張寶玉, 彭 政, 張 娟, 李江華

(1.江南大學生物工程學院；2.江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室/未來食品科學中心；3.江南大學食品合成生物技術教育部工程研究中心，江蘇 無錫 214122)

禽肉加工業(yè)的蓬勃發(fā)展導致全世界范圍內每年產生約幾百萬噸羽毛廢棄物[1]，這些廢棄物的處理成為亟待解決的問題.羽毛中含有超過85%的粗蛋白和各種必需氨基酸，還含有維生素和生長因子等[2].羽毛中的蛋白質主要是角蛋白，角蛋白富含胱氨酸，會形成大量二硫鍵，使得羽毛具有堅硬的穩(wěn)定結構而難以被降解[3].

目前，羽毛的加工處理方法主要有高溫高壓水解法、化學法、酶法和微生物法.其中：高溫高壓水解法和化學法存在能耗高、污染大和水解產物中氨基酸破壞嚴重等問題[4-5]；酶法和微生物法因環(huán)境友好、能耗低和水解產物營養(yǎng)價值高而被廣泛應用.自然界中能降解羽毛的微生物主要有芽孢桿菌屬(Bacillus)、曲霉屬(Aspergillus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)等[6-8].這些微生物通過產角蛋白酶的多酶降解體系和自身代謝活動，實現(xiàn)對羽毛的降解[9].Huang et al[10]發(fā)現(xiàn)，假單胞菌H11在48 h內對10 g·L-1羽毛的降解率為88.8%；Li et al[11]篩選到一株鏈霉菌SCUT-3，其可在36 h內完全降解10 g·L-1的羽毛.但是，這些菌株可降解的羽毛量十分有限，降解效率低，無法滿足工業(yè)應用需求.Peng et al[12]利用角蛋白酶和亞硫酸鈉協(xié)同作用降解羽毛，12 h后可觀察到100 g·L-1羽毛被完全水解，且產物中的氨基酸轉化率達56.6%.郝魯江等[13]將堿性蛋白酶和角蛋白酶復配，酶解36 h后10 g·L-1羽毛的降解率達到79.8%.但是，基于角蛋白酶的酶解需要化學還原劑或其他多種蛋白酶的協(xié)同作用，且水解產物的脫鹽和酶制劑的成本較高，限制了其在工業(yè)上的廣泛應用.地衣芽孢桿菌(B.licheniformis) BBE11-1為本實驗室篩選的一株能分泌角蛋白酶的菌株，且其具有半胱氨酸代謝和亞硫酸鹽分泌途徑，可為羽毛降解提供還原力[14];角蛋白酶KerZ1是本實驗室構建的工程菌株WB600-pP43NMK-ker的發(fā)酵產物[12].

本研究擬利用B.licheniformisBBE11-1和角蛋白酶KerZ1的協(xié)同作用水解羽毛，通過單因素和正交試驗探究B.licheniformisBBE11-1種子液培養(yǎng)時間、接種量以及角蛋白酶添加時間、酶活性、水解溫度、pH和水解時間對羽毛降解效果的影響，以期為羽毛降解工藝的開發(fā)提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

羽毛：鴨毛和雞毛都收集于江蘇省無錫市家禽市場，用自來水沖洗后，經121 ℃高溫處理30 min，置于65 ℃烘箱中干燥24 h，待用.

菌株：B.licheniformisBBE11-1(CCTCC NO.M2011319)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis) WB600由本實驗室保藏；角蛋白酶重組菌株WB600-pP43NMK-ker由本實驗室構建，其基因來源于B.licheniformisBBE11-1的角蛋白酶基因ker(NCBI數(shù)據(jù)庫登錄號：JX504681).

可溶性角蛋白，購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；酵母粉、蛋白胨，購自OXIOD公司；其他試劑購自國藥集團化學試劑有限公司.

LB液體培養(yǎng)基：酵母粉5.0 g·L-1、蛋白胨10.0 g·L-1、氯化鈉10.0 g·L-1，pH 7.0，121 ℃滅菌15 min.發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖20.0 g·L-1、酵母粉10.0 g·L-1、蛋白胨20.0 g·L-1、Na2HPO4·12H2O 6.0 g·L-1、KH2PO43.0 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.3 g·L-1，pH 7.0，121 ℃滅菌15 min.羽毛培養(yǎng)基：雞毛或鴨毛100.0 g·L-1、KH2PO40.7 g·L-1、K2HPO41.4 g·L-1、NaCl 0.5 g·L-1、MgSO40.1 g·L-1，pH 7.0，121 ℃滅菌15 min.

1.2 儀器與設備

恒溫培養(yǎng)箱，購自上海躍進醫(yī)療器械有限公司；恒溫搖床，購自上海知楚儀器有限公司；GI54DWS型滅菌器，購自美國Zealway公司；臺式高速離心機，購自德國Eppendorf公司；UVmini-1280紫外分光光度計，購自島津公司；pH計，購自美國OHAUS公司.

1.3 材料制備和指標測定

1.3.1 角蛋白酶KerZ1粗酶液制備 取保藏于超低溫冰箱的菌株WB600-pP43NMK-ker，于LB平板(含50 mg·L-1卡那霉素)上劃線活化，37 ℃倒置培養(yǎng).挑取單菌落至2 mL LB液體培養(yǎng)基(含50 mg·L-1卡那霉素)中，37 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)12～16 h，按5%(體積分數(shù))接種量接種至250 mL三角瓶[含50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基(含50 mg·L-1卡那霉素)]中，37 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)24 h.發(fā)酵菌液經8 000 r·min-1離心10 min，上清液即為粗酶液.

1.3.2 菌株B.licheniformisBBE11-1種子液培養(yǎng) 取保藏于超低溫冰箱的B.licheniformisBBE11-1甘油菌，于LB平板上劃線活化，37 ℃倒置培養(yǎng).挑取單菌落至2 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)12～16 h，即為菌株B.licheniformisBBE11-1種子液.

1.3.3 角蛋白酶活性測定 參考冒鑫哲[15]的方法：將150 μL 50 mmol·L-1Gly-NaOH 緩沖液(pH 9.0)、100 μL 2.5%(體積分數(shù))可溶性角蛋白和50 μL稀釋200倍的粗酶液混合均勻，于60 ℃下反應20 min，再加入200 μL 4%(質量分數(shù))三氯乙酸終止反應，室溫下8 000 r·min-1離心3 min；取200 μL上清液，加1 mL 4%(質量分數(shù))Na2CO3和200 μL福林酚試劑混勻，50 ℃顯色10 min，測定其在660 nm處的光密度.對照組中先將粗酶液與三氯乙酸混合再加可溶性角蛋白，其余操作與處理組相同.

角蛋白酶活性定義：在660 nm處光密度值每分鐘增加0.001為一個酶活性單位(U).

1.3.4 羽毛降解率計算 羽毛降解率按照減重法[16]計算：羽毛水解完成后，經濾紙過濾，殘渣用蒸餾水沖洗2～3次，65 ℃烘干24 h，稱重，計算減重和降解率.

(1)

式中：A為初始羽毛干重(g)；B為降解后羽毛殘渣干重(g).

1.3.5 氨基酸含量測定 使用氨基酸分析儀(日立L-8900，日本)檢測羽毛水解產物上清液中的氨基酸含量.將羽毛水解產物過濾獲得水解液，8 000 r·min-1離心10 min，保留上清液，等體積加入10%(質量分數(shù))磺基水楊酸，混合均勻，4 ℃靜置4 h，12 000 r·min-1離心10 min；取上清液，加入0.02 mol·L-1HCl(GR)稀釋至0.1 mmol·L-1，通過0.22 μm的膜濾器過濾至樣品瓶，等待上機檢測.

1.4 菌株B.licheniformis BBE11-1和角蛋白酶單獨水解

1.4.1 菌株B.licheniformisBBE11-1單獨水解 將活化后的B.licheniformisBBE11-1種子液按10%(體積分數(shù))接種量接種至羽毛培養(yǎng)基，37 ℃、220 r·min-1水解36 h，計算羽毛降解率.

1.4.2 角蛋白酶單獨水解 將羽毛按照100 g·L-1的量添加到角蛋白酶粗酶液(角蛋白酶活性100 kU·mL-1)中，在60 ℃、pH 10的條件下水解24 h，計算羽毛降解率.

1.5 菌株B.licheniformis BBE11-1和角蛋白酶聯(lián)合水解

1.5.1 菌株B.licheniformisBBE11-1種子液培養(yǎng)時間優(yōu)化 取培養(yǎng)6、8、10、12、14、16 h的B.licheniformisBBE11-1種子液，接種至羽毛培養(yǎng)基，隨后添加終酶活為30 kU·mL-1的角蛋白酶液，37 ℃、220 r·min-1條件下水解24 h后，計算羽毛降解率.

1.5.2 菌株B.licheniformisBBE11-1接種量優(yōu)化 將活化后的B.licheniformisBBE11-1種子液分別按5%、10%、15%、20%、25%、30%的接種量接種至羽毛培養(yǎng)基，8 h后添加終酶活為30 kU·mL-1的角蛋白酶液，37 ℃、220 r·min-1條件下水解24 h后，計算羽毛降解率.

1.5.3 角蛋白酶添加時間優(yōu)化 分別在B.licheniformisBBE11-1種子液接種至羽毛培養(yǎng)基0、4、8、12、16 h后，添加終酶活為30 kU·mL-1的角蛋白酶液，37 ℃、220 r·min-1條件下水解24 h后，計算羽毛降解率.

1.5.4 角蛋白酶活性優(yōu)化 將B.licheniformisBBE11-1種子液接種至羽毛培養(yǎng)基，再分別按照低(5 kU·mL-1)、中(20和50 kU·mL-1)、高(100 kU·mL-1)終酶活水平添加角蛋白酶液，37 ℃、220 r·min-1條件下水解24 h后，計算羽毛降解率.

1.5.5 菌株B.licheniformisBBE11-1和角蛋白酶聯(lián)合水解條件的優(yōu)化 采用L16(45)正交設計，以降解率為指標確定菌-酶聯(lián)合水解條件，各因素水平見表1.通過正交試驗獲得最佳水解條件，并測定該條件下的羽毛降解率.

1.6 水解液對WB600-pP43NMK-ker菌株生長及其酶活性的影響測定

設置2種處理：將LB培養(yǎng)基中的酵母粉和蛋白胨替換成10%(體積分數(shù))無菌羽毛水解液；在LB培養(yǎng)基中添加10%(體積分數(shù))無菌羽毛水解液.每個處理設置3個重復，對照組添加等量無菌水，其余操作同處理組.挑取WB600-pP43NMK-ker單菌落至2 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)12 h，按5%接種量分別接種至上述培養(yǎng)基，37 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)24 h，測定D600 nm值和發(fā)酵上清液中的角蛋白酶活性.

表1 正交試驗各因素水平的設計Table 1 Design of factor level in the orthogonal test

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 24.0軟件的ANOVA和Duncan′s方法(α=0.05)進行統(tǒng)計分析，使用Origin 2019軟件繪圖.所有試驗均設置3組重復，結果表示為平均值±標準差.

2 結果與分析

2.1 菌株B.licheniformis BBE11-1和角蛋白酶單獨水解效果

B.licheniformisBBE11-1對鴨毛和雞毛的降解率分別為59.0%±2.3%和35.5%±0.9%.水解前、后形態(tài)見圖1A、1C，羽毛降解程度較低.角蛋白酶KerZ1對鴨毛和雞毛的降解率分別為56.0%±1.4%和35.0%±1.7%，鴨毛被水解成液體狀但不完全(圖1B)，雞毛呈糊絮狀但仍可見明顯羽毛纖維(圖1D)，水解效果有待提高.

A.B.licheniformis BBE11-1單獨水解鴨毛前、后;B.角蛋白酶單獨水解鴨毛前、后;C.B.licheniformis BBE11-1單獨水解雞毛前、后;D.角蛋白酶單獨水解雞毛前、后.圖1 B.licheniformis BBE11-1和角蛋白酶單獨水解羽毛效果Fig.1 Degradation effect of B.licheniformis BBE11-1 and keratinase alone

2.2 菌株B.licheniformis BBE11-1和角蛋白酶聯(lián)合水解效果

2.2.1 菌株B.licheniformisBBE11-1種子液培養(yǎng)時間的優(yōu)化 由圖2可知，不同培養(yǎng)時間的種子液對鴨毛和雞毛的降解率分別為52.00%～57.33%和55.33%～58.67%.為縮短生產周期和降低成本，后續(xù)B.licheniformisBBE11-1種子液培養(yǎng)時間定為6 h.

2.2.2 菌株B.licheniformisBBE11-1接種量的優(yōu)化 由圖3可知：B.licheniformisBBE11-1接種量在5%～20%時，鴨毛降解率為60%～64%，雞毛降解率為52%～55%；隨著菌株B.licheniformisBBE11-1接種量的增加，羽毛降解率總體上呈下降趨勢.過高的菌株接種量一方面帶入了部分營養(yǎng)成分，不利于形成營養(yǎng)脅迫的羽毛降解環(huán)境，另一方面會造成溶氧不足，影響酶的合成[17].因此，正交試驗中接種量范圍選擇小于10%.

2.2.3 角蛋白酶添加時間的優(yōu)化 由圖4可以看出：降解鴨毛時角蛋白酶最佳添加時間為B.licheniformisBBE11-1種子液接種至羽毛培養(yǎng)基4～12 h，降解率為62%～64%；降解雞毛時角蛋白酶最佳添加時間為B.licheniformisBBE11-1種子液接種至羽毛培養(yǎng)基0～8 h，降解率為54%～60%.為了操作便利和簡化工序，選擇0 h添加角蛋白酶，即在接種B.licheniformisBBE11-1種子液的同時添加角蛋白酶.

柱上不同字母表示不同時間之間有顯著差異(P<0.05).圖2 B.licheniformis BBE11-1種子液培養(yǎng)時間對降解率的影響Fig.2 Effect of B.licheniformis BBE11-1 culture time on degradation rate

2.2.4 角蛋白酶活性的優(yōu)化 由圖5可知，角蛋白酶活性在5～100 kU·mL-1時，羽毛降解率隨角蛋白酶活性升高呈先增大后減小的趨勢.在低酶活水平(5 kU·mL-1)時，鴨毛和雞毛降解率最低，分別為31.33%±0.9%和44.67%±1.1%；在中酶活水平(20和50 kU·mL-1)時，降解率最高，鴨毛在酶活性20 kU·mL-1時降解率達66.67%±1.4%，雞毛在酶活性50 kU·mL-1時降解率為61.33%±0.8%；在高酶活水平(100 kU·mL-1)時，鴨毛和雞毛降解率略低于中酶活水平.可見，在菌-酶聯(lián)合降解羽毛體系中，并非角蛋白酶活性越高越好，這與之前的報道[17]一致.因此，選擇20～50 kU·mL-1酶活性進行后續(xù)的正交試驗.

柱上不同字母表示不同添加時間之間有顯著差異(P<0.05).圖4 角蛋白酶添加時間對降解率的影響Fig.4 Effect of keratinase adding time on degradation rate

2.2.5 聯(lián)合水解正交試驗結果 根據(jù)表2中K值大小，鴨毛降解條件的最佳組合為A2B4C4D4E4，即溫度40 ℃、pH 10、角蛋白酶活性50 kU·mL-1、B.licheniformisBBE11-1接種量10%、水解時間36 h.該條件下的鴨毛降解率達74.0%±1.2%，較KerZ1和B.licheniformisBBE11-1單獨水解分別提高了18.0%和15.0%.雞毛降解條件的最佳組合為A2B4C2D3E3，即溫度40 ℃、pH 10、角蛋白酶活性30 kU·mL-1、B.licheniformisBBE11-1接種量8%、水解時間32 h.該條件下的雞毛降解率為64.0%±0.7%，比KerZ1和B.licheniformisBBE11-1單獨水解提高了29.0%和28.5%.

2.3 羽毛水解液中的氨基酸含量

由表3可知，水解液中檢測到常見氨基酸15種.鴨毛水解液中氨基酸總量達7 472.33 mg·L-1，其中，絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)含量較高；雞毛水解液中氨基酸總量為5 589.67 mg·L-1，其中，纈氨酸、亮氨酸、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸、賴氨酸(Lys)含量較高.可見，羽毛水解產物中氨基酸種類豐富且含量較高.

表2 正交試驗設計及結果Table 2 Design and results of orthogonal test

表3 羽毛水解液中各氨基酸含量Table 3 Contents of amino acids in feather hydrolysate mg·L-1

2.4 羽毛水解液對WB600-pP43NMK-ker菌株生長及其角蛋白酶活性的影響

由圖6可知，羽毛水解液能促進WB600-pP43NMK-ker菌株生長和提高其角蛋白酶活性，這與曹亮亮等[18]的研究結果類似.在LB培養(yǎng)基中添加10%羽毛水解液后，WB600-pP43NMK-ker菌體密度和角蛋白酶活性均顯著提高；用10%羽毛水解液代替LB培養(yǎng)基中的碳、氮源后，WB600-pP43NMK-ker菌體密度和角蛋白酶活性與對照無顯著差異.羽毛水解液中豐富的氨基酸可為菌株的生長和代謝提供營養(yǎng)物質，因此，羽毛水解液可作為培養(yǎng)基添加成分，甚至可以替代蛋白胨、酵母粉等昂貴成分，大幅降低菌株培養(yǎng)成本.此外，羽毛降解產物富含氨基酸，還可以作為生物肥料[19]、飼料添加成分[20]等，具廣闊應用前景.

3 討論

微生物降解羽毛角蛋白一般包括3個步驟：變性、分解和轉氨基作用[21]，分別起到破壞二硫鍵、水解角蛋白酶、轉化小分子多肽和氨基酸的作用，且轉氨基作用與蛋白水解程度相關.降解過程一般發(fā)生在營養(yǎng)脅迫條件下[22]，并且在該條件下產胞外蛋白酶能力顯著提高.杜永凱[23]指出，具角蛋白降解能力的菌株B.amyloliquefaciensACCC 19735胞外蛋白中除含角蛋白酶外，還含有肽酶、二硫鍵還原酶、氧化還原酶、氨基酸代謝相關酶等.Liang et al[24]利用基因組和轉錄組對羽毛培養(yǎng)基和非羽毛培養(yǎng)基的樣本進行測序分析，發(fā)現(xiàn)兩種條件下差異表達上調的基因主要為胞外蛋白酶、代謝相關基因、跨膜轉運相關基因、膜蛋白等.可見，微生物降解羽毛是一個以角蛋白酶降解為主的多酶復合降解體系，微生物在產生大量蛋白酶降解羽毛的同時將其轉化為自身生長所需的營養(yǎng)物質.B.licheniformisBBE11-1已被證實在以羽毛為碳、氮源的培養(yǎng)基中可以將半胱氨酸轉化成亞硫酸鹽并轉運至細胞外，起到破壞二硫鍵的作用，進而與自身分泌的角蛋白酶協(xié)同作用降解羽毛[14].但是，其分泌的角蛋白酶活性不高，導致降解羽毛的能力不強.角蛋白酶由于缺乏還原力無法高效降解羽毛，即使是高酶活的重組菌效果也不盡如人意[11].本實驗室前期研究表明，角蛋白酶KerZ1與亞硫酸鈉協(xié)同作用能實現(xiàn)對羽毛的高效降解[12].

1.LB培養(yǎng)基中添加10%(體積分數(shù))鴨毛水解液；2.LB培養(yǎng)基中添加10%(體積分數(shù))雞毛水解液；3.10%(體積分數(shù))鴨毛水解液替代LB培養(yǎng)基中的碳、氮源；4.10%(體積分數(shù))雞毛水解液替代LB培養(yǎng)基中的碳、氮源；CK. LB培養(yǎng)基中添加10%(體積分數(shù))無菌水.圖6 水解液對WB600-pP43NMK-ker菌株生長(A)及其角蛋白酶活性(B)的影響Fig.6 Effect of hydrolysate on WB600-pP43NMK-ker growth (A) and keratinase activity (B)

微生物和角蛋白酶聯(lián)合降解羽毛是一種可行的方法.Mazu Sabirath Shanti et al[17]研究表明，蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)和角蛋白酶聯(lián)合作用5 d可降解25 g·L-1的雞羽毛，且水解產物可用于水產養(yǎng)殖.本研究中，B.licheniformisBBE11-1與角蛋白酶KerZ1聯(lián)合作用32～36 h可實現(xiàn)對100 g·L-1羽毛64.0%～74.0%的降解率，降解效率高，且操作過程簡單、所需能耗低.另外，羽毛水解產物可以促進菌株WB600-pP43NMK-ker的生長和產酶能力.然而，B.licheniformisBBE11-1在整個降解過程中除了將亞硫酸鹽轉運至細胞外，是否還提供了其他還原力，如二硫鍵還原酶等，目前還不明確.因此，今后除繼續(xù)優(yōu)化角蛋白酶的性能外，如酶活水平、熱穩(wěn)定性等，深入解析微生物對羽毛的降解機制，挖掘關鍵基因、酶等，也是提高羽毛降解率的重要研究方向.