加勒比松松脂組分分析及高特征組分無性系選擇

謝俊康，馮源恒，吳東山，楊章旗

（廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院 國家林業(yè)局馬尾松工程技術(shù)研究中心/廣西馬尾松工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530002）

加勒比松Pinus caribaea又稱古巴松，為松科松屬喬木，原產(chǎn)地為中美東部的沿海地區(qū)、古巴西部等，是重要的用材、紙漿材和采脂樹種，具有生長快、抗風(fēng)能力極強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等特點(diǎn)[1-2]。于20世紀(jì)60年代后期開始引入我國，在廣西、廣東及海南種植。目前，加勒比松已經(jīng)成為南方區(qū)域人工造林的重要樹種之一，也是退化生態(tài)系統(tǒng)植被重建的先鋒樹種[3-4]。

松脂是重要的化工原料，其組分復(fù)雜，不同組分有著不同的用途。松脂經(jīng)水蒸氣蒸餾后可分離出松節(jié)油和松香，松節(jié)油可直接用于醫(yī)藥、消毒、殺菌等領(lǐng)域[5-7]。松節(jié)油單離出的α-蒎烯、β-蒎烯可用于香料、農(nóng)藥中間體等精細(xì)化工品的合成[8-10]，β-水芹烯則在手性配體、殺蟲劑、合成藥物中間體等領(lǐng)域具有極高的利用價(jià)值[11]。松香是一種混合物，其作用受到一定限制，價(jià)格也比較低，但是經(jīng)過單離后得到的單體樹脂酸也具有較高的應(yīng)用價(jià)值，比如脫氫樅酸手性合成藥物、樅酸兩性表面活性劑、樅酸微膠囊膜、防霉劑、殺菌農(nóng)藥等[12-23]。由于單離成本較高、過程也較復(fù)雜，對(duì)比普通松脂原料，高附加值組分含量高的松脂原料在生產(chǎn)加工時(shí)，產(chǎn)物得率大、純度高，對(duì)松脂加工廠提高經(jīng)濟(jì)效益有較好的作用。加勒比松松脂產(chǎn)量較大，但目前對(duì)于加勒比松松脂組分的研究報(bào)道較少，為合理有效利用這一優(yōu)質(zhì)樹種的松脂資源，有針對(duì)性地對(duì)其松脂組分進(jìn)行研究、選擇及改良是非常有必要的。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料取自廣西南寧市林業(yè)科學(xué)研究所（108°00′E，23°10′N），該地屬熱帶北緣季風(fēng)氣候，干濕季節(jié)明顯，年平均氣溫21.5℃。選擇立地條件相同的2#基因庫和6#基因庫共31 個(gè)加勒比松無性系（107E、115E、116E、117E、120E、121E、122E、124E、126E、790E、340E、342E、344E、345E、347E、348E、349E、351E、352E、353E、355E、356E、614E、358E、359E、360E、361E、362E、346E、354E 和357E）作為研究對(duì)象。

1.2 試驗(yàn)方法

采用鉆孔采脂的方式進(jìn)行松脂采集。使用帶口徑為10 mm 鉆頭的木工電鉆，在樹干向陽面鉆取深度約為10 mm 的圓孔，將木屑清理后斜插入孔徑適合的離心管，確保松脂不外漏。松脂收集結(jié)束后取適量用于氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用（CG—MS）和氣相色譜（GC）檢測[14]。

使用Bruker 氣相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（SCIONSQ—TQ）和島津Nexis GC—2030 氣相色譜儀對(duì)松脂樣品進(jìn)行分析。通過GC—MS 儀器自帶的質(zhì)譜檢索系統(tǒng)和文獻(xiàn)查找進(jìn)行定性分析[15-20]，通過GC 色譜峰面積歸一化法對(duì)其進(jìn)行定量分析。具體操作步驟如下：取少量松脂樣品至5 mL 具塞試管中，加入適量無水乙醇溶解，然后滴入1～2滴0.5%的酚酞試液，用25%四甲基氫氧化銨溶液將樹脂酸甲酯化（滴加至溶液呈現(xiàn)微紅色，30 s 不褪色），然后加入干燥劑除水，用0.22 μ有機(jī)過濾頭將具塞試管中的試液過濾并轉(zhuǎn)移至氣相色譜瓶中待測。

GC—MS 測試條件如下：色譜柱為DB—5 毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm)，檢測器為氫火焰離子檢測器（FID），程序升溫方法為起始溫度60℃，保持2 min，以4℃/min 升溫到200℃，保持2 min，再以2℃/min 升溫到250℃，保持10 min 至結(jié)束；汽化室和檢測器溫度分別為260℃和280℃；載氣為高純氮?dú)猓兌?9.999%）；載氣柱流量為2.90 mL/min；分流比為1∶100；進(jìn)樣量為0.50 μL；電子轟擊源為EI，電子能量為70eV，離子源溫度為250℃，接口溫度為250℃，溶劑延遲時(shí)間為3 min。

GC 測試條件如下：色譜柱為島津RTX—5 毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm)，檢測器為氫火焰離子檢測器（FID），程序升溫方法為起始溫度60℃，保持2 min，以4℃/min 升溫到200℃，保持2 min，再以2℃/min 升溫到250℃，保持10 min 至結(jié)束；汽化室和檢測器溫度分別為260℃和280℃；載氣為高純氮?dú)猓兌?9.999%）；載氣柱流量為2.90 mL/min；分流比為1∶100；進(jìn)樣量為0.50 μL。

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t-test 檢驗(yàn)、方差分析、Pearson 相關(guān)性分析和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 加勒比松松脂組分特點(diǎn)

通過GC—MS、GC 分析發(fā)現(xiàn)，在測試的31個(gè)加勒比松無性系松脂樣品中，有3 份樣品（346E、354E、357E）中含有3-蒈烯組分，其余樣品中均未發(fā)現(xiàn)3-蒈烯組分。根據(jù)松脂化學(xué)組分的不同可將加勒比松無性系分為兩類（松脂組分中不含3-蒈烯組分的無性系為第1 類，松脂組分中含3-蒈烯組分的無性系為第2 類）。兩類加勒比松松脂組分和相對(duì)含量如表1 所示。第1 類加勒比松松脂組分中共檢測和鑒定出18 種組分，其中單萜8 種，樹脂酸組分8 種。第2 類的松脂組分比第1 類多出1 種（3-蒈烯）。第1 類松脂中平均相對(duì)含量大于1%的組分有10 種，分別是α-蒎烯（25.388%）、β-蒎烯（3.872%）、β-水芹烯（15.044%）、濕地松酸（2.561%）、山達(dá)海松酸（1.322%）、異海松酸（6.470%）、長葉松酸/左旋海松酸（25.950%）、脫氫樅酸（1.405%）、樅酸（5.079%）和新樅酸（9.322%），相對(duì)含量取值范圍分別為12.813%～37.599%、0.519%～13.857%、2.836%～28.781%、1.456%～ 4.022%、0.440%～3.753%、2.868%～12.486%、20.856%～39.244%、0.683%～2.062%、3.253%～7.070%和6.936%～16.852%。第2 類松脂中平均相對(duì)含量大于1%的組分有12 種，分別是α-蒎烯（9.684%）、β-蒎烯（5.003%）、月桂烯（1.026%）、3-蒈烯（13.528%）β-水芹烯（11.374%）、萜品油烯（1.407%）、濕地松酸（3.791%）、山達(dá)海松酸（2.279%）、異海松酸（8.396%）、長葉松酸/ 左旋海松酸（24.721%）、樅酸（5.670%）和新樅酸（9.365%），相對(duì)含量取值范圍分別為9.372%～10.228%、3.743%～6.652%、0.958%～1.078%、12.465%～15.646%、10.526%～11.867%、1.276%～1.565%、3.080%～4.231%、1.749%～2.589%、7.016%～9.538%、22.845%～26.448%、5.599%～5.712%和9.137%～9.701%。

表1 兩類加勒比松松脂組分?jǐn)?shù)據(jù)Table 1 Two types of Pinus caribaea resin components %

通過獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析了兩類加勒比松松脂中相對(duì)含量較高組分的差異顯著性，結(jié)果如圖1 所示。在單萜部分，兩類加勒比松松脂的β-蒎烯和β-水芹烯相對(duì)含量無顯著差異，雖然第1 類松脂中α-蒎烯相對(duì)含量極顯著高于第2 類，但是第2 類松脂中含有較高含量的3-蒈烯，使得總的單萜相對(duì)含量差異不顯著。在樹脂酸部分，兩類加勒比松松脂中樹脂酸組分和相對(duì)含量均相近，僅脫氫樅酸和樅酸相對(duì)含量具有顯著差異，其他樹脂酸組分相對(duì)含量和總的樹脂酸相對(duì)含量均無顯著差異。

圖1 兩類加勒比松松脂主要組分的相對(duì)含量Fig.1 Relative contents of the main components of two types of Pinus caribaea resin

通過Pearson 相關(guān)性分析加勒比松松脂中各個(gè)組分間的相關(guān)性。表2 為第1 類加勒比松松脂組分相關(guān)系數(shù)矩陣。由表2 可知，在第1 類松脂中α-蒎烯相對(duì)含量和單萜總含量呈極顯著正相關(guān)，和β-水芹烯相對(duì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)，和β-蒎烯相對(duì)含量相關(guān)性不顯著。β-水芹烯相對(duì)含量與β-蒎烯相對(duì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)。說明單萜中α-蒎烯相對(duì)含量占主導(dǎo)地位，β-水芹烯和β-蒎烯的相對(duì)含量呈現(xiàn)此消彼長的趨勢。由于第2 類加勒比松無性系樣本較少，因此，未進(jìn)行相關(guān)性分析。

表2 第1 類加勒比松松脂組分相關(guān)系數(shù)矩陣?Table 2 Correlation coefficient matrix of pine resin components of category 1 Pinus caribaea

2.2 高附加值組分無性系的選育

在加勒比松松脂中，附加值較高、相對(duì)含量較大的組分有α-蒎烯、β-蒎烯和β-水芹烯。第2類加勒比松無性系松脂中單萜和β-水芹烯的相對(duì)含量平均值小于第1 類且差異不顯著，α-蒎烯相對(duì)含量顯著低于第2 類。因此在選擇高含這些組分的無性系時(shí)，暫不考慮第2 類加勒比松無性系。但是第2 類加勒比松無性系中3-蒈烯相對(duì)含量達(dá)12%以上，當(dāng)需要3-蒈烯組分時(shí)，第2 類加勒比松無性系可以提供較優(yōu)質(zhì)的松脂原料。

在第1 類加勒比松無性系中選育時(shí)，以α-蒎烯相對(duì)含量大小為變量，利用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，所得樹狀圖如圖2 所示。圖2 中無性系編號(hào)1～28 分別對(duì)應(yīng)無性系107E、115E、116E、117E、120E、121E、122E、124E、126E、790E、340E、342E、344E、345E、347E、348E、349E、351E、352E、353E、355E、356E、614E、358E、359E、360E、361E 和362E。由圖2 可知，按照α-蒎烯相對(duì)含量大小可將第1 類加勒比松分為高含量、中含量等和低含量3 組。高含量組的無性系有356E、360E、359E、345E、358E、351E、349E 和352E，低含量組的無性系有340E、348E、344E、790E。通過聚類分析法得到β-蒎烯高含量組的無性系有126E、361E、362E、614E、115E、116E 和120E；得到β-水芹烯高含量組的無性系有353E、344E、124E、790E、340E和342E；得到總單萜高含量組的無性系有353E、358E、356E、614E 和124E。

圖2 α-蒎烯相對(duì)含量大小聚類分析樹狀圖Fig.2 Dendrogram in cluster analysis of the relative content of α-pinene

根據(jù)聚類分析結(jié)果按相對(duì)含量大小將無性系分組后，對(duì)不同組別進(jìn)行方差分析，得到的結(jié)果如圖3 所示。由圖3 可知，除去未進(jìn)行方差分析的組別（β-蒎烯中含量組和單萜低含量組均只有一個(gè)無性系，故未做方差分析），α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯和單萜4 個(gè)組分中，高含量、中含量、低含量3 組之間的差異均顯著，中含量組和平均值的差異均不顯著。α-蒎烯高含量組的平均相對(duì)含量為33.158%，高出平均值30.605%；β-蒎烯高含量組的平均相對(duì)含量為11.148%，高出平均值187.913%；β-水芹烯高含量組的平均相對(duì)含量為23.768%，高出平均值57.990%；單萜高含量組的平均相對(duì)含量為53.312%，高出平均值15.366%。

3 討論

關(guān)于加勒比松松脂組分的研究已有報(bào)道，如宋湛謙等[21]研究了對(duì)不同地理變種的加勒比松松脂化學(xué)組成，發(fā)現(xiàn)不同地理變種的加勒比松松脂化的特征基本上是一致的。吳東山等[22]對(duì)加勒比松、濕地松和雜交松松脂化學(xué)組分及松脂產(chǎn)量進(jìn)行了對(duì)比分析。這些研究顯示加勒比松松脂主要由單萜和二萜組成，其中相對(duì)含量最大的單萜和樹脂酸分別是α-蒎烯和長葉松酸/左旋海松酸。這一研究結(jié)果與本研究中第1 類加勒比松松脂化學(xué)組成類似，但這些研究僅對(duì)松脂組分特征進(jìn)行描述，未能根據(jù)松脂各組分的用途及需求進(jìn)行有針對(duì)性的選育工作。松脂經(jīng)過水蒸氣蒸餾后可以分離出松節(jié)油和樹脂酸，松節(jié)油經(jīng)過單離后可以得到較高純度的α-蒎烯、β-蒎烯等附加值較高的純品。松脂原料中化合物組分?jǐn)?shù)量及各組分的含量大小對(duì)于后續(xù)的深加工都有較大的影響。本研究在同一立地條件下分析不同加勒比松無性系的松脂組分及相對(duì)含量，分析歸納加勒比松松脂組成特點(diǎn)，篩選出了高含α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯和單萜組分的無性系材料各8、7、6 和5 份，可為松脂組分定性培育及松脂組分改良提供優(yōu)質(zhì)的親本材料。松脂中高附加值組分含量越高，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值越高，目前松節(jié)油價(jià)格日趨增加，因此有針對(duì)性地選育松脂中高含高附加值組分的加勒比松無性系可以滿足不同行業(yè)對(duì)松脂原料的需求。

3-蒈烯是自然界中少數(shù)幾種含有三元環(huán)結(jié)構(gòu)的手性源化合物之一，在農(nóng)藥、醫(yī)藥、增塑劑及無感染性溶劑中發(fā)揮著不可代替的作用[23-26]。此前我國產(chǎn)脂松樹中報(bào)道的松脂中3-蒈烯含量較高的僅有云南的思茅松[27-28]。此次在松脂中首次發(fā)現(xiàn)高含3-蒈烯組分的加勒比松無性系，可為3-蒈烯的應(yīng)用提供原料保障。

本研究從無性系水平對(duì)加勒比松松脂組分進(jìn)行分析，并篩選出部分高含高附加值組分的無性系材料，下一步將在此基礎(chǔ)上對(duì)加勒比松子代松脂組分進(jìn)行研究，分析松脂組分（特別是高含量組分及高附加值組分）的遺傳特性。

4 結(jié)論

本研究首次發(fā)現(xiàn)松脂中高含3-蒈烯組分的3 個(gè)加勒比松無性系。第1 類加勒比松無性系松脂中α-蒎烯相對(duì)含量顯著高于第2 類，但兩類松脂中總的單萜含量差異不顯著。篩選出的松脂中高含α-蒎烯的無性系有356E、360E、359E、345E、358E、351E、349E 和352E，高含β-蒎烯的無性系有126E、361E、362E、614E、115E、116E 和120E；高含β-水芹烯的無性系有353E、344E、124E、790E、340E 和342E；高含單萜的無性系有353E、358E、356E、614E 和124E。篩選出的高含組分無性系松脂中，高含組分的相對(duì)含量均顯著高于其對(duì)應(yīng)的平均值，可通過無性系造林和雜交育種提高目標(biāo)組分的含量，對(duì)于松脂原料品質(zhì)的提升具有一定的研究和應(yīng)用價(jià)值，對(duì)松脂組分定向培育和松脂組分改良有較好的指導(dǎo)意義。