomach expresion1,Mist1)，抑制肌源性分化過程，導致成肌細胞在誘導分化后形成的肌管較小[27]。

總之，UPR的PERK和IRE1α信號分支在肌再生中扮演著雙重角色，PERK和IRE1α信號分支上的相關蛋白可能通過正向或負向調控肌源性再生相關因子的轉錄促進或抑制肌再生。ERS相關轉錄因子能夠調控多種蛋白質的表達或者降解，導致ERS對肌再生的調控不是單一的、絕對的，因此探討ERS在肌再生中的具體作用還需要進行更加深入全面的研究。此外，目前有關ATF6信號分支在MuSCs功能和骨骼肌再生中作用的相關報道較少，還需要使用遺傳小鼠模型進行進一步深入研究。

3 自噬調控肌再生

自噬是細胞內一種重要的分解代謝途徑，通過清除細胞內受損蛋白質和/或細胞器或對細胞外各種應激作出反應，為細胞的重塑、再生和修復提供能量和必需原料，是細胞維持穩(wěn)態(tài)的一種重要機制[28]。自噬是一個多步驟的連續(xù)過程，包括吞噬泡(通常是雙層膜)成核、延伸、逐漸包裹需降解或清除的蛋白或細胞器等物質形成密閉的自噬體、并最終與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解內容物。自噬體清除后的副產(chǎn)物(核酸、氨基酸、脂肪酸)可作為細胞代謝所需能量來源、合成新的細胞成分或參與信號傳導[29]。近年來，越來越多的研究表明，自噬參與調控MuSCs介導的肌再生，在MuSCs的穩(wěn)態(tài)和功能的維持以及損傷后肌肉的再生修復中扮演著重要角色。

3.1 自噬調控MuSCs介導的肌再生 在多種類型干細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，自噬在干細胞靜止、激活、增殖、分化和自我更新中起關鍵作用[30]。有研究報道，隨年齡增長MuSCs自噬缺陷，導致受損蛋白質和功能障礙細胞器的堆積，并最終導致DNA損傷和衰老，以及MuSCs衰竭[31]。誘導C57小鼠MuSCs的自噬可以避免衰老過程中MuSCs內損傷的積累，改善MuSCs的功能，恢復其再生能力；而敲除年輕小鼠MuSCs中自噬相關基因7(autophagy-associated gene 7,ATG7)則會導致MuSCs快速進入衰老狀態(tài)，導致MuSCs的數(shù)量衰減以及功能障礙，從而導致肌肉再生缺陷。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是在能量應激情況下正向調控自噬的一種重要的激酶。在MuSCs的研究中發(fā)現(xiàn)，AMPK對MuSCs介導的肌再生至關重要[32-33]。細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子P27KIP1能夠響應AMPK而激活，參與調控自噬或凋亡，在應激條件下決定細胞命運[34]。White等[35]研究發(fā)現(xiàn)，AMPK/P27KIP1信號通路通過誘導自噬，對MuSCs的激活以及隨后的肌源性再生過程至關重要。衰老過程MuSCs中AMPK/P27KIP1信號通路受抑制，導致自噬和增殖的減少以及凋亡和衰老的增加，并最終導致MuSCs功能障礙；而AMPK或P27KIP1的遺傳或藥理學激活，能夠有效誘導自噬并恢復衰老過程MuSCs肌源性再生潛能。另一方面，有研究表明MuSCs激活、增殖時誘導自噬流，以滿足MuSCs激活過程中代謝能量需求，而抑制自噬導致能量產(chǎn)生不足，MuSCs活化延遲[36]。Fiacco等[37]研究發(fā)現(xiàn)，心肌毒素(cardiotoxin,CTX)誘導C57小鼠損傷后第5天MuSCs激活階段伴隨著自噬水平的增加，用雷帕霉素(rapamycin)激活自噬可以增強MuSCs的激活和增殖，而用3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)抑制自噬則導致MuSCs的激活和增殖受損，結果表明自噬對MuSCs的激活和增殖至關重要。預先存在的結構和信號蛋白以及細胞器的降解是成肌細胞分化和肌管成熟所必需的。McMillan等[38]研究發(fā)現(xiàn)，體外成肌細胞分化的過程中自噬水平增加，3-MA處理或敲除ATG7抑制自噬，導致成肌細胞分化受損，表明自噬可能參與肌再生并在肌源性分化過程中起促進作用。Baechler等[39]研究發(fā)現(xiàn)，在成肌細胞分化過程中，自噬保護成肌細胞免受氧化應激和線粒體損傷，對線粒體網(wǎng)絡重塑和肌再生至關重要。總之，這些研究表明自噬在MuSCs穩(wěn)態(tài)和功能的維持以及MuSCs介導的肌再生中發(fā)揮重要作用。

3.2 自噬促進肌損后再生修復 骨骼肌損傷模型中對自噬和肌再生的研究表明自噬在損傷后功能性肌肉的再生修復中發(fā)揮重要作用。Nichenko等[40]研究發(fā)現(xiàn)，CTX誘導肌肉損傷后14 d，肌再生和肌肉重塑的關鍵過渡期，自噬體組裝增強，而使用3-MA處理小鼠8周后再注射CTX造成肌肉損傷后發(fā)現(xiàn)，損傷后肌肉力量和線粒體功能恢復缺陷，表明自噬對損傷后功能性肌肉的再生修復以及功能失調線粒體的清除和重塑至關重要。Unc-51樣激酶1(Unc-51-like kinase 1,Ulk1)是在應激條件下啟動自噬所必需的激酶。Call等[41]研究發(fā)現(xiàn)，自噬相關蛋白在肌再生早期階段顯著、短暫的誘導，而自噬流在肌源性分化和肌再生晚期重塑階段增加，骨骼肌特異性敲除自噬啟動因子Ulk1，阻礙了肌肉損傷后力量的恢復。Fiacco等[37]研究也發(fā)現(xiàn)，在CTX造成的C57小鼠肌肉損傷模型早期代償性肌再生階段，自噬被激活，而3-MA抑制自噬則會阻礙肌肉的再生和修復，表現(xiàn)為受損5 d時更少、更小的新生肌纖維以及更強的炎性浸潤。在多種自噬相關基因中，ATG16L是自噬的關鍵成分，它與ATG12和ATG5組裝形成復合物，與吞噬泡融合并參與吞噬泡的延伸。Paolini等[42]研究發(fā)現(xiàn)，CTX誘導小鼠骨骼肌損傷后，與野生型小鼠相比，在損傷后3 d肌再生初始階段，ATG16L1小鼠(ATG16L基因表達減少但未缺失)受損肌纖維密度增加，在損傷后6 d肌再生晚期階段，ATG16L1小鼠新生肌纖維尺寸較小，表明ATG16L1小鼠損傷后再生修復受阻。You等[43]最近的研究發(fā)現(xiàn)，敲除ARHGEF3通過增強自噬促進小鼠肌肉損傷后的再生修復，而氯喹(chloroquine)抑制ARHGEF3敲除小鼠增強的自噬后，阻礙了敲除ARHGEF3誘導的肌損后肌肉質量和力量的增加?？傊@些研究表明自噬促進MuSCs介導的肌再生，對肌損后功能性肌肉的再生修復至關重要。

4 結語和展望

盡管在病理和生理過程中，ERS和自噬是細胞內相對獨立的調控機制，但它們之間能夠相互作用且有許多共同特征。在多種病理生理過程中，ERS誘導的UPR以及自噬能夠清除積累的錯誤折疊的蛋白質，緩解ER管腔壓力，是細胞維持穩(wěn)態(tài)的重要機制。在體外和體內骨骼肌再生過程的研究中發(fā)現(xiàn)，ERS和自噬被激活，且在MuSCs介導的肌源性再生過程中發(fā)揮重要的調控作用，對損傷后功能性肌肉的再生修復至關重要。然而在骨骼肌再生過程中ERS與自噬的相互作用尚不清楚，有待進一步深入探究。