程序性細胞死亡在代謝相關脂肪性肝病中的研究進展

夏煜寒，蔡浩，顧勁揚（上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院移植科，上海 200030）

脂肪性肝病分為酒精性脂肪肝病和非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease， NAFLD），后者與代謝障礙密切相關。以往診斷NAFLD 需排除其他可能引起肝臟損傷的因素，且NAFLD 這一定義無法體現(xiàn)該病的內涵［1-2］。近年來，隨著代謝功能障礙相關脂肪性肝病（metabolic associated fatty liver disease， MAFLD）這一概念的提出，更準確的反映了脂肪肝的病因及病理生理過程，因此這一概念已被更多學者所接受。MAFLD 這一新的定義從原先的排他性診斷標準轉向為肯定性診斷標準，即存在代謝功能障礙而非排除其他肝損因素，從而將代謝功能障礙明確列為脂肪性肝病的重要病因［3-4］。這一概念更好地定義了MAFLD 患者群體，并有助于患者的疾病分型，從而為個體化診療和高級別臨床研究提供便利。因此，在本文中使用MAFLD 這一概念代替脂肪肝。

在許多情況下均有細胞死亡的發(fā)生，包括發(fā)育、代謝、癌癥和缺氧損傷。目前已知的（programmed cell deaths， PCD）主要包括細胞凋亡、壞死性凋亡、細胞焦亡、鐵死亡等。不同的PCD 方式在MAFLD發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了不同的作用。在正常肝臟中，凋亡的肝細胞占總肝細胞的比例低于0.05%，肝細胞凋亡與再生之間微妙的平衡調節(jié)著肝臟的功能與穩(wěn)態(tài)。目前，大部分現(xiàn)代肝病往往由慢性疾病引起，如MAFLD、慢性病毒性肝炎等。在這些情況下，各種PCD 的增加可能是上述慢性疾病過程的關鍵驅動因素。因此，準確的了解PCD 的機制對理解MAFLD 的病理生理過程以及新療法的開發(fā)至關重要。

1 細胞凋亡

1.1 細胞凋亡的特征與機制：Kerr 等［5］最先提出細胞凋亡廣泛存在于多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程，包括感染、藥物毒性反應、缺血/再灌注、免疫炎癥反應等，其發(fā)生機制主要分為內外兩個途徑，外部死亡受體途徑主要由腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor， TNF）超家族的成員介導，于細胞膜上形成凋亡誘導復合物，進而導致細胞凋亡［6］。線粒體釋放細胞色素C 是細胞凋亡內部線粒體途徑的關鍵步驟，釋放到胞漿的細胞色素C 在ATP 存在的條件下與凋亡相關因子1 結合，促使半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-9（Caspase-9）與其結合形成凋亡小體，誘發(fā)凋亡。

1.2 細胞凋亡與MAFLD 的聯(lián)系：研究發(fā)現(xiàn)，MAFLD患者肝組織的免疫組化檢測顯示其caspase-3和TUNEL 染色均呈陽性，表明MAFLD 患者肝臟中發(fā)生了細胞凋亡，并且MAFLD 患者的肝細胞凋亡標志物表達水平與嚴重程度相關［7］。因此，可以通過檢測活化的Caspase-3 及角蛋白酶-18 片段的含量初步診斷MAFLD［8］。最近的研究表明，在脂肪肝小鼠模型中，Caspase-2、3 缺失可減少細胞凋亡并抑制MAFLD 的形成［9］。無獨有偶，F(xiàn)erreira 等［10］發(fā)現(xiàn)嚴重MAFLD 患者活化的Caspases-2、3 水平顯著高于單純脂肪變性患者。其次，使用泛半胱氨酸天冬蛋白酶抑制劑VX-166，可顯著減輕脂肪肝小鼠的肝損傷和肝纖維化。一致的是，在一項臨床試驗中，口服抑制Caspase 1、8、9 可以使NASH 患者丙氨酸轉氨酶水平降低［11］。目前正在進行的大型臨床隨機試驗的還有恩卡利生，該藥物是一種泛Caspase 的抑制劑，用于治療肝病，包括移植后肝臟保護，慢性病毒性肝炎以及MAFLD，該藥物已在幾個早期臨床試驗中進行了測試，并下調了MAFLD患者肝轉氨酶水平［12］。綜上所述，凋亡是MAFLD形成中的重要一環(huán)，抑制凋亡可減輕MAFLD 的病癥并抑制MAFLD 的形成。

2 細胞焦亡

2.1 細胞焦亡的特征與機制：相比于細胞凋亡，細胞焦亡發(fā)生的更快，并會伴隨著大量促炎癥因子的釋放。形態(tài)學上焦亡的細胞會發(fā)生腫脹，細胞核固縮及DNA 斷裂，在細胞膜上形成孔隙，釋放內容物，引起炎癥反應［13］。細胞焦亡的發(fā)生主要分為依賴Caspase-1 的經(jīng)典途徑和依賴Caspase-4、5、11的非經(jīng)典途徑。在經(jīng)典的焦亡途徑中，損傷相關分子模式（damage-associated molecular patterns， DAMPs）被細胞內的核苷酸寡聚化結構域（nucleotide binding and oligomerization domain， NOD）樣受體識別［14］，通過接頭蛋白與Caspase-1 的前體結合并活化。一方面，活化的Caspase-1 切割Gasdermin D（GSDMD），形成含有GSDMD 氮端活性域的肽段，誘導細胞膜穿孔釋放內容物并引起炎癥反應；另一方面，活化的Caspase-1 對IL-1β 和IL-18 的前體進行切割，活化的IL-1β 和IL-18 募集炎癥細胞并擴大炎癥反應［15］。在非經(jīng)典的焦亡途徑中，活化的Caspase-4、5、11 即可直接誘導細胞焦亡的發(fā)生，也可切割GSDMD，形成含有GSDMD 氮端活性域的肽段，誘導細胞焦亡［16］。

2.2 細胞焦亡與MAFLD 的聯(lián)系：Zhong 等［17］發(fā)現(xiàn)在膽堿-蛋氨酸缺乏飲食（methionine and choline deficient diet， MCD）小鼠模型中存在細胞焦亡，證明了減輕GSDMD 的表達可減緩MCD 的形成。Chen等［18］發(fā)現(xiàn)NLRP3 活化Caspase-1 并誘導IL-18和IL-1β 的表達，最終導致脂肪肝細胞焦亡的發(fā)生DAMPs 的釋放。目前主流觀點認為IL-1β 是促進MAFLD 形成的細胞因子。而Yamanishi 等［19］認為IL-18 對于肝臟中正常的脂質代謝至關重要，其缺陷反而導致脂肪積累，因此MAFLD 中肝細胞焦亡釋放的IL-18 和IL-1β 可能是一把雙刃劍。有研究表明，人體MAFLD 肝臟組織中GSDMD和GSDMD-N 水平較高，并且小檗堿可通過抑制ROS-TXNIP 軸，降低NLRP3、Caspase-1 的活性，對MAFLD 有顯著治療效果。而MCD 小鼠中敲除GSDMD 可減少NF-κB 的磷酸化和促炎細胞因子如TNF-α、IL-1 的表達，最終減輕脂肪肝的形成［20］。因此，抑制NLRP3 和GSDMD 的激活可以通過減少細胞焦亡發(fā)生，顯著減輕炎癥和纖維化，最終抑制MAFLD 的形成。但上述結論尚未得到臨床藥物實驗的證實，因此通過抑制細胞焦亡來阻斷MAFLD 的形成還需要大量的臨床試驗。

3 壞死性凋亡

3.1 壞死性凋亡的特征與機制：壞死性凋亡是一種依賴于受體相互作用蛋白激酶1（receptor interacting protein kinase 1，RIPK1）的細胞死亡方式。另有研究表明，受體相互作用蛋白激酶3（receptor interacting protein kinase 3，RIPK3）和混合譜系激酶結構域樣假激酶（mixed lineage kinase domain-like，MLKL）也是壞死性凋亡的關鍵蛋白［21］。壞死性凋亡的激活主要由TNF-α 介導，使得RIPK1 和RIPK3 中的RIP 同型結構域相互作用，促進RIPK1 和RIPK3 磷酸化，進而導致MLKL 的寡聚及磷酸化，P-MLKL激活后插入細胞質膜，導致細胞膜破裂和包括IL-1α、IL-β 和IL-33 等DAMPs 的釋放，從而引發(fā)炎癥反應，加重組織損傷［22］。其中Caspase-8不僅是細胞壞死性凋亡的重要組成部分，還是一個引導細胞走向另一死亡方式的開關，Caspase-8 的激活促進細胞凋亡，而抑制Caspase-8 活性則使細胞走向壞死性凋亡。

3.2 壞死性凋亡與MAFLD 的聯(lián)系：在正常生理條件下肝細胞RIPK3 的表達非常低，當細胞凋亡被阻斷時，壞死性凋亡可能是替代的死亡機制［23-25］。Roh 等［26］發(fā)現(xiàn)MAFLD 患者血清中可以檢測到P-MLKL、RIPK1、RIPK3 的升高，這表明MAFLD 患者肝臟中發(fā)生了壞死性凋亡。在脂肪肝動物模型的肝臟組織中TNF-α 和Toll 樣受體4 明顯升高，TNF-α 和Toll 樣受體4 激活RIPK3 和MLKL，通過ASK1-JNK 介導的炎癥和肝纖維化等促進了MAFLD 的形成［27］。研究發(fā)現(xiàn)，使用RIPK1特異性抑制劑RIPA-56 可顯著減輕肥胖飲食小鼠的肝臟炎癥與纖維化，并且可逆轉肥胖小鼠肝臟的脂肪變性。但是Roychowdhury 等［28］研究發(fā)現(xiàn)，在脂肪肝動物模型中敲除RIPK3 反而加重了肝臟損傷、肝臟脂肪變性及炎癥，并認為這一結果可能是通過加重細胞凋亡導致的。根據(jù)上述結論，似乎直接抑制RIPK3 激酶并不一定是治療MAFLD 的理想方案，但靶向抑制RIPK1/MLKL 可能是一種很有潛力的MAFLD 治療策略。因此，需要進一步研究RIPK3、RIPK1 和MLKL 在MAFLD 中發(fā)揮的作用，才能更好的從抑制壞死性凋亡及并發(fā)的炎癥反應角度改善甚至逆轉MAFLD。

4 鐵死亡

4.1 鐵死亡的特征與機制：2012 年Dixon 等［29］人研究發(fā)現(xiàn)Erastin 和RSL3 可特異性誘導Ras 突變細胞的死亡，其作用機制與過渡態(tài)鐵的含量有關，并且鐵螯合劑可抑制這一過程，故命名為鐵死亡。鐵死亡在細胞形態(tài)學上與凋亡、自噬、壞死等傳統(tǒng)的細胞死亡方式有顯著差異，主要表現(xiàn)為線粒體變小，膜密度增高，外膜消失而細胞核的形態(tài)變化不明顯。目前普遍認為磷脂氫過氧化物（phospholipid hydroperoxides， PLOOHs）是鐵死亡的執(zhí)行者，其合成依賴于過渡態(tài)鐵、ROS 及含有多不飽和脂肪酸鏈的磷脂（phospholipid with polyunsaturated fatty acid chain， PUFA-PLs），因此PLOOH 的清除可顯著下調鐵死亡的發(fā)生。PLOOH的清除有3 條途徑：① 在經(jīng)典的鐵死亡調控通路中，胱氨酸通過胱氨酸/谷氨酸反向轉運體進入細胞，經(jīng)硫氧還蛋白還原酶1 還原生成半胱氨酸，促進谷胱甘肽（glutathione， GSH）生成。GSH是一種強效的還原劑，可作為谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4 ， GPX4）的輔因子，促進PLOOHs 還原為對應的醇［30-31］。② 鐵死亡抑制蛋白1 （ferroptosis suppressor protein 1，F(xiàn)SP1）-泛醌系統(tǒng)可以保護細胞免受GPX4 基因敲除引起的鐵死亡。FSP1 可通過催化泛醌還原為泛醇從而抑制脂質過氧化進而抑制鐵死亡［32］。③ GTP 環(huán)化水解酶（GTP cyclohydrolase-1， GCH1）和二/ 四氫生物喋呤（dihydrobiopterin /tetrahydrobiopterin，BH2/BH4）介導的對脂質過氧化的抑制作用也可保護細胞免受鐵死亡，在其中GCH1 和BH2/BH4可能作為內源性的自由基捕獲型抗氧化劑發(fā)揮作用［33-34］。需要注意的是，在鐵死亡過程中，最終介導細胞死亡的確切機制尚不清楚，可能與脂質交聯(lián)導致細胞膜完整性被破壞以及來源于PUFA-PLs的ROS 引發(fā)的生物大分子的氧化損傷相關。

4.2 鐵死亡與MAFLD 的聯(lián)系：研究發(fā)現(xiàn)，MAFLD患者中存在不同程度的磷脂過氧化的代謝產物丙二醛和4-羥基壬烯醛的升高，并且脂質過氧化和過量的鐵沉積可以通過增加鐵死亡水平加劇MAFLD患者的炎癥反應［35］。Imai 等［35］認為GPX4 抗氧化特性可能在MAFLD 中發(fā)揮關鍵作用，使用RSL-3抑制劑可通過脂氧合酶（lipoxygenases， LOXs）增加肝臟中的磷脂過氧化，誘發(fā)鐵死亡，并且使用鐵螯合劑可改善這一現(xiàn)象，說明MAFLD 中同時存在ALOXs 催化和鐵催化的PLOOH。有文獻表明，在MAFLD 患者血清中的白色脂肪二價金屬轉運蛋白含量升高，可通過促進二價鐵在小腸中的吸收，增加肝細胞內鐵的含量［36］。同時在脂肪肝小鼠模型中也檢測到轉鐵蛋白受體1 的上調，它通過增加鐵的攝入加重脂肪肝小鼠模型中鐵死亡的發(fā)生［37］。結合上述研究不難發(fā)現(xiàn)，MAFLD 患者中鐵的沉積與大量磷脂過氧化物的合成共同作用，加劇了鐵死亡的發(fā)生并促進了MAFLD 的形成。這也提示，靶向抑制鐵死亡可能是MAFLD患者的潛在治療手段。

5 展 望

目前，大多數(shù)實驗研究將各類細胞死亡方式作為獨立的個體，單獨研究其與MAFLD 的關聯(lián)。但它們之間的分子機制和途徑緊密聯(lián)系，單獨抑制某一PCD 可能療效有限，甚至會加重其他方式的細胞死亡。因此，靶向多個細胞死亡途徑可能比單一治療方法更有效。此外，鑒于不同的細胞死亡途徑之間的相互作用，以及考慮到調節(jié)一種PCD 途徑可能會激活另一種PCD 的風險，如果對MAFLD 患者的治療采用靶向調節(jié)細胞死亡的信號通路，如ASK1-JNK、GSH-GPX、FSP1-COQ10、線粒體自噬和炎癥小體等，可能會比直接靶向抑制PCD 更有效、更安全、更可控。

6 總 結

在過去的10 年里，我們對脂肪肝的理解逐步深入，主要體現(xiàn)為其發(fā)病機制的逐步闡明：包括氧化應激和內質網(wǎng)應激，以及不同類型的PCD 在MAFLD 的形成及發(fā)病過程中發(fā)揮的作用。本綜述通過文獻檢索，總結了MAFLD 形成中可能存在的PCD 及其研究進展，并推測未來MAFLD 的創(chuàng)新治療方向可能包括直接或間接靶向抑制不同類型的PCD 以延緩甚至逆轉疾病進程。盡管目前仍有許多問題亟待解決，但是本綜述將為未來的研究方向提供重要的理論參考。