視網(wǎng)膜類器官3D培養(yǎng)技術(shù)的研究進(jìn)展△

舒會(huì)葉 韋 芊 邵 毅

視網(wǎng)膜退行性疾病是一組以視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞和光感受器細(xì)胞進(jìn)行性減少為特征的不可逆性疾病。雖然目前臨床上暫無(wú)有效的治療方法，但有一些基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)表明細(xì)胞移植療法具有治療視網(wǎng)膜退行性疾病的潛力。細(xì)胞移植技術(shù)大多以視網(wǎng)膜原代細(xì)胞為供體進(jìn)行移植，在移植后通過(guò)替代或保護(hù)宿主失代償細(xì)胞起到改善視力的作用[1]。許多研究表明，在晚期視網(wǎng)膜退行性疾病移植治療中應(yīng)用早期有絲分裂后的感光細(xì)胞效果最好[2]。由于人供體細(xì)胞通常來(lái)源于 2～3個(gè)月齡胎兒，并且存在倫理及細(xì)胞來(lái)源不足等問(wèn)題，所以直接從人體中分離獲取這種感光細(xì)胞在臨床上是比較困難的[1]。這種感光細(xì)胞一般來(lái)源于新生小鼠視網(wǎng)膜。因此，體外獲得大量可供移植的感光細(xì)胞成為臨床應(yīng)用的必要前提。

多能干細(xì)胞擁有分化成各種細(xì)胞和大量擴(kuò)增的能力，通過(guò)3D培養(yǎng)技術(shù)可以高準(zhǔn)確度和高產(chǎn)量地產(chǎn)生特定類型的細(xì)胞(如肝、腎、腸、大腦等組織的細(xì)胞)。這種類器官培養(yǎng)技術(shù)可以為治療視網(wǎng)膜退行性疾病提供大量感光細(xì)胞。在過(guò)去的10多年中，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)人胚胎干細(xì)胞(hESCs)和人工誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(hiPSCs)具有逐步分化和產(chǎn)生前神經(jīng)組織和視網(wǎng)膜細(xì)胞的能力[3]。Mariani等[4]指出，3D培養(yǎng)技術(shù)為體外培養(yǎng)感光細(xì)胞帶來(lái)了希望，使視網(wǎng)膜類器官生產(chǎn)感光細(xì)胞的效率和穩(wěn)定性得到了極大地提高。本文就3D培養(yǎng)技術(shù)在視網(wǎng)膜類器官培養(yǎng)中的應(yīng)用、視網(wǎng)膜類器官移植存在的問(wèn)題、視網(wǎng)膜類器官與臨床應(yīng)用的距離等展開(kāi)綜述。

1 3D培養(yǎng)技術(shù)在視網(wǎng)膜類器官培養(yǎng)中的應(yīng)用

1.1 小鼠胚胎干細(xì)胞來(lái)源的視網(wǎng)膜類器官研究表明，小鼠胚胎干細(xì)胞衍生來(lái)的視網(wǎng)膜組織具有類似于人類視網(wǎng)膜的頂端-基底極性[5]，頂端突起隨后內(nèi)陷，從而形成視杯。目前，從胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)自體3D視網(wǎng)膜類器官的方法多基于Yoshiki Sasai團(tuán)隊(duì)的方案：將鼠胚胎干細(xì)胞以每孔3000個(gè)接種于96孔板中使其形成胚狀體，并在無(wú)血清培養(yǎng)基中加入細(xì)胞外基質(zhì)使其形成連續(xù)的神經(jīng)上皮。在繼續(xù)培養(yǎng)1周以后，鼠胚胎干細(xì)胞可形成視泡樣結(jié)構(gòu)并表達(dá)Rx、Pax6等轉(zhuǎn)錄因子[6]。其中，60%的視泡樣結(jié)構(gòu)在前3 d向內(nèi)凹陷形成雙層細(xì)胞壁的視杯結(jié)構(gòu)，分離后可單獨(dú)發(fā)育成視網(wǎng)膜層——光感受器細(xì)胞層、外核層、內(nèi)核層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層。并且隨著類器官培養(yǎng)時(shí)間至數(shù)月時(shí)，可以產(chǎn)生多種細(xì)胞類型，包括感光細(xì)胞前體細(xì)胞以及包含外節(jié)的成熟感光細(xì)胞。Yoshiki Sasai及其同事開(kāi)創(chuàng)的方案是一種允許細(xì)胞自我組織形成視泡或視杯結(jié)構(gòu)的方案。

在體內(nèi)，從視泡到視杯的形成是由一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)系統(tǒng)調(diào)控的，如在鼠間腦外翻導(dǎo)致視泡形成后，視泡中可表達(dá)骨形態(tài)發(fā)生蛋白4、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8和Delta等信號(hào)因子，這些信號(hào)因子誘導(dǎo)表皮外胚葉的細(xì)胞分化為晶狀體板。而晶狀體板形成后分泌的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子反作用于視泡，誘導(dǎo)視泡表達(dá)Vsx2。Vsx2是視網(wǎng)膜形成的必需因子。同時(shí)，晶狀體板與其對(duì)應(yīng)區(qū)域的視泡遠(yuǎn)端部分同時(shí)內(nèi)陷，最終其內(nèi)部發(fā)育成視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層，外部發(fā)育成RPE層[7]。但是在實(shí)際培養(yǎng)中，通過(guò)體外培養(yǎng)得到的視網(wǎng)膜類器官雖然能表達(dá)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，但不具有外胚層。因此，體外培養(yǎng)獲得的視泡內(nèi)陷會(huì)受阻，最終無(wú)法發(fā)育成視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層。這一現(xiàn)象說(shuō)明視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層的發(fā)育可能是相對(duì)獨(dú)立的。

3D培養(yǎng)技術(shù)首次提供了在體外生產(chǎn)大量視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的可行性，這在2D培養(yǎng)技術(shù)中是無(wú)法實(shí)現(xiàn)的[8]。Yoshiki Sasai的方案雖然打破了2D培養(yǎng)技術(shù)的瓶頸，但是由于不同多能干細(xì)胞系之間存在的高度異質(zhì)性限制了其應(yīng)用。視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞都是視網(wǎng)膜中捕獲光信號(hào)的重要組成部分。有研究在Yoshiki Sasai方案的基礎(chǔ)上通過(guò)增加可移植光感受器的數(shù)量對(duì)培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了調(diào)整。他們通過(guò)模擬延長(zhǎng)視網(wǎng)膜組織在母體器官內(nèi)的生長(zhǎng)時(shí)間以獲得更多的視桿細(xì)胞[9]。與此同時(shí)，有學(xué)者使用類似方法培養(yǎng)了視網(wǎng)膜類器官，并對(duì)視桿細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，然后將其移植到有視網(wǎng)膜退行性疾病的小鼠模型上。經(jīng)定量分析發(fā)現(xiàn)，在移植后10 d時(shí)，盡管沒(méi)有形成視泡或視杯結(jié)構(gòu)，但是已經(jīng)出現(xiàn)了神經(jīng)上皮并有具有分層結(jié)構(gòu)的細(xì)胞向各層視網(wǎng)膜遷移發(fā)育。因此，經(jīng)典的Yoshiki Sasai方案中分離視杯有可能會(huì)導(dǎo)致潛在感光細(xì)胞的損失。此后，還有學(xué)者對(duì)培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了調(diào)整，其選擇在10 d將視網(wǎng)膜類器官平均分成三等分后繼續(xù)培養(yǎng)，并且在不同發(fā)育階段，即移植后的12～14 d和16～18 d，抑制DAPT的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而達(dá)到分別使視錐和視桿細(xì)胞生成增多的效果。另外，一些研究發(fā)現(xiàn)在視網(wǎng)膜類器官發(fā)育的不同階段，適當(dāng)?shù)靥砑訝I(yíng)養(yǎng)和增高氧濃度也可以提高感光細(xì)胞的存活率[10]。總之，視網(wǎng)膜類器官3D培養(yǎng)技術(shù)的引入，為人們了解視網(wǎng)膜正常發(fā)育和變性過(guò)程提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1.2 人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的視網(wǎng)膜類器官小鼠胚胎干細(xì)胞分化成視網(wǎng)膜類器官的3D培養(yǎng)技術(shù)為使用hESCs和hiPSCs生產(chǎn)視網(wǎng)膜類器官細(xì)胞提供了更多的可能性。為進(jìn)一步探索hESCs用于視網(wǎng)膜分化方案的可行性，Yoshiki Sasai團(tuán)隊(duì)在2012年提供了一種從人類胚胎干細(xì)胞3D轉(zhuǎn)分化視網(wǎng)膜組織的方案。該方案可生成典型的三層視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)，包含視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和光感受器[11]。哺乳動(dòng)物的眼球是在發(fā)育過(guò)程中間腦外翻而產(chǎn)生的，發(fā)育需要協(xié)同抑制特定的信號(hào)通路如Wnt/BMP通路等，同時(shí)激活特定通路如IGF通路等。所以，這一方案的主要特征是在快速聚集的胚胎干細(xì)胞中加入基質(zhì)膠，并及時(shí)添加Hedgehog激動(dòng)劑和Wnt激動(dòng)劑以實(shí)現(xiàn)包含視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層和RPE層的視杯的形成。這是目前唯一一個(gè)可以形成雙層視杯結(jié)構(gòu)的方案。研究顯示，Wnt/catenin信號(hào)通路對(duì)形成RPE層相關(guān)基因(包括MitF和Otx2)的調(diào)節(jié)十分重要[12]，70%的細(xì)胞在移植后18 d有Wnt/catenin信號(hào)通路的激活，隨后表達(dá)感光標(biāo)記蛋白如視蛋白、視桿和視錐細(xì)胞特異性蛋白等。如今已有研究團(tuán)隊(duì)將這一方案的改良版應(yīng)用于臨床研究，并取得了一定的進(jìn)展[13]。

此外，還有其他學(xué)者也提出了能將人類胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為視網(wǎng)膜組織細(xì)胞的新方法。該方案將細(xì)胞在漂浮條件下用神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后發(fā)育成柱狀的神經(jīng)上皮。隨后觀察并檢測(cè)移植后神經(jīng)上皮的情況，研究發(fā)現(xiàn)，在移植后6 d即可檢測(cè)到視覺(jué)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄物(Rx、Six3、Six6、Lhx2、Otx2和Pax6等)的生成；在移植后10 d時(shí)超過(guò)90%的細(xì)胞是Pax6/Rx表達(dá)雙陽(yáng)性，同時(shí)DKK-1和noggin等視覺(jué)相關(guān)蛋白表達(dá)都上調(diào)；在移植后25 d時(shí)可明顯區(qū)分視泡樣視網(wǎng)膜神經(jīng)球和前腦神經(jīng)球結(jié)構(gòu)。此外，有約17%血源性hiPSCs經(jīng)此方案誘導(dǎo)產(chǎn)生的視泡顯示出一定程度的分層，可觀察到視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞在最內(nèi)層，光感受器樣細(xì)胞在最外層[14]。隨著研究的深入，此方案被繼續(xù)改進(jìn)。在改進(jìn)方案中，細(xì)胞貼壁在基質(zhì)膠包被后的孔板上，添加胎牛血清、維甲酸和?；撬峥纱龠M(jìn)光感受器細(xì)胞的分化。研究發(fā)現(xiàn)，在移植后21～28 d視網(wǎng)膜中Chx10表達(dá)陽(yáng)性視網(wǎng)膜祖細(xì)胞比例可高達(dá)70%；在移植后5 周可觀察到視網(wǎng)膜生成，同時(shí)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞Brn3蛋白陽(yáng)性表達(dá)；移植后22周左右，出現(xiàn)Chx10表達(dá)陽(yáng)性的雙極細(xì)胞[15]。添加維甲酸的培養(yǎng)基促進(jìn)了光感受器細(xì)胞的發(fā)育和成熟，產(chǎn)生了更多的Rho、S-視蛋白和L/M-視蛋白表達(dá)陽(yáng)性的光感受器細(xì)胞，同時(shí)這些光感受器細(xì)胞也表達(dá)其他視覺(jué)相關(guān)蛋白[16]。

3D培養(yǎng)技術(shù)的引入極大地增加了人視網(wǎng)膜組織和人光感受器細(xì)胞的獲取途徑，但分化過(guò)程的異質(zhì)性和漫長(zhǎng)的培養(yǎng)周期仍是問(wèn)題。多能干細(xì)胞具有無(wú)方向聚集的特點(diǎn)，這一特點(diǎn)是導(dǎo)致分化過(guò)程中出現(xiàn)異質(zhì)性的主要原因之一[17]。因此，一些實(shí)驗(yàn)室開(kāi)始在聚集成團(tuán)的培養(yǎng)物中分化hESCs，將其中小塊的hESCs放置在基質(zhì)膠中，5 d內(nèi)可以形成包含單個(gè)腔和頂端-基底端極性結(jié)構(gòu)的神經(jīng)上皮組織[18]。這種改良方案能強(qiáng)有力地誘導(dǎo)細(xì)胞分化成為視網(wǎng)膜組織細(xì)胞，能在不需要選擇和分離色素集落的情況下產(chǎn)生RPE細(xì)胞，并有效形成包含分層的視網(wǎng)膜組織，但是這一方案目前仍缺乏足夠的定量分析證據(jù)。

基于人多能胚胎干細(xì)胞(hPSCs)的視網(wǎng)膜分化方案的出現(xiàn)為發(fā)育研究、疾病模型以及臨床應(yīng)用提供了更切合實(shí)際的方法[19]。此方案一方面催生了更多關(guān)于早期人類視網(wǎng)膜細(xì)胞形成過(guò)程的研究，另一方面使得探究早期視網(wǎng)膜發(fā)育過(guò)程中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的作用和在體外模擬跟蹤視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生發(fā)展變得更加容易[20]。視網(wǎng)膜類器官技術(shù)可以產(chǎn)生大量臨床相關(guān)的視網(wǎng)膜細(xì)胞群用于移植或高通量篩選。視網(wǎng)膜類器官細(xì)胞中未分化的細(xì)胞極少，避免了多輪細(xì)胞分選，降低了移植后畸胎瘤形成的可能性[21]。另外，利用生物反應(yīng)器增加類器官細(xì)胞適應(yīng)性可大量增加其產(chǎn)出，在不久的將來(lái)完全可以滿足基于細(xì)胞治療或藥物篩選對(duì)高細(xì)胞數(shù)的要求。然而，視網(wǎng)膜類器官在多大程度上再現(xiàn)了體內(nèi)發(fā)育，以及視網(wǎng)膜疾病是否可以在體外完全模擬仍需進(jìn)一步評(píng)估。

1.3 鼠源和人源視網(wǎng)膜類器官的差異由小鼠和人類胚胎干細(xì)胞分化成視網(wǎng)膜祖細(xì)胞需要的條件不同，小鼠胚胎干細(xì)胞來(lái)源于囊胚內(nèi)的細(xì)胞團(tuán)，而人類胚胎干細(xì)胞來(lái)源于稍晚的外胚形成階段[22]。與鼠源胚胎干細(xì)胞不同，人源胚胎干細(xì)胞的再聚集是緩慢且不完全的，這一特點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致各部分分化效率不同[23]。同時(shí)人源胚胎干細(xì)胞分化需要更高濃度的血清，在體外視網(wǎng)膜分化過(guò)程中，人類胚胎干細(xì)胞衍生的視網(wǎng)膜類器官細(xì)胞在形態(tài)上需要更長(zhǎng)的發(fā)育時(shí)間[24]。在視網(wǎng)膜分化和成熟的后期，物種差異則更明顯。人類體內(nèi)視網(wǎng)膜發(fā)生始于視網(wǎng)膜中央凹的位置，密集地填充著小鼠視網(wǎng)膜中不存在的視錐細(xì)胞，然后在數(shù)周或數(shù)月后擴(kuò)散穿過(guò)視網(wǎng)膜到達(dá)視網(wǎng)膜邊緣。因此中心區(qū)域發(fā)育良好后，周邊區(qū)域的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞可能剛剛結(jié)束細(xì)胞分裂周期。目前尚不清楚人類視網(wǎng)膜類器官是否能夠在體外重現(xiàn)視網(wǎng)膜中央凹的形成，且與鼠源相比，人源視網(wǎng)膜類器官中視錐細(xì)胞比例更高[25]。實(shí)際上，由于視錐細(xì)胞對(duì)人類視覺(jué)的重要性，已有不少研究嘗試增加視錐細(xì)胞在鼠源類器官組織中的占比，例如在不同的發(fā)育階段抑制Notch信號(hào)從而增加視錐細(xì)胞的數(shù)量?？傊?，盡管視網(wǎng)膜類器官細(xì)胞的培養(yǎng)依靠相同的原理，但是物種差異的存在使得異種動(dòng)物的研究成果無(wú)法及時(shí)轉(zhuǎn)化。不過(guò)由于培養(yǎng)時(shí)間顯著縮短，小鼠視網(wǎng)膜類器官細(xì)胞在基礎(chǔ)研究中仍然是研究哺乳動(dòng)物類器官發(fā)育有價(jià)值的替代工具[26]。

2 視網(wǎng)膜類器官移植存在的問(wèn)題

有效穩(wěn)定的細(xì)胞來(lái)源、移植后細(xì)胞能夠長(zhǎng)期存活、能夠?qū)崿F(xiàn)體內(nèi)成熟、恢復(fù)與現(xiàn)有視網(wǎng)膜通路的連接以及喪失的視覺(jué)功能，是光感受器細(xì)胞移植成為治療視網(wǎng)膜退行性疾病的必要條件[27]。盡管過(guò)去數(shù)年間的研究使得光感受器類器官移植離臨床應(yīng)用更進(jìn)一步，但仍有些條件尚未被完全滿足。用原代小鼠視桿細(xì)胞進(jìn)行的研究開(kāi)創(chuàng)了光感受器細(xì)胞移植的新方法，在視桿細(xì)胞生成的高峰期從視網(wǎng)膜類器官中分離出供體細(xì)胞時(shí)，可獲得最佳的移植效果。在首次使用鼠胚胎干細(xì)胞的研究中也觀察到了供體細(xì)胞年齡和分化階段對(duì)移植成功率的影響，證實(shí)了移植光感受器前體可以提高移植成功率。根據(jù)觀察，移植發(fā)育早期的移植物更容易形成完整的移植后組織結(jié)構(gòu)，同時(shí)流式細(xì)胞儀分選技術(shù)也證明了這一點(diǎn)。但是，需要注意的是將光感受器移植到仍然含有內(nèi)源性光感受器的視網(wǎng)膜后，移植物和宿主之間發(fā)生了包括熒光報(bào)告蛋白在內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)交換[28]，這對(duì)應(yīng)用流式細(xì)胞分選技術(shù)判斷移植成功率的準(zhǔn)確性提出了質(zhì)疑，目前還需要尋找更準(zhǔn)確的方法進(jìn)行評(píng)估。

供體光感受器和宿主神經(jīng)元之間建立突觸聯(lián)系是移植成功的一大基本特征。通過(guò)檢測(cè)供體光感受器和宿主二級(jí)神經(jīng)元突觸前和突觸后終末的突觸蛋白以及通過(guò)微電極陣列和視覺(jué)行為學(xué)測(cè)試評(píng)估在移植區(qū)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞水平可以記錄到光響應(yīng)信號(hào)，這說(shuō)明供體光感受器和宿主神經(jīng)元之間可以建立突觸聯(lián)系[29]。但是，在臨床前視網(wǎng)膜退行性疾病動(dòng)物模型中評(píng)估人體光感受器細(xì)胞的功能，仍然需要建立更有說(shuō)服力的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)證明人體光感受器細(xì)胞和小鼠二級(jí)神經(jīng)元之間存在正確的突觸連接。

視網(wǎng)膜處于免疫赦免狀態(tài)，但是在臨床前動(dòng)物模型中使用人光感受器細(xì)胞時(shí)，炎癥仍可能對(duì)移植物的存活和繼續(xù)分化成熟產(chǎn)生重要影響[30]。研究發(fā)現(xiàn)，將hESC來(lái)源的視網(wǎng)膜細(xì)胞移植到IL2RG缺乏的免疫缺陷鼠中或使用免疫抑制劑可以得到更高的移植存活率和更佳的整合效果。為了充分了解免疫系統(tǒng)在光感受器細(xì)胞移植中的作用，需要進(jìn)行更多的系統(tǒng)研究，這些研究將對(duì)臨床應(yīng)用意義重大。

3 視網(wǎng)膜類器官與臨床應(yīng)用的距離

如今，有幾種專為視網(wǎng)膜退行性疾病量身定做的治療方法正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。1997年，學(xué)者們進(jìn)行了首例人光感受器細(xì)胞移植的研究，當(dāng)時(shí)兩名患有晚期視網(wǎng)膜色素變性的失明患者接受了從成人眼中獲得的明膠包裹的光感受器細(xì)胞薄片。在移植后12 個(gè)月未出現(xiàn)視力改善，但也沒(méi)有出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)。1999年，首次報(bào)道視網(wǎng)膜色素變性患者接受胎兒的視網(wǎng)膜移植后視力改善且無(wú)免疫排斥反應(yīng)[31]。然而，由于胎兒視網(wǎng)膜的可獲得性極低，這類研究樣本量極少。因此，使用hESCs和hPSCs培養(yǎng)視網(wǎng)膜細(xì)胞以及生成RPE和光感受器細(xì)胞的相關(guān)研究為克服供體視網(wǎng)膜組織數(shù)量限制提供了解決方案。

事實(shí)上，由hPSCs和hESCs高效生成RPE的方案已經(jīng)在Stargardt病和老年黃斑變性患者中啟動(dòng)了第一批臨床試驗(yàn)，MA09-hRPE細(xì)胞系是第一個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的細(xì)胞系。由于hESCs是在絲裂霉素C處理的成纖維細(xì)胞上擴(kuò)增的，因此由其生成的人RPE細(xì)胞被認(rèn)為是異種移植產(chǎn)品。這些用于治療視網(wǎng)膜退行性疾病的開(kāi)創(chuàng)性細(xì)胞移植療法試驗(yàn)結(jié)果表明，由多能干細(xì)胞衍生來(lái)的RPE細(xì)胞移植是安全的，無(wú)重大副作用，而且移植后能夠避免患者視力進(jìn)一步損失。針對(duì)特定患者的個(gè)性化多能干細(xì)胞方案將是避免移植細(xì)胞免疫排斥的理想選擇，然而它們可能需要使用CRISPR/Cas9等基因編輯工具進(jìn)行基因改造，以敲除致病突變防止反復(fù)發(fā)病[32]。雖然這樣做增加了治療成本，但干細(xì)胞可以大量擴(kuò)增和分化，一個(gè)細(xì)胞系可以用于多個(gè)患者。

多能干細(xì)胞衍生的光感受器類器官已經(jīng)邁出臨床應(yīng)用的第一步?，F(xiàn)存挑戰(zhàn)除了細(xì)胞系和隨代數(shù)變化的高度異質(zhì)性之外，還有生產(chǎn)包含光感受器細(xì)胞的3D視網(wǎng)膜類器官繁瑣的人工操作步驟(例如上述的神經(jīng)視網(wǎng)膜/視杯分離)。此外，最重要的是要在移植前從異質(zhì)視網(wǎng)膜器官中富集得到人類視錐細(xì)胞和視桿細(xì)胞前體，以提高移植成功率和增加手術(shù)的安全性，從而排除治療后患者畸胎瘤的形成。

4 前景及展望

人類胚胎干細(xì)胞或人工誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞可以為臨床應(yīng)用提供足夠的人源視網(wǎng)膜細(xì)胞，還能為研究人類相關(guān)發(fā)育和疾病提供更多思路和手段。隨著視網(wǎng)膜類器官3D培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，在體外產(chǎn)生視網(wǎng)膜組織的技術(shù)已經(jīng)越來(lái)越成熟，并且還在不停地發(fā)展完善中。事實(shí)上，視網(wǎng)膜類器官3D培養(yǎng)技術(shù)是目前最先進(jìn)的體外大量生產(chǎn)光感受器細(xì)胞技術(shù)，而視網(wǎng)膜類器官3D培養(yǎng)技術(shù)的使用進(jìn)一步提高了用于研究特定靶組織和細(xì)胞分化及成熟的體外模型建模的成功率。然而，細(xì)胞系之間的高度異質(zhì)性、冗長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間以及費(fèi)時(shí)費(fèi)力的程序，還有缺少純化特定光感受器亞型的分選技術(shù)，限制了人類視網(wǎng)膜類器官在臨床應(yīng)用中的開(kāi)展。如果能夠克服這些挑戰(zhàn)，視網(wǎng)膜類器官3D培養(yǎng)技術(shù)將成為治療目前無(wú)法治愈的視網(wǎng)膜退行性疾病的重要手段。