東莞某屠宰場(chǎng)豬鏈球菌檢測(cè)及分離鑒定

黃 元，陳錦良，黃育浩，張端秀，王曉虎，楊德勝，王 剛，向 華

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，廣東 廣州 510640；2.東莞市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣東 東莞 523128）

【研究意義】豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）是影響斷奶后仔豬最重要的細(xì)菌性豬病原體之一，主要引起腦膜炎、關(guān)節(jié)炎和猝死。在一些國家該菌仍然是一種重要的人畜共患病病原體［1］。該菌不僅會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，還會(huì)引起有關(guān)動(dòng)物福利和抗菌素耐藥性的擔(dān)憂。根據(jù)莢膜多糖（Capsule polysacharides）抗原的差異，豬鏈球菌共分為多種血清型［2-3］，其中豬鏈球菌2 型（SS2）致病力最強(qiáng)，不但引起豬的急性敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎甚至死亡，也可導(dǎo)致人的感染和死亡。因此，對(duì)豬鏈球菌進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查分析具有重大的公共衛(wèi)生意義。

【前人研究進(jìn)展】2005 年我國四川省暴發(fā)人感染豬鏈球菌病疫情，報(bào)告204 例，死亡38 例，引起了公共衛(wèi)生和科學(xué)研究領(lǐng)域的極大關(guān)注［4］。近幾年來SS2 感染人的病例也有報(bào)道，呈散發(fā)狀態(tài)［5-8］。無防護(hù)措施下經(jīng)常直接接觸豬及其副產(chǎn)品是導(dǎo)致人感染豬鏈球菌病的主要感染方式。其中，屠宰場(chǎng)是最可能發(fā)生感染豬鏈球菌的場(chǎng)所［9-10］。

Vishva等［11］采集563 頭表面健康的屠宰豬的腭扁桃體，在分離的87 個(gè)豬鏈球菌分離株中檢測(cè)到 6 種血清型，顯示SS7（24.13%）和SS5（18.39%）為優(yōu)勢(shì)血清型，而在扁桃體 DNA 中檢測(cè)到11 種血清型，其中SS9（28.26%）和SS7（14.13%）為主要血清型。近年來，我國有學(xué)者對(duì)江蘇、河南、黑龍江、寧夏、廣東等地［12-13］屠宰場(chǎng)的豬鏈球菌攜帶狀況進(jìn)行調(diào)查。2007—2009 年東莞市各鎮(zhèn)街屠宰場(chǎng)的屠宰豬經(jīng)采樣進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)，結(jié)果顯示，2007 年未出現(xiàn)SS2 感染豬，2008、2009 年SS2 檢出率分別為37.4%和74.85%［9］。2015 年從東莞市各鎮(zhèn)街屠宰場(chǎng)采集豬扁桃體樣品共320 份及環(huán)境樣品252 份，分離出溶血性鏈球菌276 株，檢出率為41.1%［10］。

【本研究切入點(diǎn)】2021 年6 月，佛山市某屠宰豬相關(guān)人員在東莞市某屠宰場(chǎng)從事屠宰活動(dòng)后感染SS2 死亡。屠宰場(chǎng)作為SS2 病原的來源地，其公共衛(wèi)生問題再次引起關(guān)注。目前東莞屠宰場(chǎng)的豬鏈球菌特別是SS2 流行情況如何，需要更多的調(diào)查數(shù)據(jù)，以進(jìn)一步評(píng)估人感染豬鏈球菌的風(fēng)險(xiǎn)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】2021 年7 月初，在東莞該屠宰場(chǎng)進(jìn)行采樣和豬鏈球菌分離鑒定，以期調(diào)查豬鏈球菌特別是SS2 在屠宰場(chǎng)健康豬群中的攜帶情況和抗生素耐藥情況，對(duì)該菌的傳播風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估，為其防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集 2021 年7 月8 日在東莞某屠宰場(chǎng)，用經(jīng)滅菌的剪刀、鑷子、注射器進(jìn)行無菌操作，采集40 頭豬的關(guān)節(jié)液和扁桃體，共獲得80份樣品。40 頭豬分別來源于廣東、廣西、湖南和江西四?。▍^(qū)）九市的12 個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.1.2 主要試劑 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒GeneJET Genomic DNA Purification Kit 為Thermofisher產(chǎn)品，PCR 相關(guān)酶和試劑為TaKaRa 產(chǎn)品，血瓊脂平板和TSB 平板為廣州環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品。其他試劑和耗材等購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌分離 將樣品分別接種于血瓊脂平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)約24 h 后，觀察菌落大小和形態(tài)，對(duì)典型單菌落在TSB 平板上劃線純化。

1.2.2 樣品的PCR 檢測(cè) 對(duì)關(guān)節(jié)液和扁桃體樣品分別加適量PBS 研磨，用試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，對(duì)SS 的特異性基因recN［14］和SS2 的特異性基因cps2J［15］分別進(jìn)行PCR 檢測(cè)，SS2 陽性樣品用引物cpsK-F 和cpsK-R2［16］進(jìn)行 PCR驗(yàn)證，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序并進(jìn)行序列分析。引物序列和擴(kuò)增條件見表1。

1.2.3 分離菌的PCR 鑒定（1）16S rDNA的PCR 鑒定。對(duì)劃線分離的疑似鏈球菌用針對(duì)16S rDNA 的引物［17］進(jìn)行PCR 擴(kuò)增及測(cè)序鑒定。通過16S rDNA 片段的序列比對(duì)，確定所分離細(xì)菌的種屬，引物序列和擴(kuò)增條件見表1。（2）SS 分型PCR 鑒定。單菌落用TSB 培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)過夜后，用試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，分別用針對(duì)33 種不同血清型的34 對(duì)SS 特異性基因片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以確定SS 的血清型，PCR 引物和擴(kuò)增條件按照文獻(xiàn)［15,18］進(jìn)行，部分引物信息見表1。

表1 供試PCR 引物Table 1 PCR primers for the test

1.2.4 毒力基因的PCR 鑒定 采用分離到的SS基因組DNA，針對(duì)不同毒力基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以確定毒力基因在分離菌中的攜帶情況。PCR 引物和擴(kuò)增條件按照文獻(xiàn)［18-19］進(jìn)行，引物信息見表1。

1.2.5 抗生素敏感性試驗(yàn) 采用紙片瓊脂擴(kuò)散法［20］檢測(cè)分離菌株的敏感性，取恩諾沙星、環(huán)丙沙星、大觀霉素、阿莫西林、青霉素G 等16種藥物的藥敏片貼于涂布菌液的TSA 培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)18 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，平行試驗(yàn)3 次，計(jì)算平均值，根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）制定的抗生素藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)（2019 版），評(píng)估受試菌的藥物敏感性。質(zhì)控菌株為變異鏈球菌（Streptococcus mutans,ATCC25175）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，CMCC26003）。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品的PCR 檢測(cè)

對(duì)采集的40 份關(guān)節(jié)液和40 份扁桃體樣品提取細(xì)菌基因組DNA，對(duì)SS 特異性基因recN和SS2 特異性基因cps2J分別進(jìn)行PCR 檢測(cè)，結(jié)果（表2）表明，在40 份關(guān)節(jié)液樣品中，有9 份呈SS 陽性、陽性率為22.5%，未發(fā)現(xiàn)SS2 陽性；在40 份扁桃體樣品中，有13 份呈SS 陽性、陽性率為32.5%，其中3 份呈SS2 陽性、陽性率為7.5%。

表2 組織樣品的PCR 檢測(cè)結(jié)果Table 2 PCR detection results of tissue samples

對(duì)3 份SS2 陽性樣品的cps2J片段和cpsK片段擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，cps2J片段核苷酸序列經(jīng)比對(duì)可知，3 株SS2 之間相應(yīng)序列同源性為100%；在NCBI 進(jìn)行在線BLAST 分析可知，3 株SS2的cps2J基因片段與荷蘭報(bào)道SS2的cps2J基因（AF118389）相應(yīng)片段的同源性最高（99.6%）。對(duì)所獲得的cpsK片段核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)可知，3 株SS2 之間相應(yīng)序列同源性為100%；產(chǎn)物長度為486 bp，在cpsK基因483 bp 對(duì)應(yīng)位置為SS2特征性的核苷酸G［16］，產(chǎn)生BstNI 酶切位點(diǎn)，與預(yù)期相符。據(jù)此可以確定這3 份樣品中含有SS2。

對(duì)樣品來源信息追查發(fā)現(xiàn)，3 份SS2 陽性樣品均來自湖南同一養(yǎng)豬場(chǎng)。對(duì)照采樣記錄可知，3份樣品對(duì)應(yīng)的豬在關(guān)節(jié)處均有一定程度的腫脹。

2.2 SS 分離和PCR 鑒定結(jié)果

從供試40 頭豬的扁桃體和關(guān)節(jié)液得到6 份形態(tài)疑似鏈球菌的菌落，菌落呈白色圓形，血平板上菌落周圍形成溶血環(huán)（圖1），革蘭氏染色呈陽性，在顯微鏡下均呈鏈狀或雙球狀（圖2）。

圖1 血平板上分離菌的生長形態(tài)Fig.1 Colonial morphology of the isolated strains on blood plate

對(duì)這6 份疑似鏈球菌的16S rDNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖3）和測(cè)序，經(jīng)核苷酸序列在線BLAST比對(duì)分析表明，編號(hào)為20、28 和39 號(hào)的3 株菌（分別命名為GD20、GD28 和GD39）的16S rDNA序列均與SS 序列同源性最高。其中，與GD20和GD28 測(cè)序序列同源性最高（均為99.47%）的是日本分離的SS 菌株MO869（GenBank 登錄號(hào)：LC377186）；與GD39 測(cè)序序列同源性最高（99.57%）的是日本分離的SS 菌株DTK399（GenBank 登錄號(hào)：LC316884）。對(duì)SS 特異性基因recN的PCR 擴(kuò)增表明，GD20、GD28 和GD39均為陽性。因此將菌株GD20、GD28 和GD39 認(rèn)定為豬鏈球菌。

圖3 SS 特異性基因recN 的PCR 擴(kuò)增Fig.3 PCR amplification to specific gene recN of SS

2.3 豬鏈球菌分型鑒定結(jié)果

3 株SS 的分型鑒定結(jié)果表明，菌株GD28 基因組DNA 用針對(duì)SS4的cps4K基因引物擴(kuò)增，可得到特異性片段（圖4），可確定為SS4；菌株GD20 和DG39 基因組DNA 用針對(duì)SS9的cps9H基因引物擴(kuò)增，可得到特異性片段（圖5），可確定為SS9。

圖4 SS4 特異性基因cps4K 的PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR amplification to specific gene cps4K of SS4

圖5 SS9 特異性基因cps9H 的PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 PCR amplification to specific gene cps9H of SS9

2.4 毒力基因鑒定結(jié)果

3 株SS 毒力基因的PCR 鑒定結(jié)果如表3 所示。多個(gè)毒力基因檢測(cè)為陽性，表明這3 株SS 具有一定的致病性。

表3 毒力基因的PCR 鑒定結(jié)果Table 3 PCR identification of virulence gene

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果（表4）表明，3 株SS 分離株對(duì)青霉素G、林可霉素、多粘菌素B 和磺胺異惡唑均表現(xiàn)耐藥，對(duì)恩諾沙星、環(huán)丙沙星、大觀霉素和阿莫西林均較敏感。質(zhì)控菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果符合預(yù)期。

表4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of drug sensitivity test

3 討論

近年來，屠宰場(chǎng)的衛(wèi)生安全問題受到關(guān)注［21］。屠宰場(chǎng)是豬鏈球菌病防控的重要場(chǎng)所，無防護(hù)措施下屠宰、分割、洗切是高風(fēng)險(xiǎn)行為［9-10］。對(duì)廣州市2016—2021 年75 例人感染豬鏈球菌病流行特征分析表明，來自屠宰場(chǎng)或從事豬肉零售相關(guān)工作的病例占24%，職業(yè)和生活上接觸表面健康豬只、市售豬肉史且未采取防護(hù)措施的病例占56%，暴露時(shí)手部有傷口的病例占28.57%；SS 的血清型以2 型 SS2 為主［22］。

SS2 在一年四季均可發(fā)生，但對(duì)人的感染在夏季發(fā)生較多。研究表明，夏秋季表面健康豬SS2 檢出率高于冬春季節(jié)，SS2 感染人的病例在夏季多發(fā)，原因可能與本季節(jié)豬攜帶SS 的優(yōu)勢(shì)致病血清2 型菌高于冬春季有關(guān)［13］。本研究于2021年夏季在發(fā)生人感染SS2 的屠宰場(chǎng)進(jìn)行SS 流行病學(xué)調(diào)查，具有很強(qiáng)的針對(duì)性。

本研究采樣的屠宰豬，除了少量豬只關(guān)節(jié)處有輕微腫脹外，其余均呈外觀健康。對(duì)40 頭豬的關(guān)節(jié)炎和扁桃體進(jìn)行PCR 檢測(cè)，結(jié)果顯示關(guān)節(jié)液中SS 陽性率為22.5%，SS2 陽性率為0%；扁桃體樣品中SS 陽性率為32.5%，SS2 陽性率為7.5%。多份扁桃體中檢測(cè)出SS2 核酸，提示存在SS2 感染人的風(fēng)險(xiǎn)。近幾年我國學(xué)者對(duì)屠宰場(chǎng)生豬進(jìn)行一系列流行病學(xué)調(diào)查，扁桃體SS 核酸檢測(cè)陽性率為9.27%～65%不等［13,23-25］。2017 年對(duì)在廣東地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)采集的發(fā)病豬群樣品及健康豬群樣品進(jìn)行SS 攜帶情況調(diào)查，結(jié)果表明，發(fā)病豬群SS的陽性率為82.02%（187/228），健康豬群的SS陽性率為42.20%（192/455），其中屠宰場(chǎng)屠宰豬群的SS 陽性率為32.10%（78/243）［24］。2021年于重慶屠宰場(chǎng)共采集表觀健康豬扁桃體154 份，檢出SS 陽性樣本80 份（51.95%），從中分離到菌株87 株；主要血清型分別為SS16（16.09%）、SS9（9.20%）、SS4（8.05%），而SS2 占比4.60%［25］。與2010 年和2015 年在東莞屠宰場(chǎng)的SS 調(diào)查［9-10］相比，本研究對(duì)SS 的核酸檢出率和菌株分離率均相對(duì)較低，可能與該屠宰場(chǎng)在發(fā)生人感染SS2 后加強(qiáng)消毒和檢疫有關(guān)。扁桃體是SS 入侵豬體內(nèi)首先定植的部位［26］，健康豬可在扁桃體中攜帶SS，成為該菌在豬群中傳播的傳染源，從正常屠宰豬扁桃體中可分離到致病性SS。Vishva等［11］對(duì)表面健康的屠宰豬腭扁桃體檢測(cè)表明，SS 抗原免疫檢測(cè)的組織病理學(xué)變化證實(shí)其在無癥狀攜帶者中持續(xù)存在，部分菌株對(duì)小鼠表現(xiàn)顯著致病性。本研究中SS 在扁桃體中的陽性率遠(yuǎn)大于關(guān)節(jié)液中的陽性率，其中SS2 在扁桃體中陽性率為7.5%，而在對(duì)應(yīng)的關(guān)節(jié)液中均未檢出陽性，提示SS 在豬體內(nèi)處于所謂的攜帶狀態(tài)，即在扁桃體中存在，未表現(xiàn)癥狀而不容易發(fā)現(xiàn)感染，這對(duì)SS 防控造成一定困難。本研究檢出的3 份SS2 陽性樣品均來自扁桃體組織，且均來自于同一養(yǎng)殖場(chǎng)，提示SS2 在該養(yǎng)殖場(chǎng)的豬群中已有一定程度傳播，尚未在屠宰場(chǎng)造成傳播。本研究在采樣過程中采取無菌操作，然而由于扁桃體是開放器官，因此也不能排除外界環(huán)境SS 造成扁桃體污染的可能性。

根據(jù)莢膜多糖抗原的差異，SS 可分為29 種傳統(tǒng)血清型和Chz 血清型。此外，根據(jù)莢膜基因簇的差異，近年來發(fā)現(xiàn)27 種新的莢膜基因簇菌株［3］。目前發(fā)現(xiàn)可感染人的血清型已達(dá)10 種。本研究對(duì)關(guān)節(jié)液和扁桃體進(jìn)行SS 分離，從關(guān)節(jié)液中分離出3 株SS，其中1 株鑒定為SS4，另兩株為SS9。SS9 和SS4 均曾造成人的感染［27-28］，在防疫中不可忽視。

目前一般根據(jù)毒力標(biāo)志基因的分布判斷SS毒力。溶菌酶釋放蛋白MRP 又稱為M 蛋白，一般認(rèn)為與SS 的吸附能力有關(guān)；mrp和epf被認(rèn)為編碼SS 的2 種重要毒力因子，與SS 的致病性密切相關(guān)［2］。甘油醛-3-磷酸脫氫酶GADPH 一般存在于細(xì)胞漿中，研究表明，隨著gadph基因表達(dá)量的增加，SS 毒力也隨之增加［29］。orf2基因作為一種毒力因子在豬源鏈球菌中普遍存在。gdh基因是鏈球菌的保守的毒力因子，可作為鏈球菌的定屬鑒定［30］，但不能用于鑒定SS［18］。一般認(rèn)為epf+mrp+sly+的SS2 菌株是強(qiáng)毒株［29］，但對(duì)其他血清型的強(qiáng)毒株認(rèn)定尚無定論。對(duì)印度健康屠宰豬的調(diào)查中，arcA+sly+epf+mrp-為普遍的基因型。對(duì)廣州周邊地區(qū)健康豬群SS 攜帶情況的調(diào)查中，68 株健康豬分離的SS 中，有61 株全為epf-mrp-sly-，1株為epf-mrp+sly-，6株為epf-mrp-sly+［31-34］。本研究對(duì)SS 毒力基因的PCR 鑒定表明，分離的SS4 菌株基因型為epf-mrp+gdh+gapdh+fbps-orf2+sly-，分離的2 株SS9 菌株基因型分別為epf-mrp+gdh+gapdh+fbpsorf2+sly-和epf-mrp-gdh+gapdh+fbps-orf2+sly+。這提示3 株SS 可能具有一定的致病性。在采樣時(shí)對(duì)20、28 和39 號(hào)豬的觀察中發(fā)現(xiàn)，豬下肢關(guān)節(jié)均有一定程度腫脹，提示這3 株SS 均已經(jīng)造成了關(guān)節(jié)炎癥，其致病性不容忽視。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果提示，分離的3 株SS 對(duì)多種抗生素耐藥。在對(duì)豬SS 的防控方面，養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)當(dāng)控制抗生素使用，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果有針對(duì)性地選擇抗生素，不可采取長期使用廣譜抗生素的辦法。

4 結(jié)論

對(duì)東莞某屠宰場(chǎng)外表健康屠宰豬樣品進(jìn)行豬鏈球菌PCR 檢測(cè)，關(guān)節(jié)液中豬鏈球菌陽性率為22.5%（9/40）；扁桃體樣品中，豬鏈球菌陽性率為32.5%（13/40），其中SS2 陽性率為7.5%（3/40）。對(duì)樣品進(jìn)行豬鏈球菌分離、形態(tài)鑒定和PCR 鑒定，獲得 1 株SS4 和2 株SS9。對(duì)毒力基因的PCR 鑒定提示，這3 株豬鏈球菌具有一定的致病性。藥敏試驗(yàn)表明，3 株豬鏈球菌對(duì)青霉素G、林可霉素、多粘菌素B 和磺胺異惡唑耐藥，對(duì)恩諾沙星、環(huán)丙沙星、大觀霉素和阿莫西林敏感。研究表明，該屠宰場(chǎng)豬群中存在豬鏈球菌的隱性感染，也提示存在SS2 感染人的風(fēng)險(xiǎn)。