鄧翔文, 鄭婷婷, 陳 璐, 王夢(mèng)竹, 趙夢(mèng)詩(shī), 黃小紅,, 鄧 輝,

[1.中西獸醫(yī)結(jié)合與動(dòng)物保健福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 福州 350002;2.福建省獸醫(yī)中藥與動(dòng)物保健重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(福建農(nóng)林大學(xué)), 福建 福州 350002]

自20世紀(jì)40年代青霉素被運(yùn)用于臨床治療以來(lái)，抗生素的使用歷史已有80余年.然而，抗生素的長(zhǎng)時(shí)間及廣泛應(yīng)用使得細(xì)菌耐藥性成為當(dāng)今人類社會(huì)面臨的主要健康問(wèn)題之一，并且臨床對(duì)抗生素的不合理使用加速了細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)和傳播[1].大腸桿菌(Escherichiacoli)又稱大腸埃希菌，為革蘭氏陰性菌，定殖于人類和動(dòng)物腸道內(nèi)，在一定條件下可以引起人類和動(dòng)物胃腸道、尿道等多種局部組織器官感染[2].近年來(lái)研究表明，大腸桿菌對(duì)抗生素類藥物極易產(chǎn)生耐藥性，大腸桿菌耐藥性的出現(xiàn)增加了臨床治療的難度及對(duì)人類健康的危害[3].隨著寵物數(shù)量的日漸增多，寵物與人類之間的頻繁或親密接觸增加了將耐藥細(xì)菌及耐藥基因傳播給人類的風(fēng)險(xiǎn)，因此，寵物源細(xì)菌耐藥性調(diào)查對(duì)加強(qiáng)寵物用藥管理并保證人類健康具有重要意義.不僅國(guó)外重視研究寵物源大腸桿菌的耐藥問(wèn)題，在我國(guó)也有多個(gè)地區(qū)開展了針對(duì)寵物源大腸桿菌的耐藥性研究，吉林、成都、廣州、石河子等地[4-6]發(fā)現(xiàn)寵物攜帶有大量的耐藥菌，但福州地區(qū)關(guān)于此類相關(guān)研究報(bào)道相對(duì)較少.本研究以福州地區(qū)分離的寵物犬源大腸桿菌為研究對(duì)象，調(diào)查寵物源大腸桿菌對(duì)臨床上常見抗菌藥物的耐藥情況及其相關(guān)耐藥基因的流行情況，旨在為避免耐藥性傳播，并制定臨床合理用藥方案及相關(guān)政策提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品和菌株 2019年10月從福建農(nóng)林大學(xué)校寵物醫(yī)院采集寵物犬肛拭子樣品50份(健康犬23份、患病犬27份).質(zhì)控菌大腸桿菌ATCC 25922由本實(shí)驗(yàn)室保存.

1.1.2 藥物 頭孢噻呋、頭孢他啶、美羅培南、慶大霉素、阿米卡星、卡那霉素、四環(huán)素、氟苯尼考、阿奇霉素、多黏菌素E、環(huán)丙沙星、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司.

1.1.3 培養(yǎng)基 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、水解酪蛋白(MH)肉湯培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司.

1.1.4 細(xì)菌生化鑒定管 腸桿菌科細(xì)菌生化編碼微量鑒定管(11種×15支)購(gòu)自杭州天河微生物試劑有限公司.

1.1.5 主要試劑與耗材 瓊脂糖購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；核酸染料(EB)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；10×rTaqBuffer、dNTP Mixture、rTaq、DL2000 DNA Marker(50 ng·μL-1)、6×Loading Buffer購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；細(xì)菌培養(yǎng)皿(90 mm)購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司.

1.1.6 主要儀器設(shè)備 超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司；PCR儀、電泳凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司；電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離鑒定 將采集的肛拭子樣品置3～5 mL LB肉湯培養(yǎng)基中，于 37 ℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)16～18 h，用接種環(huán)蘸取增菌液在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上劃線，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，挑取紅色不透明的單菌落再次劃線培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行純化.將純化后的待檢菌株接種于伊紅美蘭和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基中，觀察菌落形態(tài)和培養(yǎng)基顏色的變化,并采用腸桿菌科細(xì)菌生化編碼微量鑒定管進(jìn)行細(xì)菌鑒定.經(jīng)鑒定的大腸桿菌菌株置30%甘油肉湯培養(yǎng)基(-80 ℃)中保存待用.

1.2.2 最小抑菌濃度的測(cè)定 根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)標(biāo)準(zhǔn)采用瓊脂二倍稀釋法測(cè)定12種抗菌藥物對(duì)待檢菌株的最小抑菌濃度.挑取純化后的單菌落于2 mL新鮮的MH肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)4～6 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期.用滅菌的MH肉湯培養(yǎng)基將菌液稀釋至1×108CFU·mL-1.

采用二倍稀釋法將各抗菌藥物在空白平皿上稀釋至所需要的各個(gè)濃度梯度.將9倍于藥液量的高壓滅菌MH瓊脂加入到各平皿中，混勻.用多點(diǎn)接種儀將稀釋好的菌液接種到MH瓊脂平板上，待菌液晾干，于37 ℃倒置培養(yǎng)16～18 h后觀察結(jié)果.按照CLSI[7]規(guī)定的敏感(susceptible, S)、中介(intermediate, I)、 耐藥(resistance, R)折點(diǎn)值范圍判斷結(jié)果(表1).

1.2.3 DNA模板的提取 采用水煮法制備細(xì)菌基因組模板.取單菌落于3 mL滅菌的LB肉湯培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，于12 000 r·min-1離心3 min,吸棄上清，收集菌體沉淀.在收集的菌體沉淀中加入100 μL滅菌雙蒸水重懸菌體，于100 ℃水浴10 min，冰浴5 min，于12 000 r·min-1離心10 min，取上清轉(zhuǎn)移至1.5 mL無(wú)菌離心管中，置-20 ℃存放.

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)1)Table 1 Breakpoints for antimicrobial susceptibility test

1.2.4 耐藥基因的檢測(cè) 針對(duì)福建農(nóng)林大學(xué)校寵物醫(yī)院寵物犬常用的四環(huán)素類、氟喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類3類抗菌藥物的臨床用藥情況，采用PCR檢測(cè)此3類共24種耐藥基因的流行情況.耐藥基因特異性引物序列和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度如表2所示.設(shè)置25 μL的反應(yīng)體系，包括2 μL模板DNA、上下游引物各0.5 μL、2.5 μL 10×rTaqBuffer、2 μL dNTP Mixture、0.5 μL rTaq，用滅菌 ddH2O加至25 μL.PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存.供試引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.

表2 耐藥基因PCR檢測(cè)的引物序列 Table 2 Sequences of primers used to screen resistance genes

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離鑒定

從福建農(nóng)林大學(xué)校寵物醫(yī)院50份寵物犬肛拭子樣品中分離得到大腸桿菌50株，分離率達(dá)100%.其中，健康犬23株，患病犬27株.

2.2 藥物敏感性

大腸桿菌對(duì)各類抗菌藥物的耐藥率(表3)顯示，除對(duì)美羅培南和甲氧芐啶/磺胺甲噁唑敏感外，所有菌株均對(duì)其余抗菌藥物呈現(xiàn)不同程度的耐藥.其中，對(duì)氟苯尼考和四環(huán)素的耐藥率較高，分別達(dá)86%、50%；對(duì)慶大霉素、環(huán)丙沙星、卡那霉素、頭孢噻呋、阿奇霉素、頭孢他啶的耐藥率為10%～30%，對(duì)阿米卡星和多黏菌素E的耐藥率均為4%.除美羅培南、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑、多黏菌素E外，患病犬源大腸桿菌對(duì)其余抗菌藥物的耐藥率均高于健康犬.

表3 50株大腸桿菌的耐藥性Table 3 Antimicrobial resistance rates of 50 E.coli isolates

多重耐藥性是指微生物對(duì)3類或3類以上抗生素具有耐藥性的現(xiàn)象.大腸桿菌多重耐藥性分析結(jié)果(表4)顯示，在50株分離菌中，多重耐藥菌數(shù)為20株，耐藥率為40%，其中，14株為患病犬源菌，6株為健康犬源菌.患病犬源菌多重耐藥率(14/27,51.9%)顯著高于健康犬源菌(6/23,26.1%)，其中，5株6重耐藥菌均來(lái)源于患病犬.

表4 50株大腸桿菌的多重耐藥性Table 4 Multi-drug resistance of 50 E.coli isolates

耐藥基因檢測(cè)結(jié)果(表5)顯示：tet(A)的檢出率最高，達(dá)28%；其次是blaTEM(24%)、qnrS(18%)、qnrB(14%)、oqxA(14%)；tet(M)、tet(G)、aac(6′)-Ib-cr、blaSHV、blaCMY的檢出率均低于10%.blaCTX-M、tet(B)、tet(C)、tet(O)、tet(Q)、tet(W)、qnrA、qnrC、qnrD、qepA、oqxB均未檢出.患病犬源大腸桿菌β-內(nèi)酰胺類和四環(huán)素類耐藥基因的檢出率均高于健康犬源菌；而氟喹諾酮類耐藥基因除oqxA外，健康犬源菌的檢出率均比患病犬源菌高.

3 討論

本研究在2019年從福建農(nóng)林大學(xué)校寵物醫(yī)院的寵物犬源肛拭子樣品中分離到50株大腸桿菌.藥物敏感性檢測(cè)結(jié)果顯示，50株大腸桿菌中有47株(耐藥率94%)對(duì)12種抗菌藥物有不同程度的耐藥性，與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)相比，對(duì)四環(huán)素、慶大霉素、阿米卡星、美羅培南的耐藥率與烏魯木齊和揚(yáng)州地區(qū)所報(bào)道的寵物源大腸桿菌相似[17-18]；對(duì)頭孢噻呋、阿米卡星、卡那霉素的耐藥率低于鄭州和廣州地區(qū)[19-20].本研究中，寵物源大腸桿菌分離株對(duì)氟苯尼考的耐藥率高達(dá)86%，均高于國(guó)內(nèi)其他地區(qū)[1,19-20]，原因可能是近幾年氟苯尼考作為抗菌藥物在寵物犬臨床上的廣泛使用.目前國(guó)外也有對(duì)寵物源大腸桿菌耐藥性的研究，如：丹麥犬源大腸桿菌全部對(duì)環(huán)丙沙星、頭孢噻呋、慶大霉素、氟苯尼考敏感[21]；2017年，澳大利亞犬源大腸桿菌對(duì)四環(huán)素的耐藥率不足15%，對(duì)環(huán)丙沙星和慶大霉素的耐藥率不足10%，對(duì)阿米卡星的耐藥率為1.6%[22]，遠(yuǎn)低于國(guó)內(nèi)寵物源大腸桿菌的耐藥率，表明國(guó)內(nèi)寵物臨床用藥需進(jìn)一步規(guī)范.本研究分離的50株寵物犬源大腸桿菌有20株(耐藥率40%)存在多重耐藥的現(xiàn)象，健康犬和患病犬的多重耐藥率分別為26.1%、51.9%，低于國(guó)內(nèi)其他地區(qū)，但比國(guó)外寵物源大腸桿菌多重耐藥情況嚴(yán)重[23-25].此外，9種抗菌藥物敏感檢測(cè)結(jié)果顯示，患病犬源大腸桿菌的耐藥率均高于健康犬源菌，表明寵物在患病后使用抗生素會(huì)增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性.

表5 50株大腸桿菌耐藥基因的檢出率Table 5 Detection rates of resistance genes in 50 E.coli isolates

根據(jù)福建農(nóng)林大學(xué)校寵物醫(yī)院臨床用藥情況，本研究對(duì)β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氟喹諾酮類3類抗菌藥物共24種耐藥基因進(jìn)行了檢測(cè)，共檢出10種耐藥基因.其中，β-內(nèi)酰胺類的耐藥基因以blaTEM為主(檢出率24%)，四環(huán)素類以tet(A)為主(檢出率28%)，氟喹諾酮類則以qnrS(檢出率18%)、qnrB(檢出率14%)、oqxA(檢出率14%)較為流行.第3代頭孢菌素被認(rèn)為是最重要的抗菌藥物之一，并廣泛用于人類和動(dòng)物[26].β-內(nèi)酰胺水解酶(extended spectrum beta lactamases, ESBLs)是大腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的重要原因，目前寵物已被公認(rèn)為全球ESBLs的重要來(lái)源之一[27].ESBLs幾乎可以水解所有青霉素類和頭孢菌素類抗生素，由基因同源性差異分為5類：CTX-M型、TEM型、SHV型、OXA型、其他型[28].blaTEM基因于1963年首次在希臘一名病人血液分離的大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，是由質(zhì)粒介導(dǎo)的主要β-內(nèi)酰胺類藥物基因，blaTEM基因編碼的β-內(nèi)酰胺酶可以降解包括頭孢曲松在內(nèi)的所有頭孢菌素[29].本研究中blaTEM基因的檢出率與印度寵物犬中流行情況相似[30].在中國(guó)部分地區(qū)也有關(guān)于blaTEM耐藥基因檢出的相關(guān)報(bào)道.如河南和新疆地區(qū)blaTEM基因的檢出率分別為45%[17]、100%[31]，表明blaTEM基因呈現(xiàn)流行趨勢(shì).四環(huán)素類抗菌藥物是20世紀(jì)40年代發(fā)現(xiàn)的一類抗生素，長(zhǎng)期廣泛用于治療人類和動(dòng)物的細(xì)菌感染，導(dǎo)致近年來(lái)不斷出現(xiàn)耐藥菌株.細(xì)菌對(duì)四環(huán)素類抗菌藥物的耐藥機(jī)制主要有外排泵機(jī)制[tet(A～G)]、核糖體保護(hù)機(jī)制[tet(M)、tet(O)]、鈍化酶機(jī)制[tet(X)]3種[32]，tet(A)通過(guò)編碼主動(dòng)外排泵介導(dǎo)對(duì)四環(huán)素耐藥[33].Costa et al[34]在犬的四環(huán)素耐藥大腸桿菌分離株中觀察到tet(A)基因占優(yōu)勢(shì)；崔耀明等[35]對(duì)河南地區(qū)犬源大腸桿菌中tet(A)的檢出率高達(dá)62%，表明tet(A)在介導(dǎo)寵物犬源大腸桿菌對(duì)四環(huán)素耐藥中的重要作用.氟喹諾酮類藥物是治療人類和動(dòng)物感染的重要抗生素，對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥性可導(dǎo)致治療失敗，因此被認(rèn)為是一種公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)[36].在過(guò)去30年間，人類和獸醫(yī)臨床分離株中的腸桿菌科對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥性有所增大[37].細(xì)菌對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制包括拓?fù)洚悩?gòu)酶突變(gyrA、gyrB)、靶標(biāo)保護(hù)(qnr)、外排泵(acrA、acrB、oqxA等)以及膜通透性的改變(ompF)[38].qnrS和qnrB是質(zhì)粒介導(dǎo)的氟喹諾酮類耐藥基因,其編碼的拓?fù)洚悩?gòu)酶結(jié)合蛋白對(duì)氟喹諾酮類藥物作用靶位具有保護(hù)作用[39].OqxA多藥外排泵負(fù)責(zé)降低對(duì)氟喹諾酮類藥物的敏感性[40].由此可見，本研究中寵物犬大腸桿菌主要通過(guò)靶標(biāo)保護(hù)和主動(dòng)外排系統(tǒng)介導(dǎo)對(duì)氟喹諾酮類耐藥.本研究中寵物犬源大腸桿菌β-內(nèi)酰胺類和氟喹諾酮類耐藥率與耐藥基因檢出率基本保持一致，表明上述耐藥基因在介導(dǎo)β-內(nèi)酰胺類和氟喹諾酮類中的重要作用.而四環(huán)素類耐藥基因的檢出率則顯著低于四環(huán)素耐藥率，表明除上述耐藥基因外染色體突變、外膜孔蛋白改變等其他相關(guān)耐藥機(jī)制共同介導(dǎo)了寵物犬源大腸桿菌的四環(huán)素耐藥.

本研究除了為寵物臨床治療提供數(shù)據(jù)支持外，還發(fā)現(xiàn)福州地區(qū)寵物犬源大腸桿菌耐藥狀況嚴(yán)峻，且攜帶多種重要耐藥基因.因此迫切需要加強(qiáng)對(duì)寵物臨床用藥的管理以及寵物源細(xì)菌耐藥性的監(jiān)測(cè)以防止抗菌藥物過(guò)度使用，減少細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生.