周杰， 薛寸， 張青， 陳思穎， 陳藝， 黃靜， 李月婷， 黃勇， 鄭林， 鞏仔鵬

(貴州醫(yī)科大學藥學院，貴州省藥物制劑重點實驗室，省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，民族藥與中藥開發(fā)應用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550004)

對于藥物靶點和關鍵藥物代謝酶位于細胞內的藥物而言，測定藥物在細胞中濃度較其血漿中的藥物濃度更有意義。當藥物進入到細胞后，如何準確測定細胞內藥物的含量，是開展藥物在細胞內的藥代動力學的前提。因此，建立快速測量和預測細胞內游離藥物濃度對研究藥物在細胞內的吸收、分布和代謝過程顯得尤為重要[1]。雖然多成分協同發(fā)揮作用是中藥民族藥治療疾病的特點，但因其所含化學成分眾多，給其含量成分的測定帶來巨大挑戰(zhàn)。超高效液相色譜與質譜聯用儀(ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)技術具有分析速度快、分離能力強、靈敏度高和自動化程度高等特點，對于中藥民族藥多組分的同時測定及細胞樣本中微量藥物含量的定量分析均具有很大的優(yōu)勢[2]。

羊耳菊為菊科旋覆花屬植物羊耳菊Inulacappa(Buch. -Ham. ex D. Don) DC.的新鮮或干燥全草，又名白牛膽、大力王、葉下白，是貴州云南等地少數民族常用藥材，對于感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、風濕疼痛、癰瘡疔毒、乳癰等癥狀有獨特療效[3]。近年來對羊耳菊的化學成分研究報道較多，其主要成分有酚酸類、萜類、黃酮類和揮發(fā)油等[4-7]，研究發(fā)現，從羊耳菊藥材中分離得到的木犀草苷(luteolin,LUT)、綠原酸(chlorogenic acid,CA)、新綠原酸(neochlorogenic acid,NCA)、隱綠原酸(cryptochlorogenic acid,CCA)、3,4-二咖啡?；鼘幩?3,4-dicaffeoylquinic acid,3,4-DCQA)、3,5-二咖啡酰基奎寧酸(3,5-dicaffeoylquinic acid,3,5-DCQA)、4,5-二咖啡?；鼘幩?4,5-dicaffeoylquinic acid,4,5-DCQA)具有抗炎活性[8-9]。羊耳菊的化學成分眾多且復雜，而目前關于同時測定細胞中羊耳菊抗炎活性成分含量的方法學研究未見報道，限制了其細胞藥代動力學的研究。因此，本文以小鼠巨噬細胞Raw 264.7為研究對象，采用超高液相色譜-三重四級桿質譜聯用儀(UPLC-MS/MS)建立同時測定Raw 264.7細胞中LUT、CA、NCA、CCA、3,4-DCQA、3,5-DCQA、4,5-DCQA等7個成分含量的方法學，包括專屬性、線性、基質效應、回收率、準確度、精密度和穩(wěn)定性等，為后續(xù)進一步研究苗藥羊耳菊抗炎活性成分的細胞藥代動力學研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 UPLC Xevo TQ-S型超高效液相三重四級桿質譜聯用儀(ACQUITY UPLC I-Class系統，MassLynx質譜工作站，美國沃特世公司)；CO2培養(yǎng)箱、超低溫冰箱(美國Thermo Fisher Scientific 公司)；Model 680酶標儀(伯樂生命醫(yī)學產品有限公司)；TS-100 F倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；超凈工作臺、Allegra 32 R臺式冷凍離心機、Allegra X-30 R低溫高速離心機(美國Beckman公司)；高壓蒸汽滅菌鍋、電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海捷呈實驗儀器有限公司)；KQ-500 DE 數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；VX-Ⅲ多管渦旋振蕩器(藤錦(北京)醫(yī)藥科技有限公司)；XYN-15LP氮吹儀氮氣發(fā)生器(上海析友分析儀器有限公司)；EL204萬分之一電子天平(上海Mettler Toledo公司)；單通道微量、多通道微量移液槍(德國Eppendorf公司)；電動移液槍(德國Sartorius公司)；Water purifier實驗室專用超純水機(四川沃特爾水處理設備有限公司)；25 cm2細胞培養(yǎng)瓶、細胞培養(yǎng)板6孔板、96孔板(無錫耐思生物科技有限公司)；10、25 mL移液管(清風生化科技有限公司)。

1.1.2 試劑與藥品 澳洲胎牛血清、DMEM、雙抗、胰酶消化液均購于美國Gibco公司；PBS、BCA 蛋白定量試劑盒，均購于北京索萊寶科技有限公司；MTS購于普洛麥格(北京)生物技術有限公司；質譜級甲醇、乙腈(德國Merck 公司)；質譜級甲酸(美國Thermo Fisher Scientific)；屈臣氏飲用水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

對照品：葛根素(中國食品藥品檢定研究院，批號110752-201514，純度≥95.5%)；綠原酸(成都埃法生物科技有限公司，批號AF8112791，純度≥98%)；隱綠原酸(成都埃法生物科技有限公司，批號AF20032707，純度≥98%)；新綠原酸(成都埃法生物科技有限公司，批號AF20030804，純度≥98%)；木犀草苷(四川維克奇生物科技有限公司，批號wkq20031803，純度≥98%)；3,4-二咖啡酰基奎寧酸(成都埃法生物科技有限公司，批號AF9060515，純度≥98%)；3,5-二咖啡?；鼘幩?成都埃法生物科技有限公司，批號AF20020302，純度≥98%)；4,5-二咖啡?；鼘幩?成都埃法生物科技有限公司，批號AF0011701，純度≥98%)。

1.1.3 藥材來源 羊耳菊藥材Inulacappa(產地為廣西桂林)經過貴州醫(yī)科大學生藥學教研室劉春花副教授鑒定為菊科旋覆花屬植物羊耳菊的干燥全草。

1.1.4 實驗細胞 本實驗所用小鼠單核巨噬細胞RAW264.7細胞株購于武漢普諾生命科技有限公司(批號CL-0190)。

1.2 實驗方法

1.2.1 羊耳菊提取物的制備方法 稱取羊耳菊藥材約20 kg，加10倍量60%乙醇浸泡過夜，回流提取3次，時間每次1 h，3次回流完成后，合并3次濾液，減壓濃縮，得濃縮液約10 L，濃縮液經D101型大孔樹脂吸附，徑高比1 ∶4，吸附充分后，加水洗脫至流出液無顏色后，換60%乙醇進行洗脫，收集洗脫液，水浴蒸干，得浸膏樣提取物，后續(xù)采用微波真空干燥，即得。計算得膏率為3.15%，經UPLC-MS/MS含量測定，羊耳菊提取物中木犀草苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、3,4二咖啡?；鼘幩?、3,5二咖啡?；鼘幩岷?,5二咖啡?；鼘幩岬暮糠謩e為0.18%、0.26%、0.25%、0.30%、4.52%、2.78%、4.36%。

1.2.2 細胞用羊耳菊提取物儲備液的制備 稱取羊耳菊提取物5 g，加入適量DMSO超聲溶解后，加入PBS定容至25 mL，即濃度為200 mg/mL的提取物母液(DMSO最終濃度為20%)，0.22 μm的微孔濾膜過濾后分裝保存至-20 ℃，臨用前用完全培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。

1.2.3 細胞培養(yǎng)

1.2.3.1 細胞復蘇 紫外照射超凈臺15～30 min，棉花用75%乙醇噴濕后，擦拭超凈工作臺，從-80 ℃冰箱將凍存的Raw264.7細胞迅速取出，將凍存管置于37 ℃水浴鍋中，在1 min內迅速解凍，不停震搖的同時直至細胞液體完全溶解，75%乙醇噴濕凍存管后，拿入超凈臺內，酒精燈烤瓶蓋周圍，將凍存管內的液體轉入10 mL離心管，加入3 mL含10% FBS的DMEM，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入5 mL完全培養(yǎng)基吹打均勻后轉移至25 cm2培養(yǎng)瓶中，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3.2 細胞傳代 待細胞貼壁生長至90%后，棄掉瓶中培養(yǎng)基，PBS清洗2遍，然后加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化液，消化3～5 min后，用1～2 mL含10% FBS 的DMEM終止反應，沿瓶壁將細胞輕輕吹打下來，轉移至10 mL離心管中，1 000 r/min，5 min離心，按1 ∶6傳代至新的培養(yǎng)瓶中，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48 h后，穩(wěn)定傳代幾次后，進行接下來的實驗。

1.2.3.3 細胞凍存 待細胞生長穩(wěn)定，棄掉瓶中培養(yǎng)基，PBS緩沖液清洗兩遍，然后加入1 mL 0.2%胰蛋白酶消化液，消化3～5 min后，用1～2 mL 含10% FBS的DMEM終止反應，沿瓶壁將細胞輕輕吹打下來，轉移至10 mL離心管中，1 000 r/min，5 min離心，加入1 mL凍存液(FBS ∶DMSO=9 ∶1)，梯度凍存細胞，即4 ℃冰箱放置30 min，-20 ℃放置2 h，轉入-80 ℃長期凍存。

1.2.4 溶液配制

1.2.4.1 內標溶液的配制 精密稱取葛根素5.7 mg，加甲醇定容至5 mL棕色容量瓶中，得1.14 g/mL的葛根素儲備液，后續(xù)根據實驗需要將其制備成實驗所需濃度，存放至-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.2 對照品溶液的配制 精密稱取木犀草苷5.07 mg、綠原酸10.13 mg、新綠原酸11.16 mg、隱綠原酸10.28 mg、3,4-二咖啡酰基奎寧酸15.21 mg、3,5-二咖啡?；鼘幩?5.33 mg, 4,5-二咖啡?；鼘幩?5.17 mg，加甲醇分別定容至5 mL，分別得到濃度為1.01、2.01、2.22、2.05、3.02、3.03、3.01 mg/mL的標準儲備液，保存在-20 ℃?zhèn)溆?；臨用前逐步將儲備液稀釋成混合標準溶液(木犀草苷、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、3,4-二咖啡酰基奎寧酸、3,5-二咖啡?；鼘幩帷?,4-二咖啡?；鼘幩釢舛确謩e為61.76、124.18、124.24、124.41、491.25、249.08、496.60 ng/mL)，再按倍數稀釋至表1中的系列濃度的標準溶液。

表1 木犀草苷等7個活性指標成分系列標準溶液濃度 ng/mL

1.2.4.3 PBS配制 將規(guī)格為2 L每袋的PBS，加入超純水溶解后，補至2 L，分裝在蜀牛瓶中后，高壓蒸汽滅菌后4 ℃存儲使用。

1.2.5 細胞樣品處理方法 取800 μL經過3次凍融的細胞懸液，加50 μL葛根素溶液(15 ng/mL)，短暫渦混后加160 μL 20%甲酸水溶液和800 μL甲醇，渦混5 min，超聲10 min，在4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min，上清液使用氮吹儀吹干，150 μL 50%甲醇復溶殘渣部分，渦混5 min，超聲10 min，在4 ℃條件下14 000 r/min離心10 min，上清液進樣分析。

1.2.6 UPLC-MS/MS分析方法的建立

1.2.6.1 液相條件 色譜柱：Waters BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)柱；保護柱：Waters Van Guard BEH C18(2.1 mm× 5 mm，1.7 μm)；流速為0.35 mL/min；柱溫為40 ℃；流動相：0.2%甲酸水(A)-0.2%甲酸乙腈(B)；進樣體積為3 μL。梯度洗脫條件見表2。

表2 木犀草苷等7個活性指標成分的色譜條件

1.2.6.2 質譜條件 采用電噴霧離子源(ESI)，毛細管電離電壓為3 kV，離子源溫度為150 ℃，噴霧氣與反吹氣是N2，去溶劑氣流速為1 000 L/h，去溶劑氣溫度為600 ℃，掃描方式為多反應監(jiān)測模式(MRM)，質譜數據采集及處理軟件為MassLynx V4.1工作站。木犀草苷等7種成分及內標用于定量分析的監(jiān)測離子見表3。

表3 木犀草苷等7個活性指標成分及內標的質譜條件

1.2.7 分析方法的確證

1.2.7.1 專屬性 取800 μL空白細胞懸液按“1.2.5 細胞樣品處理方法”項下方法操作(不加內標)，得空白圖譜A；將一定濃度對照品溶液和葛根素內標溶液加入空白細胞懸液，按“1.2.5”方法操作獲得對照品圖譜B；取給藥后的細胞懸液，按“1.2.5”方法操作得含藥譜圖C。

1.2.7.2 標準曲線的制備和LOD、LOQ 取800 μL空白細胞懸液，依次加入含有木犀草苷等7種成分的混合系列標準溶液50 μL，按“1.2.5細胞樣品處理方法”項下操作。以待測成分與內標峰面積之比(A/Ai)為縱坐標Y，各成分質量濃度(C)為橫坐標X進行線性回歸。木犀草苷等7種成分的最低定量限(LOQ)定義為S/N=10，最低檢測限(LOD)定義為S/N=3。

1.2.7.3 準確度和精密度 取800 μL空白細胞懸液，分別配制木犀草苷等7種成分的低、中、高三個濃度的QC樣品(n=5)，取50 μL加入后，其余均按“1.2.5”方法操作，低、中、高三個濃度同一天連續(xù)進樣2次，連續(xù)測定3 d，分別算出日內精密度和日間精密度。

1.2.7.4 提取回收率與基質效應 分別配制A、B、C三種樣品，取800 μL空白細胞懸液，配制木犀草苷等7種成分的空白細胞懸液中濃度的QC樣品，平行進行5樣本分析，取50 μL加入后，其余按“1.2.5”方法操作，此操作得到的樣品為A；另取一份800 μL空白細胞懸液，不加混合對照品溶液和內標外，甲酸和甲醇按“1.2.5”項下操作，離心后，取上清液，上清液中加入與A樣品中相對應濃度的對照品，每種濃度進行5樣本分析，吹干后，150 μL 50%甲醇復溶，此樣品為B；C樣品中不加入空白細胞，取上述中相應濃度的對照品溶液加入，按“1.2.5”項下操作。結果計算時，7種成分的提取回收率為樣品A峰面積與樣品B峰面積之比，基質效應為樣品B峰面積與樣品C峰面積之比。

1.2.7.5 穩(wěn)定性 取800 μL空白細胞懸液，分別配制木犀草苷7種成分低、中、高濃度的QC樣品，取50 μL加入后，其余按“1.2.5”項下操作，分別觀察樣品在自動進樣器中分別放置12 h，-20 ℃下冷藏24 h后的穩(wěn)定性，以每一濃度5樣本分析。

1.2.8 含藥細胞懸液的制備 選取對數生長期的細胞進行計數，將細胞懸液的濃度調整至1×105個/孔，接種至96孔板，每孔加100 μL細胞懸液，混勻后放置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，棄掉培養(yǎng)基，加入PBS輕輕清洗2次，加入100 μL含600 μg/mL羊耳菊提取物藥液的10% FBS的DMEM，設置6個復孔，放置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 h，棄藥液，加入PBS輕輕清洗3次，收集細胞，然后細胞用2 mL預冷的PBS快速洗滌2次，然后向每個孔中加入2 mL超純水，并將樣品儲存在-80 ℃，經過3次冷凍和解凍后，獲得含藥細胞懸液。

2 結果

2.1 專屬性

在選定的色譜和質譜條件下，木犀草苷等7種成分在細胞懸液中的分離良好，且無雜質干擾?？瞻准毎麘乙?、空白細胞懸液加入混合對照品溶液及葛根素內標和給藥后細胞懸液樣品色譜見圖1。

1： 新綠原酸； 2： 綠原酸； 3： 隱綠原酸； 4： 葛根素(內標)； 5： 木犀草苷；6： 3,4-二咖啡?；鼘幩?； 7： 3,5-二咖啡酰基奎寧酸； 8： 4,5-二咖啡酰基奎寧酸

2.2 線性范圍與LOQ、LOD

細胞懸液中木犀草苷等7種成分在濃度范圍內線性關系良好，相關系數(r2)均大于0.99，細胞懸液標準曲線方程及最低定量限(LOQ)、最低檢測限(LOD)見表4。

表4 木犀草苷等7種成分在細胞懸液中的線性回歸方程

2.3 準確度和精密度

對低、中、高三個濃度的細胞懸液的日內精密度和日間精密度進行了考察，結果表明木犀草苷等7種成分日內精密度和日間精密度RSD均小于15%，低、中、高濃度的準確度范圍為90.78%～113.99%，說明該方法準確、可靠、重現性好，測定結果見表5。

表5 木犀草苷等7種成分在細胞懸液中的準確度與精密度

2.4 提取回收率與基質效應

對木犀草苷等7種成分線性范圍內低、中、高濃度的細胞懸液樣品提取回收率進行了考察，結果表明在濃度范圍內7種成分的回收率及基質效應符合生物樣品分析方法要求。具體結果見表6。

表6 木犀草苷等7種成分在細胞懸液中的提取回收率與基質效應

2.5 穩(wěn)定性

對木犀草苷等7種成分低、中、高濃度細胞懸液樣品在進樣器放置12 h，冷藏(-20 ℃)24 h的穩(wěn)定性(n=5)進行了考察，結果表明7種成分在細胞懸液中經過上述過程后均穩(wěn)定，具體結果見表7。

表7 木犀草苷等7種成分在細胞懸液中的穩(wěn)定性

3 討 論

3.1 細胞破碎方法的選擇

細胞常用的破碎方法有物理裂解方法和化學裂解方法，其中化學裂解方法是使用裂解液裂解細胞，比如RIPA裂解液[10]、IP細胞裂解、NP-40裂解液、SDS裂解液等，由于此類型的細胞裂解液中大部分成分是鹽類，使用后會在UPLC-MS/MS儀器管路中產生鹽析，堵塞儀器，影響儀器使用壽命；物理裂解方法主要有超聲裂解[11]和反復凍融[12-13]方式，超聲裂解儀可以充分將細胞破裂，但該方法耗時，不適合大批量處理細胞，且實驗前期進行過預實驗，發(fā)現兩種破碎方式進樣測定后細胞中藥物含量差別不大。因此，本實驗選用簡便，可批量處理的反復凍融方式進行破碎細胞。

3.2 樣品蛋白沉淀方法選擇

常見的樣品蛋白沉淀方法有液-液萃取法、固相萃取[14]、蛋白沉淀等多種樣品處理方法，課題組前期已建立了羊耳菊提取物中活性成分體內含量測定的超高效液相色譜法串聯質譜的方法[15-17]，考慮到細胞樣品中藥物濃度過低、基質不同等問題，進行了優(yōu)化并驗證，建立了快速精準的測定細胞內咖啡酸類含量的分析方法，又加之樣品處理數量大，選擇萃取方法操作復雜，耗時耗力，故在此基礎上選擇了方法簡便的甲醇沉淀蛋白。

3.3 細胞中咖啡酸類成分提取方法選擇

羊耳菊抗炎有效部位中待測成分主要為咖啡酸類等化合物，在進行細胞處理時，需要用甲酸酸化樣品，預實驗中考察了1%、5%、10%、20%濃度的甲酸對細胞樣品中咖啡酸類提取，發(fā)現20%濃度甲酸可以明顯增加樣品中綠原酸等7個活性指標成分的含量，提高檢測靈敏度。

綜上，本文建立了快速、準確的同時測定Raw264.7細胞中羊耳菊提取物所含的7個指標成分(LUT、CA、NCA、CCA、3,4-DCQA、3,5-DCQA、4,5-DCQA)含量的UPLC-MS/MS分析方法。同時，本次實驗中，對細胞樣品的專屬性、線性、準確度、精密度、提取回收率、基質效應和穩(wěn)定性進行考察，發(fā)現該分析方法符合細胞樣品的測定，為開展羊耳菊提取物的細胞藥代動力學研究奠定基礎。