中藥分析中電霧式檢測(cè)器應(yīng)用現(xiàn)狀

劉芫汐，王 瑩，金紅宇，馬雙成

（中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629）

電霧式檢測(cè)器（CAD）是ESA公司于2004年推出的一款新型高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)器。CAD是基于霧化-氣溶膠的檢測(cè)器，檢測(cè)原理是將液相洗脫液霧化蒸發(fā)后檢測(cè)溶質(zhì)顆粒的帶電粒子的信號(hào)流，具有靈敏度高、重復(fù)性好、不依賴于化學(xué)結(jié)構(gòu)的信號(hào)響應(yīng)一致性、動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍寬、操作直觀簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，適用于分析各種不揮發(fā)或半揮發(fā)性化合物。2020年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0512“高效液相色譜法”中HPLC的檢測(cè)器首次補(bǔ)充了CAD，并對(duì)其基本特性進(jìn)行了簡(jiǎn)單說(shuō)明。在此，對(duì)近10年來(lái)采用CAD分析中藥成分的文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行總結(jié)，為其在中藥分析中的推廣應(yīng)用提供參考。

1 在中藥分析中的應(yīng)用

1.1 其他類(lèi)檢測(cè)器的應(yīng)用缺點(diǎn)

紫外檢測(cè)器（UVD）在HPLC中的應(yīng)用最廣泛。但由于中藥中糖類(lèi)、皂苷、萜類(lèi)等成分缺少發(fā)色基團(tuán)，故無(wú)法使用UVD進(jìn)行檢測(cè)。2020年版《中國(guó)藥典（一部）》收錄的藥材及成藥品種，其中若涉及無(wú)紫外吸收成分的含量測(cè)定，多采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）進(jìn)行檢測(cè)，如瓜子金中的瓜子金皂苷己、益母草中的鹽酸水蘇堿、馬鞭草中的熊果酸等［1］。ELSD雖為通用性檢測(cè)器，但日常檢測(cè)存在線性范圍窄、計(jì)算復(fù)雜等問(wèn)題，且在實(shí)際分析中為防止其基線漂移，只能采用等度洗脫法，限制了其色譜分離。

1.2 CAD在中藥材成分分析中的應(yīng)用

中藥材的成分復(fù)雜，性質(zhì)差異大，常同時(shí)含有僅有紫外末端吸收和有強(qiáng)紫外吸收類(lèi)型的化合物，很難采用某一類(lèi)型的專(zhuān)屬性檢測(cè)器對(duì)所有化合物進(jìn)行檢測(cè)。CAD具有良好的響應(yīng)一致性和通用性優(yōu)勢(shì)，在中藥材尤其是在萜類(lèi)、糖類(lèi)、皂苷類(lèi)、部分生物堿類(lèi)成分的分析中應(yīng)用日益廣泛。張春泥等［2］對(duì)比了川楝子飲片的UV，ELSD，CAD指紋圖譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與ELSD比較，CAD的靈敏度更高，確認(rèn)了28個(gè)共有特征色譜峰，能表征出川楝子更多成分的色譜峰信息。最終得出結(jié)論，CAD適用于川楝子中無(wú)紫外吸收或弱紫外吸收物質(zhì)的檢測(cè)，其在川楝子指紋圖譜的建立上具有明顯優(yōu)勢(shì)。

在中藥單糖及多糖測(cè)定中，CAD的使用愈加廣泛。張素紅等［3］使用HPLC-CAD測(cè)定了白茅根中果糖、葡萄糖、蔗糖的含量，建立了中藥中單糖和二糖的分析方法，表明CAD適用于單糖和低聚糖的檢測(cè)。譚必琴等［4］考察了檢測(cè)器的采集頻率和濾光片，并對(duì)流動(dòng)相比例、柱溫和流速進(jìn)行了優(yōu)化，測(cè)定了蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖4種糖的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用CAD測(cè)定蜂蜜中4種糖成分時(shí)，其靈敏度遠(yuǎn)高于ELSD。鄭曉倩等［5］使用CAD檢測(cè)了黃精九蒸九曬過(guò)程中的單糖和雙糖的含量變化，并與ELSD比較，結(jié)果前者耐用性及穩(wěn)定性更佳。張雪等［6］建立了CAD同時(shí)測(cè)定白及藥材中單糖和雙糖的方法。此外，多篇報(bào)道均證明，CAD在中藥單糖及多糖測(cè)定中有一定應(yīng)用前景［7-9］。

在皂苷及苷元的研究中，陳翠花等［10］采用超高效液相色譜（UPLC）-CAD柱后補(bǔ)償結(jié)合內(nèi)參法測(cè)定三七中總皂苷的含量，補(bǔ)償后各成分響應(yīng)一致性較好，無(wú)需響應(yīng)因子，也可用于定量分析。南易等［11］使用CAD同時(shí)檢測(cè)了知母中的芒果苷和知母皂苷BⅡ。同時(shí)對(duì)比了藥典中對(duì)這2個(gè)成分的UV和ELSD檢測(cè)法，發(fā)現(xiàn)使用CAD檢測(cè)不但簡(jiǎn)化了測(cè)定步驟，還提高了重復(fù)性和靈敏度（芒果苷和知母皂苷BⅡ的檢測(cè)限分別為0.43 ng和1.20 ng，定量限分別為1.28 ng和4.80 ng）。

在生物堿方面，尤其是甾體類(lèi)生物堿分析應(yīng)用中，采用CAD可通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相來(lái)獲得更好的分離效果，比ELSD更具優(yōu)勢(shì)［12］。楊娟艷等［13］采用CAD檢測(cè)了小葉黃楊中不同部位環(huán)維黃楊星D的含量，采用UV時(shí)基線漂移且響應(yīng)值低，無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)目標(biāo)成分含量，而采用CAD后響應(yīng)值高、基線平穩(wěn)，且定量更準(zhǔn)確。LONG等［14］建立了CAD檢測(cè)貝母中貝母素甲和貝母素乙2種生物堿含量的方法，同時(shí)與ELSD測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，CAD檢測(cè)靈敏度為ELSD的30～55倍，可檢測(cè)到ELSD無(wú)法檢測(cè)到的微量雜質(zhì)，且其重復(fù)性和動(dòng)態(tài)范圍均遠(yuǎn)優(yōu)于ELSD。

1.3 CAD在中藥提取物中的應(yīng)用

CAD除了應(yīng)用于中藥材的分析外，近年來(lái)在中成藥及中藥提取物中的應(yīng)用也逐漸增加，在進(jìn)行含量測(cè)定時(shí)還常被用于指紋圖譜的分析。趙鑫等［15］通過(guò)高效液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜（HPLC-MS）-CAD同時(shí)測(cè)定了辛夷提取物中4種木脂素類(lèi)成分，分別為松脂素二甲醚、木蘭脂素、里脂素B二甲醚和表木蘭脂素A。結(jié)果表明，CAD對(duì)4種成分的單位濃度的響應(yīng)因子一致性優(yōu)于DAD，可用于辛夷中木質(zhì)素類(lèi)成分的質(zhì)量評(píng)價(jià)。劉麗娜等［16］建立了銀杏葉提取物中萜類(lèi)內(nèi)酯類(lèi)成分的HPLC-CAD檢測(cè)法，并與2015年版《中國(guó)藥典》中ELSD檢測(cè)法及《歐洲藥典》中采用示差檢測(cè)器（RID）檢測(cè)法相比較，結(jié)果CAD測(cè)定靈敏度更高，具有明顯優(yōu)勢(shì)。

1.4 CAD在中藥制劑中的應(yīng)用

廖強(qiáng)等［17］通過(guò)快速溶劑萃取提取、柱后補(bǔ)償HPLC-CAD檢測(cè)了4種中成藥（補(bǔ)中益氣丸、通竅鼻炎顆粒、醒腦再造膠囊、玉屏風(fēng)顆粒）中的黃芪甲苷。王瑩等［18］建立了注射用益氣復(fù)脈中4種糖成分（果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖）的CAD檢測(cè)方法。QIAN等［19］使用CAD檢測(cè)了板藍(lán)根顆粒中7種氨基酸成分，并對(duì)其中6種進(jìn)行了定量分析。結(jié)果表明，該方法的精密度、穩(wěn)定性和回收率均符合試驗(yàn)要求，相較于傳統(tǒng)的衍生化后質(zhì)譜測(cè)定法，該方法前處理簡(jiǎn)單易操作，且結(jié)果更準(zhǔn)確。

除用于檢測(cè)中成藥中無(wú)紫外吸收的同一類(lèi)型成分外，CAD還被廣泛用于同時(shí)測(cè)定成方制劑中多種不同類(lèi)型的指標(biāo)性成分。羅昌明等［20］采用CAD考察了風(fēng)濕定痛片中8種指標(biāo)性成分，分別為在250 nm波長(zhǎng)處有最大吸收的甘草酸和甘草次酸，在235，269，259，274 nm波長(zhǎng)處有最大吸收的八角楓苷A、水楊苷、毒藜?jí)A、丹皮酚，在248 nm及301 nm波長(zhǎng)處有最大吸收的歐前胡素和異歐前胡素，對(duì)比以上各波長(zhǎng)下的圖譜發(fā)現(xiàn)，CAD獲得的峰數(shù)量均顯著多于DAD圖譜，且靈敏度高，基線更平穩(wěn)。段萍萍等［21］采用HPLC-CAD法檢測(cè)了千柏鼻炎片中鹽酸麻黃堿、綠原酸、對(duì)羥基桂皮酸、金絲桃苷、大黃素5個(gè)活性成分。這5個(gè)成分最大吸收波長(zhǎng)差異較大，傳統(tǒng)的DAD難以同時(shí)檢測(cè)，采用CAD檢測(cè)與各成分紫外吸收強(qiáng)弱無(wú)關(guān)，測(cè)定時(shí)不但得到的圖譜信息更豐富，且各成分靈敏度均高于DAD。在對(duì)中藥中多成分進(jìn)行檢測(cè)，特別這些成分紫外最大吸收波長(zhǎng)不同的情況下，部分研究表明，采用CAD可獲得更豐富的色譜峰信息，且基線更平穩(wěn)［20，22-23］。

除了應(yīng)用于中藥制劑中的成分分析外，CAD還被用于檢測(cè)制劑中的輔料及添加物。王亞瓊等［24］采用HPLC-CAD檢測(cè)了小兒咳喘靈口服液中甜味劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有部分企業(yè)違規(guī)采用蔗糖作矯味劑，該法靈敏度高，不但可檢測(cè)是否違規(guī)添加蔗糖，還能用于制劑中煉蜜的質(zhì)量評(píng)價(jià)，為中成藥中甜味劑的檢測(cè)及蜂蜜類(lèi)輔料質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了參考。李麗紅等［25］用CAD檢測(cè)摻假蜂蜜中的果葡糖漿，結(jié)果1%果葡糖漿可明顯檢出，表明能用于蜂蜜摻假的快速鑒別。

2 常見(jiàn)通用型檢測(cè)器比較及適用范圍研究

中藥分析中常見(jiàn)的通用型檢測(cè)器包括示差折光（RI）、ELSD，質(zhì)譜檢測(cè)器（MS）、CAD等。2020年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0512中列舉了7種檢測(cè)器。

RI是最早商品化的通用型檢測(cè)器，用于分析無(wú)紫外吸收物質(zhì)，獲取大分子的分子量分布信息等。因測(cè)定的是洗脫液的折射率變化，RID的靈敏度與流動(dòng)相和分析組分均相關(guān)。檢測(cè)器對(duì)溫度和壓力波動(dòng)敏感，與梯度洗脫不相容。隨著ELSD的問(wèn)世，檢測(cè)器的靈敏度和穩(wěn)定性均有提升。ELSD與任意揮發(fā)性流動(dòng)相相容，可檢測(cè)揮發(fā)性低于流動(dòng)相的樣品，而無(wú)須樣品含有發(fā)色基團(tuán)，應(yīng)用范圍較RI寬。而ELSD的響應(yīng)曲線呈S形，線性范圍較窄，給定量帶來(lái)不便。為改善ELSD的缺陷，凝聚成核散射檢測(cè)器（CNLSD）面市，其具有寬動(dòng)態(tài)范圍的曲線響應(yīng)的優(yōu)勢(shì)，但其響應(yīng)依賴于化合物的水溶性。MS是另一種通用型檢測(cè)器，在靈敏度、選擇性、通用性及化合物的分子量和結(jié)構(gòu)信息的提供等方面均有突出優(yōu)點(diǎn)，但僅能檢測(cè)能被電離的待測(cè)物質(zhì)，且成本較高。與上述通用型檢測(cè)器比較，CAD檢測(cè)信號(hào)僅與進(jìn)樣質(zhì)量有關(guān)，不依賴于被檢測(cè)物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，與梯度洗脫兼容，線性范圍寬，其響應(yīng)值不依賴于被測(cè)物質(zhì)的離子化效率，能檢測(cè)大部分非揮發(fā)性或半揮發(fā)性物質(zhì)［26］。

3 影響CAD準(zhǔn)確性的儀器參數(shù)設(shè)定

作為一款質(zhì)量敏感型檢測(cè)器，CAD的響應(yīng)值僅與進(jìn)樣質(zhì)量有關(guān)。但有研究表明，一些因素會(huì)影響CAD的準(zhǔn)確性與靈敏度，如霧化器溫度、背景噪音、流動(dòng)相組成、冪律函數(shù)值等。吳曉惠等［27］依據(jù)HPLC的檢定規(guī)程，并參考生產(chǎn)廠家要求，建立了HPLC-CAD的校準(zhǔn)方法，對(duì)影響儀器性能的各參數(shù)如泵耐壓、泵流量設(shè)置誤差、柱溫箱穩(wěn)定性等進(jìn)行了全面評(píng)價(jià)，確認(rèn)各項(xiàng)性能指標(biāo)控制在合理范圍內(nèi)。

梯度洗脫時(shí)，CAD的響應(yīng)會(huì)受流動(dòng)相影響。流動(dòng)相中有機(jī)相占比增大，響應(yīng)值會(huì)隨之增大?？赏ㄟ^(guò)逆梯度補(bǔ)償技術(shù)對(duì)其進(jìn)行修正，令進(jìn)入檢測(cè)器的洗脫液始終保持相同比例的組分。GóRECKI等［28］最早提出了逆梯度補(bǔ)償技術(shù)。而后更多的研究表明，在中藥分析領(lǐng)域，逆梯度補(bǔ)償可使相應(yīng)結(jié)果一致性更好，還可避免由于流動(dòng)相變化導(dǎo)致的基線漂移，從而減小色譜圖中的噪聲，利于獲得更好的靈敏度［29-31］。霧化器溫度的提高可提升信噪比，從而提升CAD的靈敏度，但溫度過(guò)高可能會(huì)影響待測(cè)成分的揮發(fā)。CAD中的背景噪聲主要來(lái)源于溶劑中的添加劑和雜質(zhì)，因此HPLC-MS級(jí)溶劑有利于提高靈敏度。

此外，流動(dòng)相中的添加劑、流速等也會(huì)對(duì)靈敏度產(chǎn)生影響。EOM等［32］評(píng)價(jià)了不同濃度的添加劑、pH、流動(dòng)相的流速、氮?dú)饧兌鹊葘?duì)CAD的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用CAD對(duì)柴胡皂苷進(jìn)行分析時(shí)，通過(guò)在一定程度上降低流動(dòng)相中的鹽濃度，可提高其靈敏度；使用0.1 mmol醋酸銨（pH4.0）-乙腈，在1.0 mL/min流速下可獲得最高的靈敏度。同時(shí)，氮?dú)饧兌葘?duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著影響。SCHILLING等［33］通過(guò)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)建立了結(jié)構(gòu)-性質(zhì)關(guān)系模型，用以描述物質(zhì)性質(zhì)和色譜參數(shù)對(duì)CAD響應(yīng)值的影響，結(jié)果顯示，在不同試驗(yàn)條件下可預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)相似化合物的CAD響應(yīng)性的潛力。

冪律函數(shù)值（PF）是指在質(zhì)量范圍內(nèi)通過(guò)試驗(yàn)確定的冪律指數(shù)b的倒數(shù)。當(dāng)分析物質(zhì)量濃度較高時(shí)，粒徑分布會(huì)與質(zhì)量濃度遵循指數(shù)冪律的變化規(guī)律。當(dāng)檢測(cè)質(zhì)量濃度范圍較大時(shí)，需使用PF值修正擬合繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。SOLIVEN等［34］對(duì)阿米卡星的分析結(jié)果說(shuō)明了PF值的重要性及對(duì)于檢測(cè)結(jié)果的影響。AHMAD等［35］和PAWELLEK等［36］在測(cè)定中通過(guò)公式推導(dǎo)，對(duì)PF的值進(jìn)行優(yōu)化。王瑩等［18］在注射用益氣復(fù)脈的研究中采用回收率判斷的方式，對(duì)PF值進(jìn)行優(yōu)化，使檢測(cè)結(jié)果更可靠，給出了通過(guò)線性初步判斷優(yōu)化PL值的方法。

4 小結(jié)

CAD作為一種質(zhì)量型檢測(cè)器，近年來(lái)在藥物分析領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，在中藥檢測(cè)方面也逐漸突顯出其優(yōu)勢(shì)。目前在中藥成分測(cè)定中，CAD主要用于糖類(lèi)及皂苷的分析，在多數(shù)研究結(jié)果中均顯示出較高的靈敏度。與ELSD比較，其線性范圍更寬，色譜峰響應(yīng)更一致。CAD檢測(cè)器在無(wú)紫外吸收成分、指紋圖譜及中藥中多成分測(cè)定中均顯示出較好的應(yīng)用前景。但如何通過(guò)優(yōu)化具體參數(shù)獲得更準(zhǔn)確、精密的測(cè)定結(jié)果仍需進(jìn)一步研究。