長牡蠣繁殖期糖原含量與類胰島素基因表達(dá)的相關(guān)性分析

苗校靜, 鄧少熙, 李良恒, 許 飛, 3

長牡蠣繁殖期糖原含量與類胰島素基因表達(dá)的相關(guān)性分析

苗校靜1, 2, 鄧少熙1, 2, 李良恒1, 許 飛1, 3

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 3. 中國科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心, 山東 青島 266071)

為探究長牡蠣在繁殖期間的糖原含量與類胰島素基因(、、、)和相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子()相對表達(dá)量的相關(guān)性, 自2020年5月至2020年10月采集了山東膠南養(yǎng)殖海區(qū)的長牡蠣, 測定了血糖含量、糖原含量、條件指數(shù)、類胰島素基因相對表達(dá)量及環(huán)境因子(酸度、溫度、鹽度)等數(shù)據(jù), 采用多元統(tǒng)計方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。logistic回歸分析結(jié)果顯示, 長牡蠣配子排放前后血糖含量和內(nèi)臟團(tuán)糖原含量具有顯著差異。構(gòu)建的回歸模型可以通過血糖含量和內(nèi)臟團(tuán)糖原含量準(zhǔn)確判斷配子是否已經(jīng)排放, 區(qū)分度C-index為0.903, Hosmer-Lemeshow擬合優(yōu)度檢驗(yàn)2值為9.06,>0.05, 驗(yàn)證結(jié)果顯示該模型可靠。多元線性回歸分析結(jié)果顯示: 條件指數(shù)與cgMIP123和cgMIP4基因的相對表達(dá)量具有相關(guān)性,2為0.91,值為0.007 6, 極顯著相關(guān); 內(nèi)臟團(tuán)和唇瓣組織的糖原含量與和相對表達(dá)量具有一定的相關(guān)性, 其中的相對表達(dá)量與內(nèi)臟團(tuán)和唇瓣組織的糖原含量呈負(fù)相關(guān),相對表達(dá)量與唇瓣組織的糖原含量呈負(fù)相關(guān),和的相對表達(dá)量與糖原含量呈正相關(guān)。

長牡蠣; 血糖; 類胰島素; 胰十二指腸同源異型盒基因; 多元統(tǒng)計

類胰島素超家族是動物中一個古老的基因家族[1-2]。在脊椎動物中主要包括胰島素(insulin, INS)、類胰島素生長因子(insulin-like growth factor, IGF)、松弛素(relaxin, RLN)和脊椎動物類胰島素(insulin-like peptide, INSL)。其中INS和IGF屬于insulin/IGF家族, 主要參與生長發(fā)育、葡萄糖穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié), 這些蛋白質(zhì)的受體為酪氨酸激酶受體。RLN和INSL屬于類松弛素家族, 主要參與生殖和神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)節(jié), 受體為G蛋白偶聯(lián)受體。無脊椎動物類胰島素多具有門類特異性, 比如家蠶素(bombyxin)[3], 貝類類胰島素多肽(molluscan insulin-related peptides, MIP)[4], 線蟲類胰島素多肽(caenorhabditis elegans insulin-like peptides, INS)[5]等, 由于無脊椎動物門類多樣性豐富, 基因在物種形成過程中多發(fā)生復(fù)制和功能分化, 相關(guān)功能尚缺乏系統(tǒng)研究, 推測這些基因在無脊椎動物中也主要參與生長發(fā)育、生殖和碳水化合物穩(wěn)態(tài)等過程[6-8]。

在長牡蠣基因組中共鑒定到4個類胰島素基因:、、和[9]。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示cgMIP123和cgMIP4屬于貝類類胰島素多肽MIP; cgMILP7與果蠅的DILP7同源性高, 推測可能具有類似relaxin的功能; cgILP與人類的胰島素和IGF同源性較高。氨基酸序列分析將cgMIP123、cgMIP4、cgMILP7劃分為β型, 冠輪動物的大多數(shù)ILPs均屬于該類型。而cgILP則為γ型, 該類型的類胰島素基因在脊索動物、扁形動物、輻射對稱動物、海綿等廣泛分布[9]。表達(dá)模式分析表明在肝胰腺和內(nèi)臟神經(jīng)節(jié)中表達(dá);主要在幼蟲發(fā)育時期表達(dá), 在成體中的表達(dá)量很低;在肝胰腺中高度表達(dá)。2002年Hamano等報道的長牡蠣oIRP即為cgMIP123, 其基因的季節(jié)性表達(dá)峰值與長牡蠣軟體部生長和配子發(fā)育期相對應(yīng)(3—5月), 但與糖原積累期(10—11月)不重疊[10-11]。該基因的一些SNP位點(diǎn)與長牡蠣體尺性狀和軟體部重量等具有顯著關(guān)聯(lián)性[12]。目前關(guān)于cgMIP4、cgMILP7和cgILP的功能分析尚欠缺。

本研究對自然海區(qū)生長的長牡蠣進(jìn)行調(diào)查, 獲得血糖、糖原含量、條件指數(shù)、類胰島素基因相對表達(dá)量及環(huán)境因子(酸度、溫度、鹽度、葉綠素含量)等數(shù)據(jù)。并通過logistic回歸分析、多元線性回歸分析等多元統(tǒng)計方法探究其相關(guān)性, 以期為解析長牡蠣類胰島素基因功能及糖原物質(zhì)積累的調(diào)控機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

所用實(shí)驗(yàn)動物為來自同一個養(yǎng)殖群體的二齡牡蠣, 處理為單體后集中掛養(yǎng)于山東省青島市膠南山東頭養(yǎng)殖海區(qū)。2020年5月至2020年10月每月隨機(jī)取回100個左右, 現(xiàn)場測定海水的溫度、鹽度、酸度(以pH計量), 同時收集養(yǎng)殖海域水樣用于葉綠素含量的測定。實(shí)際采樣時間見表1。

表1 2020年采樣時間表

1.2 樣品處理

長牡蠣在水族室暫養(yǎng)一晚后, 即進(jìn)行組織樣品采集。隨機(jī)挑選30個無寄居蟹等狀況的健康牡蠣用于測定血糖、糖原含量及基因相對表達(dá)量。取樣均在冰上進(jìn)行低溫操作。長牡蠣開殼后, 用注射器吸取血淋巴(hemolymph, Hem), 離心后取上清凍存, 用于血糖含量測定; 取唇瓣(labial Palps, L)、內(nèi)臟團(tuán)(統(tǒng)一取中腸所在的幽門凸起部位pyloric process, P)、透明閉殼肌(transparent adductor muscle, T)剪碎后儲存于強(qiáng)堿溶液中, 用于糖原含量的測定; 取臟神經(jīng)節(jié)(visceral ganglion, VG)、肝胰腺組織(hepatopancreas, Hep)[13]于Trizol中–20 ℃凍存, 用于后續(xù)基因相對表達(dá)量的測定, 每3個個體混合為一個樣品。同時隨機(jī)挑選20個健康長牡蠣, 清理貝殼后記錄總重, 將軟體部放入55 ℃烘箱烘干72 h, 稱量其干重。

葉綠素樣本的獲取: 用20 μm篩絹過濾海水除去大型浮游動植物, 取0.5 L海水經(jīng)5 μm濾膜抽濾, 獲取濾膜后吸干多余水分并避光暫存于放有冰袋的樣品箱中, 運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)移至–80 ℃冰箱。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)時熒光定量PCR

肝胰腺、神經(jīng)組織采用Trizol法提取總RNA, 測定濃度及凝膠電泳檢測質(zhì)量后進(jìn)行去除基因組DNA的反轉(zhuǎn)錄(艾科瑞 AG11711)。實(shí)時熒光定量PCR采用諾唯贊(Q711-02)試劑盒在QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System(ThermoFisher, USA)上進(jìn)行。以為內(nèi)參基因, 以5月20日樣品作為對照組, 各基因的相對表達(dá)量計算公式參考相關(guān)文獻(xiàn)[14]。實(shí)驗(yàn)所用的引物信息見表2。

表2 引物序列

1.3.2 血糖、糖原含量、條件指數(shù)及葉綠素含量的測定

血糖、糖原含量的測定分別采用SIGMA (GAGO20)和南京建成試劑盒(F006)并按照說明書進(jìn)行操作。條件指數(shù)(condition index,C)是貝類軟體部生長和肥滿度的衡量指標(biāo), 有多種計算方法, 本研究以干質(zhì)量/總質(zhì)量表示[15]。葉綠素含量用90%丙酮萃取, 采用分光光度法測定。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用R語言(4.0.2)。

1.3.3.1 方差分析

采用非參數(shù)方差分析及Wilcoxon秩和檢驗(yàn)(用Benjamini & Hochberg方法對值進(jìn)行矯正)對血糖含量、糖原含量、條件指數(shù)、各基因相對表達(dá)量的各月份間差異進(jìn)行分析, 血糖、糖原含量、條件指數(shù)、基因相對表達(dá)量每周期的生物學(xué)重復(fù)依次為30、30、20、10。

1.3.3.2 logistic回歸分析

數(shù)據(jù)集的構(gòu)建: 采用5至7月觀測個體的性腺狀態(tài)(gonad condition,C,=94)進(jìn)行分析, 以布爾值表示性腺狀態(tài)(“0”為未排放, “1”為排放), 未排放個體0=32, 排放個體1=62。

表達(dá)式的構(gòu)建與驗(yàn)證:C與血糖()、閉殼肌(G)、內(nèi)臟團(tuán)(G)及唇瓣(G)糖原含量、性別()的關(guān)系表達(dá)式如下:

logit(C)～+G+G+G+, (1)

其中, logit(C)表示對C進(jìn)行l(wèi)ogit變換, 即ln[/(1–)],代表配子已排放這一事件發(fā)生的概率,/(1–)定義為配子排放的優(yōu)勢比。針對建模組采用逐步回歸法篩選出具有顯著貢獻(xiàn)的自變量構(gòu)建模型, 繪制列線圖將回歸模型可視化。對模型進(jìn)行數(shù)據(jù)內(nèi)部驗(yàn)證: 用Hosmer-Lemeshow test和校準(zhǔn)度曲線圖(calibration curve plot)檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臄M合優(yōu)度, 即觀測結(jié)果與預(yù)測結(jié)果的一致性; 用C-index值驗(yàn)證模型的區(qū)分度, 即預(yù)測模型區(qū)分兩種結(jié)果的能力, 在數(shù)學(xué)上C-index值與接受者操作特征曲線(ROC)曲線下面積(AUC值)相等[16]。

1.3.3.3 多元線性回歸分析

數(shù)據(jù)集的構(gòu)建: ①計算每次取樣日期與5月20日的間隔天數(shù)形成數(shù)據(jù)集time; ②參考熒光定量PCR的混樣方案, 將相應(yīng)個體的生理指標(biāo)取平均值, 從而形成生理指標(biāo)與基因表達(dá)數(shù)據(jù)的一一對應(yīng)關(guān)系; ③由于條件指數(shù)(C)與基因檢測樣本來源于不同個體, 因此采用各變量在各月份的平均值進(jìn)行分析。

表達(dá)式的構(gòu)建: 以時間()、各基因相對表達(dá)量作為自變量對C、、G、G和G分別建立回歸模型, 以環(huán)境因子[葉綠素含量、pH值、鹽度()、溫度()]為自變量對各基因相對表達(dá)量、C、、G、G和G分別建立回歸模型, 探索變量間的相關(guān)性。利用逐步回歸法篩選出AIC值(the Akaike information criterion, 赤池信息準(zhǔn)則)最小的模型, 并對其進(jìn)行正態(tài)性、獨(dú)立性、線性、同方差性、多重共線性檢驗(yàn), 計算出各表達(dá)式自變量的相對權(quán)重[17]。因變量與自變量的關(guān)系表達(dá)式如下:

C//G/G/G～++++++(2)

/C//G/G/G～+++.(3)

其中,:基因相對表達(dá)量;:4基因相對表達(dá)量;:7基因相對表達(dá)量;:基因相對表達(dá)量;:基因相對表達(dá)量;:含量;: pH 值;: 鹽度;: 時間;: 溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡蠣繁殖期海區(qū)環(huán)境因子的變化

采樣海區(qū)在2020年5月20日至10月20日期間鹽度(31.19～29.11)和pH(7.98～8.38)變化不大, 溫度呈季節(jié)性變化, 8月17日達(dá)到最高溫28.14 ℃(圖1a), 由于8月份降雨較多, 海區(qū)鹽度和pH出現(xiàn)小幅度變化。海區(qū)微型藻類(5～20 μm)葉綠素含量在6月和7月均處于較高水平(圖1b)。通過觀查樣品性腺狀態(tài), 推測排放期開始于6月12日左右。

2.2 血糖含量的變化

對血糖含量進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn),值均小于0.05, 表明血糖含量數(shù)據(jù)不符合方差分析的要求, 因此進(jìn)行非參數(shù)方差分析。結(jié)果表明, 各月份血糖含量具有極顯著差異(<0.01)。Wilcoxon秩和檢驗(yàn)結(jié)果如圖2所示, 長牡蠣血糖含量在2020年5月20日至7月27日期間呈下降趨勢, 7月27日至9月14日期間呈上升趨勢, 10月20日時出現(xiàn)輕微下降, 但與8月17日和9月14日的血糖數(shù)據(jù)仍被劃分為一組; 7月27日測得的平均血糖含量最低, 5月20日測得的平均血糖含量最高。

2.3 各組織糖原含量的變化

各組織糖原含量數(shù)據(jù)均不符合方差分析要求, 因此進(jìn)行非參數(shù)方差分析。結(jié)果表明, 長牡蠣各組織糖原含量具有極顯著差異(0.01)。其中閉殼肌的糖原含量遠(yuǎn)低于唇瓣和內(nèi)臟團(tuán)。不同月份間的糖原含量也具有極顯著差異(0.01)。在5月20日至7月27日期間唇瓣組織的糖原含量顯著高于內(nèi)臟團(tuán), 且二者均呈下降趨勢。8月17日之后, 唇瓣和內(nèi)臟團(tuán)開始逐漸積累糖原, 且二者水平相當(dāng)。閉殼肌糖原含量變化趨勢與唇瓣和內(nèi)臟團(tuán)相反, 在7月27日的樣品中含量最高(圖3)。

圖1 采樣海域各月份環(huán)境指標(biāo)變化

圖2 各月份長牡蠣血糖含量變化

注: 不同字母表示差異具有顯著性(<0.05)

2.4 條件指數(shù)的變化

長牡蠣條件指數(shù)數(shù)據(jù)不符合方差分析要求, 因此進(jìn)行非參數(shù)方差分析。結(jié)果表明, 條件指數(shù)的變化趨勢與糖原和血糖類似, 在5月20日至7月27日期間快速下降, 之后開始緩慢增長。6月12日的數(shù)據(jù)分布較為分散, 很可能是由于繁殖期取樣個體性腺排放狀態(tài)不一致造成的。

2.5 基因表達(dá)變化

非參數(shù)方差分析和Wilcoxon秩和檢驗(yàn)結(jié)果表明, 牡蠣類胰島素基因各月份間的表達(dá)具有顯著差異均小于0.05,在5月20日的相對表達(dá)量最高, 6月30日最低;和相對表達(dá)量無明顯季節(jié)性變化;在2020年8月17日的相對表達(dá)量最高, 比相對表達(dá)量最低的5月20日高出4.5倍, 推測可能與8月血糖含量突增有關(guān)。轉(zhuǎn)錄因子的相對表達(dá)量在6月12日最高, 隨后緩慢下降。各基因相對表達(dá)量的標(biāo)準(zhǔn)差較大, 表明個體間表達(dá)水平具有很大差異。

2.6 logistic回歸分析

配子排放概率的logistic回歸模型為:

將上式進(jìn)行對數(shù)變換可轉(zhuǎn)變?yōu)?

ln(/1–) = 3.39 – 0.31G– 32.14+ 1.97M, (5)

圖3 各月份長牡蠣不同組織糖原含量變化

注: 不同字母表示同組間差異具有顯著性(<0.05)

圖4 各月份長牡蠣條件指數(shù)的變化

對模型進(jìn)行內(nèi)部驗(yàn)證: C-index值為0.904(95%置信區(qū)間: 0.83～0.977, 圖7a), 表明模型區(qū)分度極好, 能夠準(zhǔn)確推算出性腺狀態(tài); 由校準(zhǔn)度曲線圖(圖7b)可以看出當(dāng)預(yù)測概率在 0.65～0.9之間時模型高估了配子排放的概率, 在0.45～0.65和大于0.9時模型低估了配子排放的概率, 但偏離幅度不大, 總體來看基本在45°線附近, Hosmer-Lemeshow擬合優(yōu)度檢驗(yàn)2值為9.06,=0.34>0.05, 表明模型預(yù)測值與實(shí)際值無統(tǒng)計學(xué)差異。綜上, 模型構(gòu)建成功。

圖5 各月份cgILPs和cgPdx基因相對表達(dá)量變化

圖6 配子排放概率logistic模型列線圖

圖7 接受者操作特征曲線(ROC)曲線圖及校準(zhǔn)度曲線圖

2.7 多元線性回歸模型

采用5月20日至10月20日(總體數(shù)據(jù))、5月20日至7月27日(所測生理指標(biāo)下降趨勢階段)、7月27日至10月20日(所測生理指標(biāo)上升趨勢階段)期間所測得的條件指數(shù)(C)、血糖()、各組織糖原含量(G、G、G)數(shù)據(jù)與取樣時間()、各基因相對表達(dá)量建立線性回歸模型。經(jīng)逐步回歸法最終篩選出AIC值最小的模型, 并利用相對權(quán)重法模擬出各自變量對模型的貢獻(xiàn)程度[17]。

2020年5月20日至10月20日期間, 長牡蠣條件指數(shù)(C)與和相對表達(dá)量建立的回歸模型2達(dá)到0.91, 且小于0.01, 具有統(tǒng)計學(xué)意義(表3), 其中自變量C與正相關(guān), 與負(fù)相關(guān), 所占權(quán)重比略低(表4); 內(nèi)臟團(tuán)組織的糖原含量與葉綠素含量的相關(guān)性為0.55, 與葉綠素含量呈負(fù)相關(guān)。cgMIP4與cgILP與各環(huán)境因子具有較高的相關(guān)性,2達(dá)到0.88和0.98, 各環(huán)境因子中pH和鹽度所占權(quán)重較高(表4)。7月27日至10月20日期間,G和G與基因表達(dá)水平的回歸模型2相對較低, 分別為0.64和0.51,分別為9.66×10?7和7.68×10?4, 均具有統(tǒng)計學(xué)意義(表3), 可以看出與G和G呈正相關(guān), 與這一時期糖原開始逐漸積累相吻合;與糖原含量呈負(fù)相關(guān), 且所占權(quán)重較低;和與G和G均呈正相關(guān),與G呈負(fù)相關(guān), 其中在G和G的糖原積累中所占權(quán)重最高。

表3 線性回歸模型表達(dá)式

注::基因相對表達(dá)量;:基因相對表達(dá)量;:基因相對表達(dá)量;:基因相對表達(dá)量;:基因相對表達(dá)量;: Chl含量;: pH值;: 鹽度;: 時間;: 溫度

表4 回歸模型相關(guān)參數(shù)

注::基因相對表達(dá)量;:基因相對表達(dá)量;:基因相對表達(dá)量;:基因相對表達(dá)量;:基因相對表達(dá)量;: Chl含量;: pH值;: 鹽度;: 時間;: 溫度

3 討論

長牡蠣糖原含量的高低是評價其肥美程度的一個重要指標(biāo), 糖原的積累也是目前的一個研究熱點(diǎn)。牡蠣糖原儲存在囊狀結(jié)締組織細(xì)胞(vesicular connective tissue cell, VCT)中, 主要分布于唇瓣、外套膜、性腺區(qū)[18], 參與糖原合成和分解的糖原合酶(glyco-gen synthase, GS)與磷酸化酶(glycogen phosphorylase, GP)也主要在唇瓣和性腺中表達(dá), 兩者表達(dá)水平最高的時期分別對應(yīng)于糖原積累和配子發(fā)育期[19]。糖原的儲存和動員是牡蠣新陳代謝的重要組成部分, 在牡蠣能量儲存和配子發(fā)育中具有重要作用。糖原代謝可分為兩個水平: 1) 糖原細(xì)胞的長期儲存與動員周期。2) 血糖濃度的動態(tài)平衡調(diào)節(jié)。糖原細(xì)胞的長期儲存與動員周期和配子發(fā)育以及浮游植物生物量和其它環(huán)境因子密切相關(guān)。血糖含量也與浮游植物生物量密切相關(guān), 另外血糖含量可以影響GS活性形式的比例從而間接地作用于糖原合成代謝[20], 最新研究表明胰島素信號可以通過PPP1R3B和PPP1R3G與糖原合成相聯(lián)系[21]。因此本文聚焦于糖原、血糖、類胰島素這三者之間的關(guān)系。

基于近年來對長牡蠣類胰島素基因的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析及功能預(yù)測[9], 本研究篩選了5個相關(guān)基因, 并采集了青島膠南地區(qū)長牡蠣養(yǎng)殖群體自然繁殖期間的血糖、不同組織糖原含量、條件指數(shù)等指標(biāo), 通過多元統(tǒng)計方法與相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行聯(lián)合分析, 得到以下主要結(jié)果: 長牡蠣血糖含量和內(nèi)臟團(tuán)糖原含量在配子排放前后具有顯著差異, 且與性腺排放狀態(tài)緊密相關(guān); 條件指數(shù)與和的相對表達(dá)量具有相關(guān)性; 內(nèi)臟團(tuán)和唇瓣糖原含量與和的相對表達(dá)量均具有一定的相關(guān)性,的相對表達(dá)量與糖原含量成負(fù)相關(guān),的相對表達(dá)量與唇瓣組織糖原含量呈負(fù)相關(guān),和的相對表達(dá)量與糖原含量成正相關(guān)。相關(guān)結(jié)果為進(jìn)一步深入研究牡蠣生長繁殖和糖原積累等重要生物過程的調(diào)控機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持。

3.1 環(huán)境因子與長牡蠣生長性狀、各基因表達(dá)量的相關(guān)性

雙殼類動物的繁殖周期和儲能周期與水溫、鹽度和浮游植物等環(huán)境因子密切相關(guān)[22-23]。海水溫度通過有效積溫或浮游植物豐度等直接或間接影響牡蠣性腺發(fā)育和生長繁殖。本研究觀察到長牡蠣于6月中上旬進(jìn)入性腺排放期, 此時取樣海區(qū)的水溫為20～ 22 ℃。隨著夏季水溫的升高, 該海域浮游植物豐度增加[24], 既有利于幼蟲發(fā)育, 也有利于親本繁殖后體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的快速恢復(fù)。多元線性回歸分析表明內(nèi)臟團(tuán)組織的糖原含量與葉綠素含量具有一定的相關(guān)性2為0.55, 與葉綠素含量呈負(fù)相關(guān), 也表明繁殖期為長牡蠣能量代謝高峰期。本研究測定了各月份葉綠素含量, 結(jié)果顯示養(yǎng)殖海域6月和7月微型浮游植物生物量均處于較高水平。在夏季繁殖期間, 海區(qū)浮游植物豐富度較高, 但長牡蠣血糖含量逐漸下降, 由于繁殖期消耗大量能量供應(yīng)所致; 7月至10月血糖含量逐漸升高可能是由于繁殖期能量消耗減少且浮游植物生物量仍較豐富所致。在8月的相對表達(dá)量顯著升高, 可能是由于血糖含量的增加引起。另外, 血糖含量是極易受到個體狀態(tài)和環(huán)境影響的生理指標(biāo), 由于條件限制, 無法從海上獲取樣品后實(shí)時進(jìn)行分析, 因此本研究的血糖含量數(shù)據(jù)具有一定的滯后性, 但考慮到各批次取樣流程基本一致, 所得的變化趨勢應(yīng)該是準(zhǔn)確的。

環(huán)境因子對和所構(gòu)建的表達(dá)式表明這兩個基因更易受到環(huán)境因素的影響。各環(huán)境因子中pH和鹽度所占權(quán)重較大, 溫度和葉綠素含量次之, 表明當(dāng)變化相同單位時pH和鹽度對基因表達(dá)量產(chǎn)生的影響最大, 但考慮到實(shí)際情況中pH和鹽度處于穩(wěn)定的狀態(tài), 溫度對基因表達(dá)的影響會更高。

3.2 生長性狀間的相關(guān)性

糖原的動員和儲存分別與牡蠣的繁殖期(3月至10月)、休眠期(11月至2月)相對應(yīng)[22, 25-26], 糖原合成可以看成是對食物供應(yīng)和高血糖的反應(yīng), 而糖原動員與配子形成的開始有關(guān)[18]。本研究結(jié)果顯示牡蠣繁殖行為造成體內(nèi)糖原的大量流失, 同時血糖和條件指數(shù)(牡蠣肥滿度的指征)也大幅下降。內(nèi)臟團(tuán)糖原含量在6月12日至7月27日一直處于較低水平, 與性腺排放期重合, 推測可能原因有: 第一, 內(nèi)臟團(tuán)糖原優(yōu)先被用于配子的形成; 第二, 配子本身含有糖原, 隨著配子被排放, 內(nèi)臟團(tuán)糖原儲備被清空, 因此含量隨之降低。

通過構(gòu)建logistic回歸模型, 可以根據(jù)內(nèi)臟團(tuán)糖原含量、血糖水平和性別三個指標(biāo)準(zhǔn)確的反映性腺是否已經(jīng)排放, 表明長牡蠣性腺排放狀態(tài)與這三個指標(biāo)的綜合效應(yīng)具有很強(qiáng)的相關(guān)性。雖然牡蠣性腺排放狀態(tài)可以通過肉眼直接觀察, 性腺未排放時,內(nèi)臟團(tuán)組織呈豐滿的乳白色, 隨著生殖細(xì)胞的排空,內(nèi)臟團(tuán)逐漸透明(圖8), 但是該模型的目的并非為了推測性腺是否排放, 而是分析配子排放期間相關(guān)聯(lián)的主要生理變化過程。本研究為回顧性分析, 由于長牡蠣所在海域、氣候等眾多影響因素存在差異, 該回歸模型是否適用于其他時段或海域的長牡蠣尚待驗(yàn)證。

圖8 配子排放前(左, 2020年5月20日樣品)和排放后(右, 2020年6月12日樣品)長牡蠣的表型對比

3.3 類胰島素基因與長牡蠣生長性狀間的相關(guān)性

貝類MIP的基因功能已有較多研究基礎(chǔ), 它們多在神經(jīng)組織表達(dá), 可能參與了貝類的生長發(fā)育過程。將靜水椎實(shí)螺()的神經(jīng)破壞后, MIP基因表達(dá)缺失, 會導(dǎo)致其身體和殼的生長停滯, 當(dāng)重新植入神經(jīng)簇后, 生長再次恢復(fù)[11]。和均屬于貝類特有的類胰島素基因家族,且二者在基因組上定位于相鄰位點(diǎn), 推測是通過串聯(lián)重復(fù)的方式發(fā)生基因復(fù)制而產(chǎn)生。其中有較多研究, 但均未發(fā)現(xiàn)其與糖原積累有關(guān), 2012年Cong等發(fā)現(xiàn)該基因中有2個SNP位點(diǎn)與長牡蠣生長性狀(殼高、殼長、殼寬、總重和軟體部重)呈極顯著相關(guān)(0.01)[12]。2005年Hamano等報道了在11月和次年1、3、5、7月的相對表達(dá)量, 其中11月、次年1月和3月相對表達(dá)量依次升高, 3月、5月和7月相對表達(dá)量逐漸下降[10-11]。本研究補(bǔ)充了5月至10月之間的觀察數(shù)據(jù), 結(jié)果顯示在7月的相對表達(dá)量低于5月, 且該基因在糖原含量顯著變化時期(5月至10月)無明顯的變化趨勢, 與Hamano等人的研究結(jié)論一致。同時, 從多元統(tǒng)計的公式也可以得出的相對表達(dá)量與P、L的糖原積累期無關(guān), 而與條件指數(shù)呈顯著正相關(guān)。對于, 在P、L糖原回歸模型中所占權(quán)重均較大, 且呈正相關(guān), 表明與長牡蠣糖原積累具有一定相關(guān)性。與在生長和糖原方面的差異可能與兩個基因的功能分化有關(guān)。cgILP與胰島素家族具有較高的同源性, 且在肝胰腺中特異性表達(dá), 可能在血糖調(diào)節(jié)方面具有一定作用, 但是血糖含量未建立出回歸模型, 因此未能確定cgILP與血糖之間的關(guān)系。公式 3顯示的相對表達(dá)量與唇瓣糖原積累成正相關(guān), 但所占權(quán)重較低, 表明可能在糖原積累的過程中發(fā)揮了些許作用。胰島素參與的血糖調(diào)控過程涉及到糖原合成通路, 但是長牡蠣血糖快速調(diào)節(jié)和糖原的季節(jié)性積累可能具有不同的調(diào)控機(jī)制, 因此通過糖原積累水平很難篩選到與血糖調(diào)節(jié)相關(guān)的基因。

cgMILP7具有特殊的氨基酸序列模式, 系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)其與果蠅的DILP7具有高度同源性[9], 可能都屬于類松弛素家族, 在生殖方面具有一定作用。長牡蠣的糖原含量在配子成熟與排放期顯著下降, 在繁殖期之后又逐漸上升, 即繁殖過程與糖原含量呈負(fù)相關(guān), 同時回歸分析發(fā)現(xiàn)的表達(dá)水平與糖原含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系, 推測很可能與繁殖過程的調(diào)控相關(guān)。

本研究所采用的有參線性回歸模型對數(shù)據(jù)有很多的約束性條件, 如一些基本的假設(shè)條件: 因變量值或殘差呈正態(tài)性、誤差的獨(dú)立性、線性、同方差性、多重共線性等, 導(dǎo)致最終只構(gòu)建成功了3個回歸模型。其中糖原積累期的公式3中2較低, 表明所構(gòu)建的回歸模型涉及的自變量有限, 還有其他基因、代謝物或物理化學(xué)因子等參與了長牡蠣糖原積累的調(diào)控。后續(xù)研究可以考慮組學(xué)和非參數(shù)回歸分析相結(jié)合的方法, 進(jìn)一步篩選血糖和糖原積累相關(guān)的調(diào)控因子。另外, 本研究所用的實(shí)驗(yàn)動物來自同一個養(yǎng)殖群體, 個體間可能存在親緣關(guān)系, 需要在更多的群體中驗(yàn)證相關(guān)結(jié)果。

4 結(jié)論

基于近年來對長牡蠣類胰島素基因的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析及功能預(yù)測, 本文篩選了4個相關(guān)基因, 并收集了青島膠南地區(qū)長牡蠣養(yǎng)殖群繁殖期間的血糖、不同組織糖原含量、條件指數(shù)等指標(biāo), 利用多元統(tǒng)計方法進(jìn)行了數(shù)據(jù)分析。logistic回歸分析表明長牡蠣性腺是否排放與血糖含量、內(nèi)臟團(tuán)糖原含量和性別之間具有一定相關(guān)性。多元回歸分析顯示, 繁殖期(2020年5月20日至10月20日)長牡蠣條件指數(shù)與和的相對表達(dá)量具有強(qiáng)相關(guān)性,2達(dá)到0.91(=0.007 6);與與各環(huán)境因子具有較高的相關(guān)性,2分別達(dá)到0.88和0.98; 7月27日至10月20日期間, 內(nèi)臟團(tuán)糖原含量與和基因表達(dá)水平具有一定相關(guān)性,2達(dá)到0.64 (=9.66×10?7), 唇瓣糖原含量與,,和的相對表達(dá)量具有一定相關(guān)性2達(dá)到0.51(=7.68×10?4)。建立的logistic回歸模型和多元線性回歸模型為研究性狀與基因相對表達(dá)量相關(guān)性提供了一種分析方法, 同時為進(jìn)一步探索牡蠣生長繁殖和糖原積累等重要生物過程的調(diào)控機(jī)制提供數(shù)據(jù)支撐。

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Glycogen content during reproduction seasons of Pacific oyster and the correlation analysis with relative expression of insulin-like genes

MIAO Xiao-jing1, 2, DENG Shao-xi1, 2, LI Liang-heng1, XU Fei1, 3

(1. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Center for Ocean Mega-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)

In the present study, glycogen content variations during the reproduction period of(Pacific oyster)and their correlations with the expression patterns of insulin-like genes (,,,) and the related transcription factor () were investigated. The blood glucose and glycogen content, condition index, and relative gene expression level were assayed on oysters cultured on a farm in Jiaonan, Shandong. Furthermore, marine environmental factors such as acidity, temperature, and salinity were collected from May to October 2020. Multivariate logistic regression analysis indicated a high correlation between the spawning and variations of blood glucose and glycogen content around the pyloric process. A regression model was constructed to estimate the gonad discharging status by the two parameters. The concordance index was at 0.903, while the2value was at 9.06 (> 0.05) for the Hosmer–Lemeshow test, indicating a good fit. Application of the model to verification samples also showed high reliability. The multiple linear regression analysis exhibited correlations of growth or physiological values with the expression pattern of some genes: the condition index was correlated withand(2: 0.91,: 0.0076); the glycogen content around the pyloric process and labial palps showed correlation withand; the relative expression ofwas negatively correlated with the glycogen content of all the assayed tissues;was negatively correlated with the glycogen content of labial palps;andwere positively correlated with glycogen content.

; Pacific oyster; blood glucose content; insulin-like genes;; multivariate statistics

Mar. 4, 2021

S917.4

A

1000-3096(2022)10-0001-12

10.11759/hykx20210304002

2021-03-04;

2021-05-14

國家自然科學(xué)基金(41776152); 中國科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心重點(diǎn)部署項目(COMS2019Q11); 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室開放基金(QNLM2016ORP0408)

[National Natural Science Foundation of China, No. 41776152; Key Deployment Project of Centre for Ocean Mega-Research of Science, Chinese Academy of Science, No. COMS2019Q11; Grant from the Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), No. QNLM2016ORP0408]

苗校靜(1996—), 女, 陜西渭南人, 碩士研究生, 主要從事貝類遺傳育種研究, E-mail: xiaojing_miao@163.com; 許飛(1982—),通信作者, 主要從事貝類遺傳育種研究, E-mail: xufei@qdio.ac.cn

(本文編輯: 楊 悅)