任香蕓，李維新，林曉姿，梁璋成，何志剛

[1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所，福建 福州 350003；2.福建省農(nóng)產(chǎn)品（食品）加工重點實驗室，福建 福州 350013]

0 引言

【研究意義】二氧化硫是葡萄酒等果酒釀造中常用的添加劑，具有防止酒體過度氧化、揮發(fā)酸含量上升和抑制雜菌生長等作用[1]。但高量的二氧化硫（60 mg·L-1以上）會對酒體中的乳酸菌產(chǎn)生脅迫作用，使其生長受抑制甚至死亡，影響了果酒的蘋果酸-乳酸發(fā)酵（Malolactic fementation，MLF）生物降酸效果和酒體品質(zhì)提升[2]；而低量的二氧化硫又不能充分發(fā)揮作用，從而易導(dǎo)致酒體品質(zhì)劣變；因此高耐受二氧化硫的MLF乳酸菌的選擇備受關(guān)注。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）R23是本試驗人員從自然發(fā)酵的枇杷酒中分離出的高耐硫、高抗逆性優(yōu)良MLF乳酸菌，已在山葡萄、枇杷和楊梅等高酸性水果的釀造中廣泛應(yīng)用，成為果酒生物降酸中的重要菌株[3-4]。【前人研究進展】已有研究表明，二氧化硫在液體介質(zhì)中以HSO3-、SO32-等形式存在，這些離子轉(zhuǎn)化為SO42-的過程會產(chǎn)生活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS）如·O2ˉ、H2O2、·OH 等；持續(xù)增加的ROS將作用于細(xì)胞內(nèi)生物大分子進而誘發(fā)核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等的氧化損傷[5-6]。但同時，生物體會啟動氧化防御系統(tǒng)以清除過多的ROS進而維持其正常的生長代謝，即所謂的氧化應(yīng)激。事實上，強氧化環(huán)境均會導(dǎo)致生物體內(nèi)ROS大量積累，引發(fā)生物體氧化應(yīng)激反應(yīng)[7]，如槲皮素、蘆丁等誘發(fā)了嗜酸乳桿菌NCFM氧化應(yīng)激，且主要依靠過氧化氫酶的作用清除胞內(nèi)自由基[8]；另外，在李斯特氏菌的氧化應(yīng)激反應(yīng)中，超氧化物歧化酶活性和DNA損傷修復(fù)主導(dǎo)了自由基的清除過程[9]。【本研究切入點】推測二氧化硫脅迫可能引發(fā)植物乳桿菌R23氧化應(yīng)激反應(yīng)，且其抗氧化相關(guān)系統(tǒng)發(fā)揮了積極作用，但迄今植物乳桿菌R23耐受二氧化硫的應(yīng)激機制尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究從胞內(nèi)抗氧化酶活力、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞膜丙二醛和磷脂脂肪酸含量等方面進行探究，明確二氧化硫脅迫下植物乳桿菌R23生理代謝變化，以期揭示植物乳桿菌R23對二氧化硫脅迫的適應(yīng)性機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株 植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）R23，由本實驗室人員從自然發(fā)酵的枇杷酒中分離并保存，NCBI號為HQ58056。

1.1.2 培養(yǎng)基 LHR20液體培養(yǎng)基：酵母膏0.74%，牛肉膏1.0%，蛋白胨0.5%，蔗糖2.0%，檸檬酸銨0.2%，MgSO40.036%，MnSO40.005%，吐溫-80 0.1%，蘋果酸鈉5.7%（體積分?jǐn)?shù)35%），番茄汁5%，平菇浸汁 5%，0.2 mol·L-1Na2HPO4-0.2 mol·L-1KH2PO4緩沖鹽稀釋4倍，121 ℃濕熱滅菌20 min。

1.1.3 主要儀器 SCIENTZ-950E細(xì)胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司），SPX-250BS-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司），SWCJ-IFD型單人單面凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），TGL-18C型高速冷凍離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠），GI54DW型高壓滅菌器（美國致微），6380LV型掃描電鏡（日本電子公司），BioTek Epoch2全波長酶標(biāo)儀（Bio Tek）， UV-1705紫外可見分光光度計（日本島津），Agilent7890N型氣相色譜系統(tǒng)（美國MIDI公司）。

1.1.4 主要試劑 （1）抗氧化酶活力測定及丙二醛含量測定試劑盒（上海起子生物科技有限公司）。（2）磷脂脂肪酸提取試劑。皂化試劑（試劑1）：NaOH 45 g + 甲醇（HPLC grade）150 mL+去離子蒸餾水150 mL和甲醇混合后加入NaOH中，同時攪拌至完全溶解；甲基化試劑（試劑2）：6.0 mol·L-1鹽酸325 mL+甲醇（HPLC grade）275 mL把鹽酸加入到甲醇中，并不斷攪拌；萃取試劑（試劑3）：正己烷(HPLC Grade ) 200 mL+MTBE (HPLC Grade ) 200 mL，把MTBE加入到正己烷中，并攪拌均勻；洗滌試劑（試劑4）：NaOH 10.8 g+去離子蒸餾水900 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化 將植物乳桿菌R23甘油凍存種以5%（V/V）接種于 LHR20中，30 ℃培養(yǎng) 15～18 h，連續(xù)轉(zhuǎn)接活化2次，備用。

1.2.2 菌體二氧化硫脅迫培養(yǎng) 將植物乳桿菌R23活化種以體積分?jǐn)?shù)為5%接種于二氧化硫質(zhì)量濃度分別為 0、40、80、120 mg·L-1的 LHR20 液體培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫靜置培養(yǎng)4 h后，備用。

1.2.3 菌體處理與形態(tài)觀察 取1 mL不同質(zhì)量濃度二氧化硫脅迫處理后的菌液于1.5 mL無菌離心管中，5 000 r·min-1離心3 min，用無菌水洗滌2次后，用適量2.5%戊二醛（pH 7.0）固定，后續(xù)制樣、掃描電鏡觀察均在福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所進行。

1.2.4 抗氧化酶活力測定樣品制備 取50 mL不同質(zhì)量濃度二氧化硫脅迫處理的植物乳桿菌R23菌懸液，以9 000 r·min-1、4 ℃離心10 min，棄上清；加無菌生理鹽水洗滌1次；菌泥中加入5 mL PBS（pH8.0）緩沖液，加玻璃珠旋渦震蕩混勻；然后進行超聲破碎，條件為：功率400 W、工作總時間5 min、工作1 s、間歇2 s、變幅桿直徑5 mm；細(xì)胞破碎液經(jīng)12 000 r·min-1、4 ℃ 離心 10 min；將上清液裝于 10 mL離心管，4 ℃暫存，備用。

1.2.5 蛋白質(zhì)含量測定 采用考馬斯亮藍(lán)法。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取6支具塞試管，編號，按表1加入試劑，搖勻，反應(yīng)10 min，于595 nm處測定吸光度。

表1 蛋白質(zhì)含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 1 Standard curve for protein determination

樣品測定：取樣品溶液0.1 mL于試管中，加水0.9 mL，各加入5 mL考馬斯亮藍(lán)試劑，充分混合，放置10 min，以試劑空白為對照，595 nm處測定吸光值，同時做3個重復(fù)。

1.2.6 酶活力及丙二醛含量測定 超氧化物歧化酶SOD、谷胱甘肽過氧化物酶GPX、過氧化氫酶CAT活力及丙二醛MDA含量的測定，采用試劑盒法，具體操作按照說明書進行。

1.2.7 細(xì)胞膜脂肪酸提取 （1）獲菌：取植物乳桿菌R23脅迫前、后（分別用0、80 mg·L-1二氧化硫處理）的菌液 20 mL，4 ℃、5 000 r·min-1，離心 5 min，用接種環(huán)挑取約40 mg濕重的菌落置于清潔干燥的有螺旋蓋的試管（13 mm × 100 mm）底部；（2）皂化：在裝有菌體的試管內(nèi)加入（1.0±0.1）mL試劑1，鎖緊蓋子，震蕩試管5～10 s，95～100 ℃水浴5 min，從沸水中移開試管并輕微冷卻，震蕩5～10 s，再水浴25 min，取出室溫冷卻；（3）甲基化：加入（2.0±0.1）mL試劑2，擰緊蓋子，震蕩5～10 s，80 ℃水浴10 min，移開且快速用流動自來水冷卻至室溫；（4）萃?。杭尤耄?.25±0.1）mL 試劑3萃取溶劑，蓋緊蓋子，溫和混合旋轉(zhuǎn)10 min ，打開管蓋，利用干凈的移液管取出下層似水部分，棄去；（5）基本洗滌：加入（3.0±0.21）mL試劑4，擰緊蓋子，溫和混合旋轉(zhuǎn)5 min，打開蓋子，利用干凈的移液管移出約2/3體積的上層有機相到干凈的GC檢體小瓶。

1.2.8 脂肪酸檢測 應(yīng)用MIDI系統(tǒng)，色譜分析柱溫采用二階順序升溫法，即第一階段170 ℃起始，每分鐘升溫5 ℃，升至260 ℃，第二階段每分鐘升溫40 ℃，升至310 ℃，維持90 s；汽化室溫度250 ℃、檢測器溫度300 ℃；載氣為氫氣（2 mL·min-1）、尾吹氣為氮氣（30 mL·min-1）；柱前壓 68.95 kPa；進樣量1 μL，進樣分流比100∶1。將檢測出的脂肪酸數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成以乳酸菌為樣本、以脂肪酸生物標(biāo)記為指標(biāo)的數(shù)據(jù)矩陣Excel文件，然后利用生物統(tǒng)計軟件SPSS 23.0中的Graphs進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 二氧化硫脅迫激發(fā)的菌體抗氧化防御反應(yīng)

植物乳桿菌R23在梯度二氧化硫脅迫處理條件下的胞內(nèi)抗氧化酶活力、膜丙二醛含量和超微形態(tài)變化如圖1、圖2和圖3所示。以正常培養(yǎng)條件為對照，二氧化硫脅迫處理后3種抗氧化酶活力均顯著提升(P ＜0.05)，其中80 mg·L-1二氧化硫脅迫下SOD、CAT、GPX分別是無脅迫處理的1.64、2.14、1.62倍，特別是CAT活力提升速率最快且后續(xù)下降幅度最小，提示適量二氧化硫脅迫可有效激發(fā)植物乳桿菌R23的抗氧化系統(tǒng)，而CAT可能起了主導(dǎo)作用。當(dāng)脅迫二氧化硫質(zhì)量濃度增大到120 mg·L-1時，酶活力略有下降但與最高值無顯著差異，且顯著高于對照值（P＜0.05）（圖1）。

圖2顯示，梯度二氧化硫脅迫導(dǎo)致MDA含量不斷增加；其中40或80 mg·L-1二氧化硫脅迫下MDA變化幅度較小，之后加速上升 (P＜0.05)，在120 mg·L-1二氧化硫脅迫下MDA含量是對照處理的1.84倍；說明抗氧化酶活力下降后胞內(nèi)ROS不能得到有效清除，進而導(dǎo)致菌體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)加劇。

植物乳桿菌R23在不同質(zhì)量濃度二氧化硫脅迫下的菌體細(xì)胞超微形態(tài)如圖3所示。正常培養(yǎng)條件下（0 mg·L-1二氧化硫），菌體飽滿，呈桿狀、單個或短鏈狀排列，不生孢（圖3-a）；40 mg·L-1二氧化硫脅迫并未導(dǎo)致菌體形態(tài)發(fā)生肉眼看見的變化（圖3-b）；但脅迫程度進一步加深后，有些菌體表面發(fā)生皺縮現(xiàn)象，細(xì)胞失去原有的飽滿程度（圖3-c、d），其中120 mg·L-1二氧化硫脅迫下這一變化更加明顯?？梢?0 mg·L-1SO2脅迫下菌體尚可維持基本的形態(tài)，而120 mg·L-1二氧化硫脅迫雖未導(dǎo)致抗氧化酶活力顯著下降，但其防御性能下降，這不僅表現(xiàn)在MDA含量顯著提升，也表現(xiàn)在菌體形態(tài)的變化上。

2.2 二氧化硫脅迫誘導(dǎo)的細(xì)胞膜磷脂脂肪酸變化

上述研究結(jié)果表明，80 mg·L-1二氧化硫脅迫可有效激發(fā)植物乳桿菌R23生理應(yīng)答，且未導(dǎo)致明顯的結(jié)構(gòu)損傷，因此考察了該濃度脅迫下菌體細(xì)胞膜磷脂脂肪酸的結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果如表2和圖4所示。無脅迫時菌體細(xì)胞膜脂肪酸的組成成分包括飽和脂肪酸即十四烷酸（C14:0）、十六烷酸（C16:0）、十八烷酸（C18:0）、十二碳異脂肪酸（iso-C12:0）、十七碳前異脂肪酸（anteiso-C17:0），單不飽和脂肪酸即十六碳異脂肪酸（iso-C16:1）、十六碳順式脂肪酸（iso-C16:1）和十九碳反式脂肪酸（trans-C19:1），以及環(huán)丙烷脂肪酸（cyclo-19:0）。其中 C14:0、C16:0、C18:0和cyclo-19:0含量之和超過57.2%，占總脂肪酸的比例較大，特別是C16:0占總量的27%以上，應(yīng)為植物乳桿菌R23脂肪酸主要組成成分。脅迫條件下，菌體脂肪酸發(fā)生不同程度變化，其中飽和脂肪酸即十四碳異脂肪酸（iso-C14:0）、十五碳異脂肪酸（iso-C15:0）和十八碳順式單不飽和脂肪酸（cis-C18:1）從無到有，而iso-C16:1、anteiso-C17:0從有到無。說明二氧化硫脅迫不僅導(dǎo)致菌體脂肪酸含量發(fā)生變化，也調(diào)整了脂肪酸的組成成分。

表2 不同二氧化硫脅迫下植物乳桿菌R23細(xì)胞膜磷脂脂肪酸相對含量Table 2 Relative contents of PLFA in L.plantarum R23 under SO2 stress

對不同類型脂肪酸的統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，二氧化硫脅迫后菌體總飽和脂肪酸含量上升，總不飽和脂肪酸含量下降（圖4-a），兩者比值提高1.75，即二氧化硫脅迫導(dǎo)致菌體膜脂肪酸飽和程度增加。類似的，二氧化硫脅迫導(dǎo)致了總直鏈脂肪酸提升（從49.36%升至52.0%），而總支鏈脂肪酸顯著下降（從6.90%降至5.35%，P＜0.05），總體直鏈/支鏈比值顯著提升（從7.15升至9.72，P＜0.05）；值得注意的是，支鏈脂肪酸中的異脂肪酸雖未發(fā)生變化，但前異脂肪酸從1.55%降低為0，因此，總體異脂肪酸和前異脂肪酸的比值增大（圖4-c）。另外，順式/反式脂肪酸的比值也從1.33顯著提升到2.33（P＜0.05）（圖4-d）。不同的是，菌體長鏈脂肪酸和短鏈脂肪酸在二氧化硫脅迫后的相對含量均有微量提升，但長鏈脂肪酸的增加幅度更大，因此總體上長鏈/短鏈的比值提升0.12（圖4-b）。另外還可以發(fā)現(xiàn)，作為植物乳桿菌R23脂肪酸主要組成成分之一的環(huán)丙烷脂肪酸cyclo-C19:0，在脅迫處理后其相對含量也得以提升，提示其在該菌體耐受二氧化硫脅迫過程中發(fā)揮了一定的作用。從整體變化趨勢分析，二氧化硫脅迫后植物乳桿菌R23膜脂肪酸成分向著飽和、長鏈、直鏈和環(huán)型調(diào)整。

3 討論與結(jié)論

3.1 抗氧化酶應(yīng)激酶系對二氧化硫脅迫的響應(yīng)

微生物體會啟動自身應(yīng)激機制以抵御各種逆境脅迫等不利條件，如產(chǎn)生特殊保護功能的蛋白[10]、改變細(xì)胞膜流動性[11-12]等，從而維持菌體正常的生長代謝和功能；本研究則發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌R23通過提高抗氧化酶活力、調(diào)節(jié)細(xì)胞膜脂肪酸結(jié)構(gòu)的方式來應(yīng)對二氧化硫脅迫。已有研究發(fā)現(xiàn)，在生物體氧化應(yīng)激反應(yīng)中SOD、GPX和CAT是清除ROS的重要抗氧化酶類[13]，如將sod基因進行外源表達(dá)后，可明顯提高乳桿菌的抗氧化能力[14]；而發(fā)酵乳桿菌ME-3中的谷胱甘肽過化物酶和谷胱甘肽還原酶，可以從環(huán)境中運輸及合成谷胱甘肽來參與抗氧化反應(yīng)[15]。本研究植物乳桿菌R23抗氧化酶活力的顯著提升表明該菌也啟動了氧化應(yīng)激反應(yīng)，且其抗氧化系統(tǒng)整體呈現(xiàn)一個主動防御到被破壞的趨勢。起始階段，隨著脅迫程度增大，SOD、GPX和CAT活性明顯提高（P＜0.05），以清除胞內(nèi)過量的·O2ˉ、H2O2、·OH；但當(dāng)二氧化硫質(zhì)量濃度超過菌體耐受閾值時，各酶活力開始下降，MDA含量上升幅度加大。這揭示了過高二氧化硫脅迫會導(dǎo)致菌體抗氧化系統(tǒng)失調(diào)，使得胞內(nèi)自由基產(chǎn)生和清除失去動態(tài)平衡，過量自由基與細(xì)胞膜中的脂肪酸等物質(zhì)發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進而引起細(xì)胞膜流動性或通透性改變，促使胞內(nèi)離子和其他電解質(zhì)及可溶性物質(zhì)大量外滲，破壞了細(xì)胞內(nèi)酶及代謝作用原有的區(qū)域性，最終導(dǎo)致細(xì)胞皺縮甚至破裂。因此，抗氧化酶活性對菌體細(xì)胞應(yīng)對氧化損傷起到至關(guān)重要的作用。

3.2 細(xì)胞膜對二氧化硫脅迫的響應(yīng)

細(xì)胞膜是把菌體細(xì)胞與外界環(huán)境隔離的第一道屏障，也是逆境因子生理脅迫的首要目標(biāo)之一，因此在維持胞內(nèi)微環(huán)境的穩(wěn)定性等方面發(fā)揮極其重要的作用[16]。一般認(rèn)為，細(xì)胞膜的生化特性很大程度上取決于組成磷脂的脂肪酸結(jié)構(gòu)[17]。本研究借助MIDI系統(tǒng)對二氧化硫脅迫前后植物乳桿菌R23膜脂肪酸測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脅迫后菌體脂肪酸成分及比例均發(fā)生變化，整體向著飽和、長鏈、直鏈和環(huán)型增長，其中直鏈/支鏈、順式/反式的比值顯著提升（P＜0.05）。由于總直鏈脂肪酸占比較高（50%以上），因此推斷直鏈（尤其是C16:0）與支鏈的比例在植物乳桿菌R23防御二氧化硫脅迫中起主導(dǎo)作用。雖然本研究中菌體總飽和脂肪酸和長鏈脂肪酸含量增加不顯著，但其占比也較大，所以認(rèn)為它們同樣發(fā)揮了積極作用。另有研究認(rèn)為，不同類型脂肪酸的比例均會對細(xì)胞膜的流動性產(chǎn)生影響[18]，其中支鏈脂肪酸（尤其是前異脂肪酸）中的甲基會破壞?；湹木o湊性[19]，降低膜流動性；如單增李斯特菌依靠增加直鏈脂肪酸同時降低前異脂肪酸C15:0、C17:0來適應(yīng)酸性環(huán)境[20]，而本研究中總支鏈脂肪酸增加以及前異脂肪酸anteiso-C17:0顯著降低（P＜0.05）應(yīng)是植物乳桿菌R23應(yīng)對二氧化硫脅迫的又一適應(yīng)性調(diào)節(jié)方式。另外，長鏈飽和脂肪酸可以增加磷脂雙分子層間?；湹南嗷プ饔昧?，使其結(jié)構(gòu)更為牢固且具有較高的相變溫度和較低的滲透性[17]；因此植物乳桿菌R23對長鏈/短鏈、飽和/不飽和脂肪酸的調(diào)整，可以降低細(xì)胞膜對HSO3-、SO32-等的透過性，從而防止ROS大量產(chǎn)生。另外，由于不飽和脂肪酸的氫鍵易被ROS氧化，本研究中其含量降低可以減弱膜脂對過氧化作用的敏感性。然而，目前關(guān)于不同類型脂肪酸在菌株抵御逆境脅迫中的作用并未取得一致觀點。如：鄭昀昀等[21]在新物種Anoxybacillus flavithermusssp.YunnanesisE13T對甲苯的耐受性，以及Huang 等[11]對植物乳桿菌ZDY2013對酸的耐受性研究中，均證實飽和脂肪酸發(fā)揮了積極作用，與本研究結(jié)果相一致；而Taranto等[22]在羅伊氏乳桿菌耐膽鹽、袁崢[23]在嗜酸乳桿菌耐酸的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，不飽和脂肪酸比例增加對菌體耐受性更有利；由此可見，不同特性的菌株或不同因子脅迫下其耐受性機制也不盡相同。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)了植物乳桿菌R23抗氧化酶、膜磷脂脂肪酸等在其應(yīng)答二氧化硫引發(fā)的氧化應(yīng)激中的作用，可初步闡明該菌對二氧化硫脅迫的適應(yīng)性生理機制，為深入理解該菌抵抗高二氧化硫環(huán)境而生存的分子機制提供理論依據(jù)，同時為篩選高抗逆性菌株以解決目前高酸性果酒降酸中存在的問題提供思路。