三七的組織培養(yǎng)研究進(jìn)展△

強(qiáng)寶寶，梁瑩，候小利，秦雙雙，韋坤華，繆劍華

廣西壯族自治區(qū)藥用植物園 廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西壯族自治區(qū)中藥資源智慧創(chuàng)制工程研究中心，廣西 南寧 530023

三七Panax notoginseng（Burk）F.H.Chen、人參和西洋參都是人參屬的藥用植物，在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)上具有很高的藥用價(jià)值[1-3]。三七是中國傳統(tǒng)名貴中藥材，主要分布于中國云南省文山市，全草入藥，享有“人參之王的美譽(yù)”，已有400 多年的栽培歷史[4-5]?，F(xiàn)在能查閱的最早使用三七的記錄為楊清叟的《仙傳外科方集》，已有640 多年的歷史[6]。三七有止血化瘀、活血定痛的功效，被稱為“止血之神藥”。三七廣泛用于治療心血管疾病、腦血管紊亂、炎癥、軀體疼痛、動(dòng)脈硬化、外傷及損傷引起的內(nèi)外出血[7-12]，還有抗腫瘤和抗衰老的功效[13]。三七中人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd和人參皂苷Rg1含量高于人參和西洋參[14]。

近年來，在亞洲和世界其他許多國家，三七廣泛應(yīng)用于藥品、食品和化妝品領(lǐng)域。在中國，三七年需求量約為5000 t[15-16]，野生三七遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需求[17]，因此，研究者試圖利用組織培養(yǎng)技術(shù)來獲得三七苗。目前可以通過三七愈傷組織和種胚2 種途徑誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎，經(jīng)過分化誘導(dǎo)和再培養(yǎng)可以獲得大量三七組培苗。此外，三七細(xì)胞懸浮培養(yǎng)和不定根培養(yǎng)也能生產(chǎn)可控制的活性代謝產(chǎn)物。本文將對(duì)近年來國內(nèi)外三七組織培養(yǎng)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 愈傷組織誘導(dǎo)

通過愈傷組織建立的組織培養(yǎng)技術(shù)不僅是植物快速繁殖的手段，也是植物遺傳改良、品種選育和提高次生代謝產(chǎn)物的理想途徑。鄭光植等[18]研究表明，三七愈傷組織在MS 培養(yǎng)基中比Heller、Miller、B5 和B5+N中的培養(yǎng)效果好。Zhou 等[17]以MS 培養(yǎng)基+3%蔗糖+10%椰奶+2 mg·L-12,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）+0.1 mg·L-1激動(dòng)素（KT）作為培養(yǎng)條件，研究了低聚糖（鐵皮石斛、人參和天竺葵酊年幼細(xì)胞壁的酸水解產(chǎn)物）對(duì)三七愈傷組織的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)三者質(zhì)量濃度分別為15、15、20 mg·L-1時(shí)有益于三七愈傷組織皂苷的產(chǎn)生。王定康等[19]分別以2、3年生三七的花藥作為外植體，在MS+2.0 mg·L-12,4-D+1.5 mg·L-16-芐基嘌呤（6-BA）+1.0 mg·L-13-吲哚乙酸（IAA）+6%蔗糖的條件下，成功誘導(dǎo)了愈傷組織，誘導(dǎo)率分別為43.0%、55.0%，表明3年生三七花藥愈傷組織的出愈率和質(zhì)量均優(yōu)于2年生花藥。因此，進(jìn)行三七花藥培養(yǎng)以3 年生花藥為外植體較合適。有研究對(duì)誘導(dǎo)三七花藥愈傷組織的因素進(jìn)行了研究[20]，結(jié)果表明，在MS+2.0 mg·L-12,4-D+1.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1IAA+6%蔗糖的培養(yǎng)基上，發(fā)育期處于單核中期的花粉誘導(dǎo)率最高，可達(dá)50%；在以上激素配比條件下，比較了MS、B5和N6培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)效果，發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率較高，且愈傷組織易增殖；6%蔗糖能產(chǎn)生較高的誘導(dǎo)率，后期長勢(shì)良好；將花藥在低溫3～4、7～8 ℃條件下分別處理4～6、6～8 d，均可以提高愈傷組織誘導(dǎo)率。

黃天衛(wèi)等[21]用三七的幼嫩花蕾在MS+1.0 mg·L-12,4-D+1.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1IAA+30 g·L-1蔗糖的條件下成功誘導(dǎo)出了愈傷組織，誘導(dǎo)率可以達(dá)到55.6%。張鐵等[22]研究表明，三七無菌苗的嫩芽、葉、葉柄、不定根和主根均能誘導(dǎo)出愈傷組織，尤以三七葉柄為外植體誘導(dǎo)出的愈傷組織質(zhì)量較好，最容易增殖，較適合的培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-16-BA+2.0 mg·L-12,4-D+3%蔗糖。李濤等[23]采用文山三七塊根作為外植體，研究獲得了最佳愈傷組織誘導(dǎo)條件為MS+1.0 mg·L-1KT +1.0 mg·L-12,4-D+30 g·L-1蔗糖。

許鴻源等[24]研究了5組培養(yǎng)基對(duì)三七莖段愈傷組織發(fā)生和增殖的影響，發(fā)現(xiàn)在MS+2 mg·L-12,4-D的培養(yǎng)基上添加2 mg·L-1靈發(fā)素（LFS）可以促進(jìn)莖段愈傷組織早發(fā)生1～2 周，誘導(dǎo)率達(dá)81%，比2,4-D高出30%以上，而添加了6-BA、KT和玉米素（ZT）的培養(yǎng)基作用不明顯，而且LFS可以促進(jìn)愈傷組織增殖，40 d后收獲干質(zhì)量為81.5 mg·g-1，是不含LFS的3～4倍。此研究結(jié)果利用LFS建立了高效的三七愈傷組織生產(chǎn)模式。Li 等[25]研究表明，三七的根在MS+2.0 mg·L-12,4-D+1.5 mg·L-16-BA 的培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)，4周后可得到愈傷組織，誘導(dǎo)率可達(dá)到100%，是最佳的誘導(dǎo)條件。齊琳琳等[26]研究表明，激素配比對(duì)愈傷組織中皂苷含量的影響最大，在0.5 mg·L-12,4-D+1.0 mg·L-16-BA 組合下，培養(yǎng)物中總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最多，達(dá)到（4.72±0.29）%；在總氮量為60 mmol·L-1條件下，45 mmol·L-1硝酸鉀+7.5 mmol·L-1硝酸氫銨（NO3-∶NH4+為7∶1）時(shí)，愈傷組織皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最多，達(dá)到（4.71±0.17）%；分別在1000、500 lx 光強(qiáng)下每天光照12 h 的愈傷組織皂苷含量均低于黑暗培養(yǎng)的愈傷組織，三者皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（1.94±0.31）%、（2.38±0.12）% 和（3.57±0.27）%。光照引起愈傷組織表面變綠及細(xì)胞分化，可能是抑制愈傷組織中皂苷合成與積累的主要原因。

2 胚胎誘導(dǎo)及再培養(yǎng)

體細(xì)胞胚胎的發(fā)生是建立植物無性繁殖可靠的再生方法[27-28]。目前，可以通過三七的愈傷組織和種胚2種途徑誘導(dǎo)三七產(chǎn)生體細(xì)胞胚胎。張琪等[29]對(duì)沙藏后三七種子的種胚進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在MS+1 mg·L-1IAA或萘乙酸（NAA）的培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)可誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體，繼而轉(zhuǎn)入MS+1 mg·L-1赤霉素（GA3）+0.5 mg·L-1IAA 培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)，大約80%的胚狀體可發(fā)育成小植株。

許鴻源等[30]以三七莖段愈傷組織，在MS+1.5 mg·L-12,4-D+2 mg·L-1LFS的培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)2～3個(gè)月，胚狀體發(fā)生率高達(dá)90%左右。將胚狀體轉(zhuǎn)移至上述培養(yǎng)基光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)，大約30%胚狀體可以發(fā)育完整的苗。這些現(xiàn)象表明，IAA、NAA、6-BA、KT 和LFS 等都可以在三七胚狀體發(fā)生的誘導(dǎo)中發(fā)揮作用，但是作為單一激素的報(bào)道，目前還只有LFS。LFS 誘導(dǎo)三七莖段愈傷組織發(fā)生胚狀體非常適宜，但是對(duì)于促進(jìn)胚狀體成苗效果一般。

You 等[11]以三七不定根在MS+1.0 mg·L-12,4-D的固體培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)5 周，得到乳白色、易碎、快速增值的愈傷組織。再將其轉(zhuǎn)移到MS+0～1.0 mg·L-12,4-D 的固體培養(yǎng)基中，4 周后，在含有0.5 mg·L-12,4-D 的條件下，體細(xì)胞胚胎發(fā)生率可達(dá)100%，平均每個(gè)愈傷組織有32.7 個(gè)體細(xì)胞胚。將獲得的體細(xì)胞胚胎在不添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的1/2 MS 培養(yǎng)基上再培養(yǎng)，2 周后生根，8 周后發(fā)芽。體細(xì)胞胚胎發(fā)芽緩慢，而且尚不能完全轉(zhuǎn)化為同時(shí)具有根和芽的完整小苗，推測(cè)可能是其仍然保持休眠[31-32]。添加0～4 mg·L-1的GA3能很好地促進(jìn)體細(xì)胞胚胎發(fā)芽，并能分化為同時(shí)具有適宜根和芽的完整小苗，此現(xiàn)象在人參和西洋參體細(xì)胞胚胎的培養(yǎng)中也有報(bào)道[33-34]。

3 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)

進(jìn)行植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)研究是植物組織培養(yǎng)向工業(yè)化生產(chǎn)轉(zhuǎn)化的重要步驟。植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)所用的細(xì)胞來自愈傷組織，或直接來自植物的器官及組織的外植體。植物細(xì)胞液體培養(yǎng)具有繁殖速度快的特點(diǎn)，可大規(guī)模培養(yǎng)，甚至可能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。在人參屬植物的懸浮培養(yǎng)中，碳源、氮源和磷酸鹽源等培養(yǎng)基成分對(duì)植物細(xì)胞中人參皂苷的生物量和產(chǎn)量均有顯著影響。

在三七的組織培養(yǎng)中，蔗糖質(zhì)量濃度從20 g·L-1增加到40 g·L-1，總皂苷的含量提高了2.3 倍[35]。在三七懸浮培養(yǎng)中，較高的氮源也可以提高人參皂苷的產(chǎn)量。Zhang 等[36]研究表明，隨著硝酸鹽濃度從0增加到60 mmol·L-1，三七細(xì)胞生物量從4.9 g·L-1增加到10.9 g·L-1。適當(dāng)?shù)牧姿猁}濃度也可以影響三七懸浮培養(yǎng)中皂苷的含量。Zhong 等[37]研究發(fā)現(xiàn)，三七懸浮液中磷酸鹽添加量為1.25 mmol·L-1時(shí)，人參皂苷的產(chǎn)率最佳。

植物細(xì)胞培養(yǎng)是一種替代自然植物獲得有價(jià)值次生代謝產(chǎn)物的有效途徑[38]。Wang[39]等研究表明，三七細(xì)胞在MS+2 mg·L-12,4-D+0.7 mg·L-1KT 培養(yǎng)基中以110 r·min-1，黑暗條件下懸浮培養(yǎng)4 d 后，加入200 μmol·L-1茉莉酸2-羥乙基酯（HEJA），能更有效地刺激人參皂苷的生物合成，改變其多樣性。在第13 天，獲得最高的人參皂苷含量，與茉莉酸甲酯（MJ）相比，HEJA 誘導(dǎo)的人參皂苷總含量和人參皂苷Rb 與人參皂苷Rg 的比率分別提高了約60%、30%。Zhong 等[40]利用生物反應(yīng)器研究表明，在三七細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中的第8天，添加200μmol·L-1MJ，最終可促使人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1質(zhì)量濃度分別從（42±8）、（42±9）、（41±6）mg·L-1增加到（104±6）、（71±5）、（95±6）mg·L-1，分別提高了150%、70%、130%。

近年來，有研究表明，細(xì)胞外Ca2+影響植物次生代謝物的產(chǎn)生[41]。Yue 等[42]研究發(fā)現(xiàn)，在三七細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的3 d 內(nèi)，人參皂苷Rb1的合成依賴于培養(yǎng)基所含Ca2+濃度。當(dāng)Ca2+的濃度為8 mmol·L-1時(shí)，人參皂苷Rb1的含量達(dá)到最大（1.88±0.03）mg·g-1，比Ca2+的濃度為0、3 mmol·L-1時(shí)高出60%和25%。在植物的組織培養(yǎng)過程中，添加溶菌酶具有防止污染的作用，其對(duì)三七皂苷的合成和細(xì)胞生長也具有促進(jìn)作用。周立剛等[43]以MS+1 mg·L-12,4-D+0.05 mg·L-1KT+10%椰乳，120 r·min-1下進(jìn)行三七愈傷組織暗培養(yǎng)，在誘導(dǎo)的第10 天加入100 mg·L-1溶菌酶能明顯促進(jìn)皂苷合成，皂苷產(chǎn)率為1.62 g·L-1，比對(duì)照組提高63.48%。

王艷等[44]以三七種子剝?nèi)∽尤~，以MS+2 mg·L-12,4-D+1 mg·L-1KT為培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織，并在此培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織懸浮培養(yǎng)，100 r·min-1測(cè)定懸浮培養(yǎng)過程中皂苷生物合成的動(dòng)力學(xué)變化。結(jié)果表明，人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rb1初始培養(yǎng)值分別為3.63、2.34、0.42、0.24 mg·g-1，培養(yǎng)25～30 d 后增至最高，分別為9.72、7.02、2.37、1.86 mg·g-1，而人參皂苷Rh2、人參皂苷F1含量無明顯變化，即三七愈傷組織生物合成過程中原人參三醇型皂苷（人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rh1）增長顯著，并表明七愈傷組織培養(yǎng)25 d，總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最高，為20.58 mg·g-1，主要為原人參三醇型皂苷。

4 不定根誘導(dǎo)

植物不定根是不按正常時(shí)序發(fā)生，出現(xiàn)在非正常位置的根。大多數(shù)情況下，不定根的發(fā)生是由于植物器官受傷或植物激素等外界刺激，通過植物的莖、葉、節(jié)、愈傷組織誘導(dǎo)而產(chǎn)生[45]。如今，人參不定根培養(yǎng)已成功實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化，反應(yīng)器規(guī)模達(dá)到10 000 kg[46]，而三七在這方面還處于起步階段。

Gao 等[47]以3 年生三七的葉、葉柄和根，在MS固體培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)誘導(dǎo)不定根，發(fā)現(xiàn)側(cè)根外植體在第10天出現(xiàn)愈傷組織，第35天出現(xiàn)不定根，不定根誘導(dǎo)率為44%。葉柄外植體在第14 天出現(xiàn)愈傷組織，第45 天出現(xiàn)不定根，誘導(dǎo)率為37%，誘導(dǎo)不定根最佳條件為MS+3 mg·L-1IBA。在培養(yǎng)的第35天，不定根中的皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大值（46 mg·g-1），并表明2,4-D 只是誘發(fā)愈傷組織的形成，IBA 是誘發(fā)三七形成不定根的有效激素，在人參的組織培養(yǎng)研究中也發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果[48-49]。

如今，利用茉莉酸（JA）、MJ 和二氫茉莉酸甲酯（MDJ）等茉莉酸信號(hào)化合物，在植物組織培養(yǎng)中刺激次生代謝產(chǎn)物的生物合成，越來越受到研究者的關(guān)注[50-51]。Qiang 等[52]總結(jié)發(fā)現(xiàn)，茉莉酸類化合物具有促進(jìn)西洋參細(xì)胞和不定根培養(yǎng)物中皂苷含量積累的作用。研究表明，誘導(dǎo)處理后，可以誘導(dǎo)植物抗氧化酶活性增強(qiáng)，保護(hù)植物免受活性氧的損害并減少次生代謝產(chǎn)物的損失[53-55]。JA 及其衍生物可以調(diào)控抗氧化酶活性，提高植物的廣泛防御反應(yīng)和次生代謝物含量[46,56]。淡墨[57]研究了MJ對(duì)三七不定根次生代謝產(chǎn)物的影響，表明MJ刺激后，三七不定根的次生代謝產(chǎn)物與天然三七根的次生代謝產(chǎn)物更為相似，證明MJ可以作為三七不定根有價(jià)值的誘導(dǎo)劑。Li等[25]將誘導(dǎo)得到的三七愈傷組織接種于MS+5 mg·L-1IBA培養(yǎng)基，在黑暗條件下暗培養(yǎng)，4周后可得到不定根。不定根的最優(yōu)培養(yǎng)條件為搖床培養(yǎng)120 r·min-1，5/4 SH培養(yǎng)基+4%蔗糖+3.0 mg·L-1IBA+1.0 mg·L-1NAA。并在此培養(yǎng)條件加下，加入不同濃度的JA和MDJ，分別接種已獲得的不定根。發(fā)現(xiàn)接種后5 d，獲得最高多糖產(chǎn)量。接種后7 d，可獲得最高皂苷產(chǎn)量，5 mg·L-1JA 處理后皂苷總質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高（71.94 mg·g-1），比自然生長的根高出2.09倍，比對(duì)照組高8.45倍，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為140.20 mg·g-1，比對(duì)照組高1.60 倍。MDJ 處理后，皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.88 mg·g-1，比對(duì)照組高2.45 倍，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為139.05 mg·g-1，比對(duì)照組高1.59 倍。可見，JA 和MDJ 都能刺激三七代謝產(chǎn)物的積累，JA處理后的效果優(yōu)于MDJ。

5 問題及展望

三七作為傳統(tǒng)名貴中藥材，應(yīng)用價(jià)值巨大。但其生長周期長、對(duì)生長條件要求苛刻、地理分布狹窄且面臨病蟲害的侵?jǐn)_，這些給三七的種植業(yè)帶來了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。組織培養(yǎng)技術(shù)不僅可以克服這些弊端，還是植物快速繁殖的最佳途徑。通過對(duì)三七組織培養(yǎng)的研究，既可以實(shí)現(xiàn)快速繁殖，又可以生產(chǎn)主要的藥用成分，將補(bǔ)充和替代三七現(xiàn)有資源并繼續(xù)造福人類的有效途徑。目前，在三七的組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)兩大問題：一是愈傷組織增殖過程中使用傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)基時(shí)，三七愈傷組織生長比較緩慢；使用懸浮培養(yǎng)時(shí)，雖然可以快速繁殖但是又容易形成團(tuán)塊狀的聚集體。二是三七愈傷組織形成的體細(xì)胞胚胎分化率低，不能全部分化成同時(shí)具有根和芽的完整植株，所以成苗率較低。如何有效解決這些問題，仍是未來需要繼續(xù)研究的方向。