饒秋華, 劉 洋, 黎 露, 張志燈, 邱 睿, 何肖云, 黃 薇, 羅 欽, 羅土炎

[1.福建省農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所/福建省農產品質量安全重點實驗室，福建 福州 350003；2.福建農林大學動物科學學院(蜂學學院)/海洋研究院/福建省海洋生物技術重點實驗室，福建 福州 350002；3.福州海關技術中心，福建 福州 350003；4.大連海洋大學水產和生命學院，遼寧 大連 116023]

大黃魚(Larimichthyscrocea)隸屬于石首魚科(Sciaenidae)黃魚屬(Larimichthys)，俗稱黃瓜魚.2020年我國人工養(yǎng)殖大黃魚總量達254 062 t[1].大黃魚味道鮮美、肉質細嫩、營養(yǎng)豐富，被譽為我國東海的“四大海產”之一[2].近年來我國人工網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚的病害發(fā)生頻率急劇上升，在很大程度上限制了大黃魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展.造成這一情況發(fā)生的原因主要包括當今養(yǎng)殖環(huán)境不斷發(fā)生變化、海水污染加重、網(wǎng)箱養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大、養(yǎng)殖布局不合理、養(yǎng)殖密度過高等[3].大黃魚內臟白點病是網(wǎng)箱養(yǎng)殖的常見病害之一，死亡率高達70%～80%，給大黃魚養(yǎng)殖帶來了巨大的經濟損失[4].大黃魚內臟白點病的高發(fā)期為冬末和春初，2月份網(wǎng)箱養(yǎng)殖的發(fā)病率較高，水溫為15 ℃時最為流行，發(fā)病周期為1～3個月.大黃魚內臟白點病為慢性細菌病，所有規(guī)格的大黃魚均可感染此病.早期患病大黃魚會出現(xiàn)反應遲鈍等現(xiàn)象，但基本不會死亡，患病后期解剖可見肝臟、腎臟和脾臟等有0.5～3 mm大小不等的白色結節(jié),肌肉失去彈性，故稱此病為內臟白點病[5].已有學者對大黃魚內臟白點病致病菌進行了分離鑒定和致病性研究，其病原菌有殺香魚假單胞菌[6-7]、熒光假單胞菌[8]、惡臭假單胞菌[9]和銅綠假單胞菌[10]等.

假單胞菌(Pseudomonas)是一種專性需氧的革蘭氏陰性、無芽胞、有莢膜桿菌,略彎曲或呈桿狀，菌體大小為(0.5～1) μm×(1.5～4) μm，有端生鞭毛、能運動，絕大多數(shù)菌株的適宜生長溫度為30 ℃，在土壤、淡水和海水環(huán)境中普遍存在，部分菌株可產生熒光色素或紅黃藍綠等水溶性色素.本研究從福建省福州市連江縣某養(yǎng)殖場患病大黃魚體中分離到一株優(yōu)勢菌株，命名為DGZ5.對該菌進行形態(tài)學觀察、生理生化特性鑒定、16S rRNA基因序列分析以及毒力基因檢測、藥物敏感性試驗、致病性試驗，旨在為大黃魚細菌病害防治提供科學依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

患內臟白點病的大黃魚來源于福建省福州市連江縣某養(yǎng)殖場.用于人工回歸感染試驗的健康大黃魚來源于同一養(yǎng)殖場，體重100～150 g，體長10～15 cm，在水溫為19～21 ℃的大圓桶中暫養(yǎng)7 d，觀察期間無發(fā)病和死亡后開始進行人工回歸感染試驗.

BHI瓊脂培養(yǎng)基和LB液體培養(yǎng)基購于北京陸橋技術有限責任公司；全自動微生物鑒定儀及相關試劑購于生物梅里埃公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購于北京莊盟國際生物基因科技有限公司；TaqDNA聚合酶購于TaKaRa生物股份有限公司；抗生素藥敏紙片購于杭州微生物試劑有限公司.試驗所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.

1.2 自然患病魚癥狀和病理切片的觀察

現(xiàn)場觀察病魚的采食、行為特點和臨床癥狀等，采集病魚置于白色搪瓷盤中，檢查病魚體表和內臟組織.取正常大黃魚和患病大黃魚的肝臟、腎臟組織，用Bouin氏液固定24 h，經75%乙醇洗滌數(shù)次，再用不同濃度的乙醇逐級脫水及丙酮脫水，移入二甲苯溶液中透明，石蠟包埋,切片，HE染色后置于顯微鏡下觀察并拍照[11-12].

1.3 病原菌的分離純化

采用醫(yī)用酒精對病魚的體表進行消毒，在無菌條件下解剖患病大黃魚，將明顯感染白點病的肝臟和腎臟等組織劃線接種于BHI瓊脂培養(yǎng)基中，于28 ℃培養(yǎng)48 h后觀察分離菌的生長情況.取培養(yǎng)皿中的優(yōu)勢菌落再次劃線接種到BHI瓊脂培養(yǎng)基中，進行再一次的分離純化，經28 ℃培養(yǎng)48 h后，最后挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，待菌生長至對數(shù)期時，置甘油(-80 ℃)凍存?zhèn)溆?

1.4 病原菌形態(tài)學觀察和生理生化特性鑒定

1.4.1 形態(tài)學觀察 用無菌接種環(huán)蘸取BHI瓊脂培養(yǎng)基上的DGZ5菌苔均勻涂抹在載玻片上進行革蘭氏染色，染色后置于生物顯微鏡下觀察菌株的形態(tài).

1.4.2 生理生化特性鑒定 用無菌接種環(huán)從BHI瓊脂培養(yǎng)基上刮取適量的DGZ5菌苔于滅菌生理鹽水中，充分振蕩混勻，于濁度儀中調制0.5～0.63麥氏濁度的菌懸液.取菌懸液加在鑒定卡中，置于全自動微生物鑒定儀中讀取生理生化特性鑒定結果.

1.5 病原菌16S rRNA基因的PCR擴增

利用細菌基因組提取試劑盒提取DGZ5菌株的總基因組DNA，以基因組DNA為模板，使用細菌通用引物擴增16S rRNA基因序列，將PCR擴增產物提交到生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序.將測序結果提交到NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行BLAST比對，獲取與DGZ5菌株16S rRNA 基因序列相似度較高的序列，使用MEGA 5.0軟件采用鄰接法(NJ)構建系統(tǒng)進化樹，自舉分析(Bootstrap)1 000次重復檢測分子系統(tǒng)樹的置信度.

1.6 病原菌毒力基因的檢測

以DGZ5菌株基因組DNA作為PCR模板，分別對18種毒力基因進行擴增測序.PCR反應體系：1 μL模板、上下游引物各1 μL、25μL 2×TaqPCR Master Mix、22 μL ddH2O.反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s；52～68 ℃退火50 s；72 ℃延伸30 s；72 ℃再延伸10 min.將PCR擴增產物提交到生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序.引物信息如表1所示.

表1 18種毒力基因PCR檢測的引物信息Table 1 PCR primer information of 18 virulence genes

1.7 病原菌人工回歸感染試驗

將健康大黃魚暫養(yǎng)7 d后隨機分成6組，每組30尾.采用腹腔注射法，按照0.5 mL·尾-1的劑量注射不同濃度的菌液感染健康大黃魚.A、B、C、D、E組健康大黃魚分別注射1×109、1×108、1×107、1×106、1×105cfu·mL-1DGZ5菌液，同時設注射0.5 mL·尾-1磷酸鹽緩沖液的對照組，每個試驗組設置3個平行.連續(xù)觀察7 d，記錄大黃魚發(fā)病和死亡情況，計算7 d總平均死亡率.利用SPSS 22軟件參考熊浩明等[18]的方法計算DGZ5菌株對健康大黃魚的半致死濃度(median lethal concentration， LD50).取患病大黃魚的內臟組織進行細菌的分離、培養(yǎng)、鑒定，再次確定致病菌.取人工感染患病大黃魚的肝臟和腎臟組織，按照“1.2”的方法進行病理切片及染色后觀察.

1.8 病原菌抗生素敏感性試驗

采用紙片擴散法(K-B法)鑒定DGZ5菌株對36種抗生素藥物的敏感性，每種抗生素藥物設置3個重復.于28 ℃培養(yǎng)24 h后用游標卡尺測定DGZ5菌株對每種藥物的抑菌圈直徑.取抑菌圈直徑的平均值計算藥物敏感度，根據(jù)歐盟藥敏試驗標準判定菌株對藥物的敏感度[19].質控菌株為ATCC25922大腸埃希氏菌.

2 結果與分析

2.1 病魚癥狀和分離菌的形態(tài)

A：病魚癥狀；B：DGZ5菌株的形態(tài)(標尺:2.0 μm).圖1 病魚癥狀及DGZ5菌株的形態(tài)Fig.1 Symptoms of diseased fish and morphology of strain DGZ5

患病大黃魚體表無明顯變化，但解剖可見其肝臟、脾臟和腎臟出現(xiàn)直徑為0.5～2 mm的白色結節(jié)病灶(圖1A).從典型發(fā)病癥狀的大黃魚肝臟中分離到一株優(yōu)勢菌，命名為DGZ5.該菌在BHI瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，于28 ℃培養(yǎng)48 h后可見直徑為1～3 mm、邊緣整齊、光滑、濕潤、不透明的乳白色圓形菌落.透射電子顯微鏡下觀察可見，DGZ5菌株長1.91～2.39 μm，寬 0.86～1.05 μm，端生1～2根鞭毛(圖1B)，為革蘭氏陰性桿狀細菌.

2.2 分離菌16S rRNA基因序列

測序結果顯示，DGZ5菌株16S rRNA基因序列長度為1 430 bp.使用MAGA 5.0軟件，采用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹.結果(圖2)顯示，DGZ5菌株與殺香魚假單胞菌(PseudomonasplecoglossicidaKC345028.1T)、熒光假單胞菌(PseudomonasfluorescensMN256402.1T)、惡臭假單胞菌(PseudomonasputidaMK849866.1T)聚集在一個分支上，其16S rRNA基因序列的相似度分別為100%、99.8%和99.6%，進一步表明菌株隸屬于假單胞菌.綜上，確定DGZ5菌株為殺香魚假單胞菌.

圖2 DGZ5菌株基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of strain DGZ5

2.3 分離菌毒力基因檢測結果

采用PCR擴增方法對DGZ5菌株的18種毒力基因進行檢測.結果(圖3)顯示，編號為EPB94769.1的基因序列長498 bp、ompA基因序列長714 bp、sigX基因序列長567 bp、flgM基因序列長315 bp、secY基因序列長1 332 bp.測序結果顯示，這些序列與文獻[13-15]中的序列相似度較高，達到97%以上，說明其攜帶secY、ompA、sigX、flgM及編號為EPB94769.1的5種毒力基因.

M:Marker；1：編號為EPB94769.1的基因；2～18依次為ompA、sigX、flgM、secY、RK21_RS10315、plcH、aprA、algD、exoS、exoT、exoU、exoY、toxA、pys、oaclR、norC、dksA基因.圖3 18種毒力基因PCR檢測電泳圖譜Fig.3 Gel electrophoresis of PCR products of 18 virulence genes

2.4 分離菌生理生化特性鑒定結果

對人工感染患病大黃魚體內分離的菌株與自然患病大黃魚肝臟中分離的DGZ5菌株進行生理生化特性鑒定.結果(表2)顯示，分離菌株均為假單胞菌，檢測結果的置信度高.

表2 DGZ5菌株生理生化特性鑒定結果1)Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain DGZ5

2.5 分離菌人工回歸感染試驗結果及病理特征

用不同濃度的DGZ5菌液對健康大黃魚進行人工回歸感染試驗，連續(xù)觀察7 d.結果(表3)顯示：感染3 d后，A組大黃魚全部死亡，總平均死亡率達100%；B、C、D組的大黃魚感染4 d后不再死亡，總平均死亡率依次為77.8%、56.7%、25.6%；E組和對照組在觀察期間未見大黃魚死亡.經計算，DGZ5菌株對大黃魚的LD50為8.07×106cfu·mL-1.

表3 DGZ5菌株人工回歸感染試驗結果Table 3 Artificial infection results of strain DGZ5 to L.crocea

在腹腔注射接種DGZ5菌液后，試驗組大黃魚感染初期表現(xiàn)為游動緩慢、應激反應遲鈍等臨床癥狀；患病或瀕死患病大黃魚的肝臟和腎臟出現(xiàn)白色結節(jié)，與自然發(fā)病大黃魚組織病變相似.此外，在感染患病大黃魚肝臟再次分離得到的致病菌與DGZ5菌株的形態(tài)、生理生化特性一致.可見，本研究分離的DGZ5菌株為導致大黃魚患內臟白點病的病原菌.

與健康大黃魚相比，在人工感染和患病大黃魚的肝臟和腎臟中均可觀察到顯著的組織病理變化，有典型的肉芽腫，并伴有脂肪變性和炎性細胞浸潤等現(xiàn)象.

健康大黃魚肝臟具有色澤一致、質地均勻、組織結構排列清晰的特征，其實質細胞為近似橢圓的多角形細胞，以中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列，部分胰臟組織嵌入肝臟組織中，胰腺細胞間的結締組織經HE染色后呈紫藍色，呈現(xiàn)較強的嗜堿性(圖4A)；患有內臟白點病的大黃魚肝臟呈現(xiàn)明顯的脂肪變性，此即為肉眼觀察到的“白點”，經 HE 染色后可見大量的空泡(圖4B)；健康大黃魚腎小球為毛細血管圍成的血管球，構成腎小管的單層上皮細胞排列緊湊、界限清晰，腎間質組織致密，并與腎小球、腎小管緊密嵌合(圖4C)；患有內臟白點病的大黃魚腎臟病變嚴重，腎小球萎縮變形甚至開始崩解，腎間質出現(xiàn)大面積組織壞死和崩解并形成結節(jié)，部分壞死組織呈淀粉樣變性(圖4D).

A:健康大黃魚肝臟; B:病魚肝臟; C:健康大黃魚腎臟; D:病魚腎臟(箭頭表示淀粉樣變性組織).圖4 病魚肝臟和腎臟組織的病理變化(×100)Fig.4 Pathological changes of liver and kidney tissues of diseased fishes (×100)

2.6 分離菌對抗生素的藥敏性

藥敏試驗結果(表4)顯示：DGZ5菌株對頭孢他啶、慶大霉素、丁胺卡那、新霉素和卡那霉素等12種抗生素藥物高度敏感；對氟苯尼考、米諾環(huán)素、四環(huán)素、頭孢曲松、頭孢哌酮和哌拉西林6種抗生素藥物中度敏感；對青霉素、阿莫西林、氨芐西林和羧芐西林等18種抗生素藥物耐藥.

表4 DGZ5菌株對抗生素藥物的敏感性Table 4 Antibiotics susceptibility of strain DGZ5

3 討論

本研究從患內臟白點病大黃魚肝臟處分離純化出一株優(yōu)勢菌株，命名為DGZ5，通過形態(tài)學觀察、生理生化特性鑒定、16S rRNA基因序列分析確定該菌株隸屬于假單胞菌，鑒定為殺香魚假單胞菌.殺香魚假單胞菌為革蘭氏陰性菌，最早由日本患病的香魚中分離出來.殺香魚假單胞菌除了極少數(shù)能降解污染物而應用到環(huán)境污染治理中[20]，大部分對硬骨魚具有高致病性，導致各種養(yǎng)殖魚類的高死亡率.在國內，殺香魚假單胞菌與海水養(yǎng)殖魚類大黃魚[21]、橙斑石斑魚(Epinepheluscoioides)[22]的“內臟白點病”有關，每年造成數(shù)百萬元的經濟損失.鑒于其對水產養(yǎng)殖業(yè)的巨大影響，殺香魚假單胞菌的生物學特性和致病機制備受關注.

毒力基因在病原菌感染宿主的過程中起著重要作用[23].本研究結果顯示，DGZ5菌株攜帶ompA、sigX、flgM、secY以及編號為EPB94769.1的5種毒力基因.研究表明：ompA基因主要存在于革蘭氏陰性細菌中，在入侵細胞時起黏附作用，是病原菌致病作用的一個重要組成成分[24-25]；sigX基因是細菌DNA 轉錄時的正調控因子，影響膜的流動性以及菌株的營養(yǎng)代謝反應，也與細菌的黏附有關[25-26]；flgM基因能夠參與合成細菌的鞭毛以及其他生物功能活動[26-27]，從而間接地影響致病菌的黏附、定殖、侵襲及生物被膜的形成[16,27].研究表明，與體外培養(yǎng)的殺香魚假單胞菌相比，感染橙斑石斑魚的殺香魚假單胞菌的轉錄調節(jié)基因RK21_RS10315[16]、RNA聚合酶δ因子基因sigX、鞭毛生物合成抗δ因子基因flgM[14]及大黃魚脾臟中殺香魚假單胞菌的前蛋白轉位酶亞基基因secY[15]，其表達量均顯著提高，且感染了攜帶以上基因的沉默菌株的橙斑石斑魚或大黃魚的死亡率均有所下降，表明以上基因的表達、調控與殺香魚假單胞菌發(fā)揮毒力的作用有關.DGZ5菌株攜帶了5種毒力基因，為該菌株的致病性提供了生物學基礎.嚴良[13]分離得到了一株殺香魚假單胞菌LQJ06，毒力基因檢測結果顯示，其攜帶flgM、sigX、RK21_RS10315及編號為P2(EPB94930.1)的OmpA基因片段，其中，flgM基因為重要的毒力因子，不同的是DGZ5菌株未攜帶RK21_RS10315基因.DGZ5菌株亦攜帶了flgM毒力基因，測序結果顯示與報道的flgM基因[14]呈現(xiàn)97%的相似性，可能是其重要的致病因子.通過對DGZ5菌株毒力基因的檢測，能夠更加全面地了解其致病機制和致病性.

殺香魚假單胞菌是具有廣泛宿主的高致病性病原菌.本研究分離得到的DGZ5菌株對大黃魚的LD50為8.07×106cfu·mL-1，嚴良[13]分離得到的LQJ06菌株對斑馬魚的LD50為2.98×106cfu·尾-1，喬遷等[28]分離得到的BY0081菌株對劍尾魚的LD50為2.82×105cfu·g-1，均表明殺香魚假單胞菌對魚類具有較強的致病性，感染后的魚類通常表現(xiàn)為嗜睡、食欲不振、定向障礙、腹部腫脹、腹水嚴重、脾臟組織表面覆蓋大量白斑等多種癥狀.患病魚類的肝臟和腎臟發(fā)生明顯的組織病理變化.如：Sun et al[29]發(fā)現(xiàn)，感染殺香魚假單胞菌的澳洲肺魚腎臟腎小球縮小甚至塌陷，鮑曼囊間距增大，肝臟脂肪變性、壞死；陳卓等[12]發(fā)現(xiàn)，殺香魚假單胞菌感染后會破壞大黃魚內臟組織，內臟組織的損害程度與殺香魚假單胞菌的分布有關.本研究中，DGZ5菌株感染后，在大黃魚肝臟和腎臟發(fā)現(xiàn)典型的“白點”，內臟發(fā)生了顯著的組織病理學變化，此結果與Luo et al[30]的研究結果一致.

DGZ5菌株對所測試的36種抗生素藥物具有不同程度的敏感性，對青霉素、阿莫西林和氨芐西林等18種抗生素藥物耐藥，對頭孢他啶、慶大霉素、丁胺卡那、新霉素和卡那霉素等12種抗生素藥物高度敏感，DGZ5菌株對抗生素的敏感性與嚴良[13]分離得到的LQJ06菌株大致相同，只是DGZ5菌株對氯霉素敏感，而LQJ06菌株則耐藥.游宇[31]對福建大黃魚內臟白點病病原菌的耐藥性狀況進行了分析，葛明峰等[32]也對寧波市大黃魚細菌性病原菌的藥敏特性進行檢測.病原菌耐藥性監(jiān)測對科學精準用藥，推動水產綠色健康養(yǎng)殖及用藥減量具有十分重要的意義.目前，聯(lián)合國糧農組織(FAO)漁業(yè)委員會禁止氯霉素、克林霉素和四環(huán)素等藥物用于魚病防治，這提示養(yǎng)殖戶和生產人員在大黃魚養(yǎng)殖的過程中，要在國家允許的藥物使用范圍內，選取敏感藥物用于病害防治.