團(tuán)頭魴咽齒發(fā)育相關(guān)基因系統(tǒng)進(jìn)化及其表達(dá)分析

朱德杰，吳亞明，陳宇龍，高澤霞，2

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/湖北省名優(yōu)魚育種與健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心/長(zhǎng)江經(jīng)濟(jì)帶大宗水生生物產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展教育部工程研究中心，武漢 430070；2.湖北洪山實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070

分泌型鈣結(jié)合磷蛋白（secretory calciumbinding phosphoprotein，SCPP）基因家族編碼的多種磷酸蛋白參與骨的骨化[1-2］，在哺乳動(dòng)物骨骼、牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)的形成中發(fā)揮著重要作用[3-4］。咽齒的出現(xiàn)是脊椎動(dòng)物進(jìn)化的一種方式，根據(jù)其大小、形狀、數(shù)量和位置的差異，在脊椎動(dòng)物分類群中呈現(xiàn)多樣性[5］。咽齒屬于骨骼系統(tǒng)的一部分，在形成過程中涉及到礦化，這些礦化組織的形成涉及多種因素，其中就包括一些關(guān)鍵基因，如分泌型鈣結(jié)合磷蛋白SCPP家族基因[1］。魚類基因組中確定了13 個(gè)SCPP 家族基因，且這些SCPP 家族基因都來自同一個(gè)祖先spar?cl1（the secreted protein acidic cysteine-rich like 1）基因。SCPPs可分為2個(gè)亞類：含有大于25%Glu、Asp和磷酸化Ser 殘基的酸性SCPP 以及含有大于20%Pro 和Gln 的富含Pro/Gln（P/Q）的SCPP[2］。在哺乳動(dòng)物中，酸性SCPP 主要與骨和牙本質(zhì)礦化有關(guān)，而富含P/Q的SCPP可使釉質(zhì)礦化[6］。

魚類已有SCPP 家族基因研究主要集中于從基因組水平比較基因序列的差異，這些差異可能與礦化組織的表型轉(zhuǎn)化有關(guān)[7］。Venkatesh 等[8］在軟骨魚類象鯊（Callorhinchus milii）的基因組中只發(fā)現(xiàn)了2個(gè)與SCPP 相關(guān)的祖先基因（即sparc和sparcl1）。Laue 等[9］發(fā)現(xiàn)斑馬魚（Danio rerio）SCPP 家族基因組中spp1基因的靶向突變導(dǎo)致骨形成減少。Lin等[10］在虎尾海馬（Hippocampus comes）中發(fā)現(xiàn)了2 個(gè)酸性SCPP 基因（scpp1和spp1），但與牙本質(zhì)和釉質(zhì)樣礦化有關(guān)的P/Q 豐富的基因如amel、enam、ambn和odam等在基因組中完全缺失。

團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）又名武昌魚，是我國(guó)特有的草食性經(jīng)濟(jì)魚類之一，具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、生長(zhǎng)較快、存活率高和易捕撈等特點(diǎn)，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)王衛(wèi)民、高澤霞團(tuán)隊(duì)針對(duì)其種質(zhì)資源保護(hù)及遺傳改良方向進(jìn)行了相關(guān)研究[11-12］。目前關(guān)于團(tuán)頭魴咽齒方面的研究還較少，本研究通過全基因組Blast 獲得了團(tuán)頭魴咽齒發(fā)育相關(guān)基因fa93e10（enam）、scpp1、scpp6（ambn）、scpp9、odam和spp1的序列信息，并分析其在團(tuán)頭魴不同組織和咽齒關(guān)鍵發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況，以期為了解魚類咽齒發(fā)生發(fā)育分子機(jī)制提供一定的基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用團(tuán)頭魴均來自湖北省陽新縣百容水產(chǎn)良種有限公司（湖北省黃石市陽新縣浮屠鎮(zhèn)）。試驗(yàn)共采集3 尾1 齡團(tuán)頭魴第五鰓弓（含咽齒）、第四鰓弓（不含咽齒）、肌間刺、大腦、鰭條、心臟、肝臟、脾臟、肌肉、肋骨10 種組織樣品，每個(gè)組織3 個(gè)樣品。同時(shí)，分別采集魚苗孵出后9、18、27、36、45、54 d 團(tuán)頭魴的第五和第四鰓弓，每個(gè)階段3 個(gè)重復(fù)樣品。所有采樣用魚使用MS-222 麻醉后進(jìn)行采樣，樣品采集完成后置于液氮中速凍后，轉(zhuǎn)入?80 ℃冰箱保存、備用。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

取?80 ℃凍存的9~54 d 團(tuán)頭魴第四、第五鰓弓及1 齡團(tuán)頭魴10 種組織樣品，用Trizol 法（TAKA?RA，大連）提取總RNA 并電泳檢測(cè)完整性，Nano?Drop ND-2000 核酸蛋白儀（Thermo，美國(guó)）測(cè)定RNA 濃度及OD 值。按照HiScript?ⅡQ RT Super?Mix for qPCR（+gDNA wiper）試劑盒（Vazyme，南京）的說明書合成各樣品的cDNA，將合成的cDNA稀釋5倍后，置于?20 ℃冰箱保存。

1.3 基因克隆

Ensembl 網(wǎng)站上下載斑馬魚enam（ENSD?ART00000132089.3）、scpp1（ENSDART00000127579.3）、ambn（ENSDART00000121605.4） 、scpp9（ENSD?ART00000129813.2）、odam（ENSDART00000137646.3）和spp1（ENSDART00000101261.6）的cDNA 序列，與團(tuán)頭魴的全基因組序列[13］（BioprojectID：PRJNA343584）進(jìn)行Blast比對(duì)，獲得團(tuán)頭魴enam（NP_14992）、scpp1（NP_15021）、ambn（NP_15032）、scpp9（NP_14953）、odam（NP_15082）和spp1（NP_25259）的完整CDS 序列。利用Primer Premier5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由北京擎科生物科技有限公司武漢分公司合成，以轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。用1%瓊脂糖檢測(cè)產(chǎn)物質(zhì)量后，將條帶單一的PCR 產(chǎn)物送武漢擎科生物科技有限公司測(cè)序。將測(cè)序獲得的目的基因片段與已知片段比對(duì)拼接，獲得團(tuán)頭魴上述6個(gè)基因的完整CDS序列。

1.4 基因生物信息學(xué)分析

利用NCBI 的ORF finder 程 序（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）分析基因開放閱讀框；使用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析6個(gè)SCPP家族基因的理化性質(zhì)。使用DNAMAN軟件對(duì)不同脊椎動(dòng)物6 個(gè)SCPP 家族基因進(jìn)行同源性分析，并使用MEGA7.0 軟件構(gòu)建基因系統(tǒng)進(jìn)化樹。進(jìn)化樹各基因物種信息如下：

enam：人（Homo sapiens）、牛（Bos taurus）、小鼠（Mus musculus）、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）、鯉（Cyprinus carpio）、斑馬魚（Danio rerio）、大黃魚（Larimichthys crocea）、雀鱔（Lepisosteus oculatus）、團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）、青鳉（Oryzias latipes）、牙 鲆（Paralichthys olivaceus）、秀 美 花 鳉（Poecilia formosa）；

scpp1：半滑舌鰨、斑馬魚、斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）、大黃魚、雀鱔、團(tuán)頭魴、青鳉、牙鲆、紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）；

ambn：人、牛、斑馬魚、雀鱔、團(tuán)頭魴、小鼠；

scpp9：雀鱔、鯉、斑馬魚、團(tuán)頭魴、青鳉、秀美花鳉；

odam：人、牛、小鼠、半滑舌鰨、鯉、斑馬魚、斑點(diǎn)叉尾鮰、大黃魚、團(tuán)頭魴、黃鱔（Monopterus albus）、青鳉、牙鲆、秀美花鳉、紅鰭東方鲀；

spp1：人、牛、半滑舌鰨、斑馬魚、斑點(diǎn)叉尾鮰、大黃魚、雀鱔、團(tuán)頭魴、小鼠、青鳉、牙鲆、秀美花鳉、紅鰭東方鲀。

1.5 qRT-PCR基因定量分析

參照Blast 獲得的6 個(gè)基因的序列信息，以βactin為內(nèi)參，利用NCBI 網(wǎng)站的Primer-Blast 設(shè)計(jì)其定量引物。由武漢擎科公司合成（表1）。熒光定量PCR 使用Hieff? qPCR SYBR? Green Master Mix（Low Rox）試劑盒（YEASEN，上海），以團(tuán)頭魴咽齒發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期1 齡團(tuán)頭魴不同組織樣品cDNA 為模板，參照試劑盒說明書進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)。采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)量。使用SPSS 軟件中的Duncan’s Multiple Range Test 比較基因在咽齒發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期及不同組織中的相對(duì)表達(dá)水平差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCPP家族基因理化性質(zhì)分析

利用Blast 獲得了團(tuán)頭魴SCPP 基因家族6 個(gè)咽齒發(fā)育相關(guān)基因的cDNA 核心序列，根據(jù)ProtParam軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示各基因的理化性質(zhì)如表2所示，其中enam的分子式為C1106H1709N281O357S6，氨基酸殘基中Ala（A）、Pro（P）、Val（V）、Glu（E）的頻率較高。scpp1的分子式為C1107H1746N306O457S8，氨基酸殘基中Ser（S）、Glu（E）、Asp（D）、Thr（T）的頻率較高。ambn的分子式為C1511H2333N415O448S13，氨基酸殘基中Pro（P）、Val（V）、Gln（Q）、Ser（S）的頻率較高。scpp9的分子式為C1580H2432N420O444S4，氨基酸殘基中Pro（P）、Gln（Q）、Gly（G）、Leu（L）的頻率較高。odam的分子式為C3441H5366N918O1026S30，氨基酸殘基中Pro（P）、Leu（L）、Val（V）、Gly（G）的頻率較高。spp1的分子式為C1615H2561N435O635S8，氨基酸殘基中Ser（S）、Glu（E）、Thr（T）、Ala（A）的頻率較高。

表2 團(tuán)頭魴SCPP家族基因的理化性質(zhì)Table 2 Physical and chemical properties of SCPP family genes in M.amblycephala

2.2 SCPP家族基因同源性分析

使用DNAman 軟件對(duì)人、鼠、牛、團(tuán)頭魴及其他魚類enam、scpp1、ambn、scpp9、odam與spp1編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，并使用MEGA 軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，團(tuán)頭魴enam編碼的氨基酸序列與斑馬魚（16.47%）、鯉（13.56%）具有相對(duì)較高的同源性（圖1），在進(jìn)化樹中距離最近（圖2）；與其他魚類同源性相對(duì)較低（1.53%~9.62%）；與人（0.61%）、鼠（0.78%）、牛（0.70%）具有極低同源性；在進(jìn)化樹中魚類與哺乳類和家禽類的遺傳距離比較遠(yuǎn)，形成2個(gè)大分支。與團(tuán)頭魴其他5 個(gè)基因同源性最高的也都是斑馬魚（圖1），進(jìn)化樹中距離較近，其中odam和scpp9在進(jìn)化樹中距離最近的物種為鯉（圖2），與其他物種的同源性較低。除此以外我們發(fā)現(xiàn)同樣是SCPP 家族基因，團(tuán)頭魴enam和scpp9編碼的氨基酸序列與斑點(diǎn)雀鱔同源性較低，分別為1.53% 和4.38%（圖1），但在scpp1、ambn和spp1這3 個(gè)基因與斑點(diǎn)雀鱔的同源性相對(duì)較高，分別為16.38%、12.95%和20.25%（圖1）。通過比對(duì)不同脊椎動(dòng)物enam與odam這2 個(gè)基因編碼的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)在魚類中均存在這兩段氨基酸序列的缺失（圖3）。

圖1 團(tuán)頭魴SCPP家族基因與其他脊椎動(dòng)物基因的同源性比較Fig.1 Comparison of homology between SCPP family genes of M.amblycephala and genes of other vertebrates

圖2 團(tuán)頭魴SCPP家族基因與其他脊椎動(dòng)物基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of SCPP family genes between M.amblycephala and other vertebrates

圖3 不同脊椎動(dòng)物enam和odam部分編碼序列比對(duì)分析Fig.3 Partial alignment sequences of enam and odam in the different vertebrates

2.3 SCPP家族基因在不同組織的表達(dá)分析

采用qRT-PCR 方法分析1 齡團(tuán)頭魴enam、scpp1、ambn、scpp9、odam和spp1在不同組織中的表達(dá)情況，結(jié)果（圖4）顯示：enam、scpp1、ambn、scpp9和spp1基因在第五鰓弓和肋骨中具有較高的表達(dá)量，與其他組織中的表達(dá)水平大多存在顯著性差異（P<0.05），且在第四鰓弓中的表達(dá)量極低（圖4A-D、F）。odam基因僅在肋骨里面有很高的表達(dá)量，與其他所有組織的表達(dá)水平均存在顯著性差異（P<0.05）（圖4E）。enam和scpp1基因在腦中的表達(dá)量比在肌間骨中高，但相較于第五鰓弓和肋骨仍存在顯著性差異（P<0.05）（圖4A-B）。ambn、scpp9、odam和spp1在腦中的表達(dá)量則顯著低于第四、第五鰓弓、肌間骨以及肋骨（P<0.05）（圖4C-F）。enam、scpp1、ambn、scpp9和spp1基因在肌間骨中也存在著近似的表達(dá)模式，表達(dá)量相較于第五鰓弓明顯降低且有顯著性差異（P<0.05），但相較于第四鰓弓表達(dá)量還是有所上升（圖4A-D、F）。enam、scpp1、ambn和spp1基因在鰭條中也具有較高的表達(dá)量（圖4A-C、F），且enam、ambn和spp1基因在鰭條中的表達(dá)量高于在第四鰓弓中的表達(dá)量，且存在顯著性差異（P<0.05）（圖4A、C、F）。enam、scpp1、ambn、scpp9、odam和spp1基因在心臟、肝、脾和肌肉中的表達(dá)量相較于其他組織均較低，且存在顯著性差異（P<0.05）（圖4A-F）。

圖4 團(tuán)頭魴SCPP家族基因在不同組織的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expression of SCPP family genes in the different tissues of M.amblycephala

2.4 SCPP 家族基因在早期咽齒發(fā)育階段的表達(dá)分析

基因表達(dá)分析結(jié)果如圖5 所示。enam基因于魚苗孵出后第9、18、27 天在第四鰓弓與第五鰓弓的表達(dá)量相近，無顯著性差異，第36、45 和54 天在第五鰓弓表達(dá)量顯著高于第四鰓弓（P<0.05）（圖5A）。scpp1基因在第9、18、27 天第五鰓弓表達(dá)量略高于第四鰓弓，在第36、45 和54 天第四鰓弓中的表達(dá)量高于第五鰓弓（圖5B）。ambn基因在第9~54天第五鰓弓中的表達(dá)量均大于第四鰓弓，其中第9 天第四、第五鰓弓中的表達(dá)量無顯著性差異，在第54 天第五鰓弓中的表達(dá)量顯著高于第四鰓弓（P<0.05）（圖5C）。scpp9基因在第9~54 天第五鰓弓中的表達(dá)量均大于第四鰓弓，且具有顯著性差異（P<0.05）（圖5D）。odam基因在第9 天第五鰓弓表達(dá)量略高于第四鰓弓，第18 天第四鰓弓表達(dá)量高于第五鰓弓，在第27~45 天第五鰓弓表達(dá)量顯著大于第四鰓弓（P<0.05），在第54 天第四、第五鰓弓表達(dá)量相近（圖5E）。spp1基因在第9 天和第18 天第四、第五鰓弓表達(dá)量相差不大，在第27~54 天第五鰓弓表達(dá)量顯著高于第四鰓弓（P<0.05），其中36 和45 d 的表達(dá)量差異更為明顯（圖5F）。

圖5 團(tuán)頭魴SCPP家族基因在早期咽齒發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression of SCPP family genes in the early pharyngeal tooth developmental stages in M.amblycephala

3 討 論

本研究中系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，enam、scpp1、ambn、scpp9、odam和spp1在鯉科魚類與人、鼠和雞等高等脊椎動(dòng)物類都各自聚為一支，青鳉與秀美花鳉enam、scpp9、odam和spp1基因聚為一支，這表明這2個(gè)物種不僅親緣關(guān)系較為接近，且與咽齒發(fā)育的形成潛在相關(guān)。在enam基因的進(jìn)化樹中斑點(diǎn)雀鱔與人、鼠、雞等高等脊椎動(dòng)物聚為一支，推測(cè)魚類的enam在基因復(fù)制過程中發(fā)生了功能的分化[14］，魚類enam與高等脊椎動(dòng)物同源性更高，但在不同物種中的同源性變異性較大，在同一科中存在高度保守性。

已有研究表明分泌型鈣結(jié)合磷蛋白（SCPP）基因家族對(duì)咽齒的形成至關(guān)重要[15-16］，富含（P/Q）的SCPP 家族基因的假基因化可能導(dǎo)致許多脊椎動(dòng)物如鳥類、海龜和一些哺乳動(dòng)物失去其牙頜[17］。以前的研究假設(shè)，大多數(shù)富含（P/Q）的SCPP 基因的丟失可能是導(dǎo)致合頜動(dòng)物咽齒缺失的原因[18-19］。在慈鯛科魚類中，與小齒魚類相比，scpp5在大齒魚類的下咽頜中有著更高的表達(dá)[20］，這表明富含（P/Q）的SCPP基因可能在咽部咽齒的形成中發(fā)揮調(diào)控作用。

enam、scpp1、ambn、scpp9、odam和spp1基因在1 齡團(tuán)頭魴不同組織中的表達(dá)分析結(jié)果顯示，enam、scpp1、ambn、scpp9、odam和spp1基因在1 齡團(tuán)頭魴的第五鰓弓表達(dá)量顯著高于第四鰓弓（P<0.05），且在肋骨中也有較高的表達(dá)，這與Kawasaki 等[1］所報(bào)道的酸性SCPP蛋白參與骨和牙本質(zhì)礦化、而富含脯氨酸和谷氨酰胺的SCPP 蛋白則參與釉質(zhì)和類琺瑯質(zhì)礦化的過程相一致。已有研究表明硬骨魚都有連續(xù)咽齒替換的現(xiàn)象，在口腔或咽腔的咽齒過了功能期后，一顆咽齒被同一位置（位點(diǎn)）的新咽齒替換，這種咽齒的更替持續(xù)終生，如斑馬魚和青鳉[21-22］。enam、scpp1、ambn、scpp9、odam和spp1基因在9~54 d團(tuán)頭魴第四、第五鰓弓中的定量表達(dá)結(jié)果恰恰證實(shí)了這一觀點(diǎn)。enam、ambn和scpp9基因在9~54 d 第四鰓弓始終處于一個(gè)較低的表達(dá)量，而第五鰓弓中的表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，推測(cè)enam、ambn和scpp9在團(tuán)頭魴早期咽齒生長(zhǎng)發(fā)育過程中起關(guān)鍵調(diào)控作用。scpp1在9~54 d 團(tuán)頭魴第四鰓弓中的表達(dá)量與第五鰓弓表達(dá)量無明顯差異，9~27 d 第五鰓弓中表達(dá)量大于第四鰓弓，36~54 d第四鰓弓中的表達(dá)量略高于第五鰓弓，綜合1 齡團(tuán)頭魴的定量表達(dá)結(jié)果，推測(cè)scpp1基因在團(tuán)頭魴早期咽齒發(fā)育過程中并無明顯調(diào)控作用，其發(fā)揮調(diào)控作用的時(shí)間可能在2月齡后。在本研究中團(tuán)頭魴odam和spp1基因調(diào)控蛋白在第36和45 天出現(xiàn)峰值，可能是團(tuán)頭魴早期咽齒發(fā)育循環(huán)周期結(jié)束的時(shí)期。

本研究通過對(duì)咽齒發(fā)育相關(guān)的enam、scpp1、ambn、scpp9、odam和spp1基因的CDS 區(qū)克隆和同源性分析，推測(cè)魚類SCPP 基因與魚類咽齒發(fā)育相關(guān)。結(jié)合團(tuán)頭魴9~54 d 第四、第五鰓弓和1 齡團(tuán)頭魴不同組織的基因表達(dá)分析，明確了enam、scpp1、ambn、scpp9、odam和spp1基因的表達(dá)與魚類咽齒發(fā)育具有一定的相關(guān)性。