小檗堿對喉癌細胞克隆、轉移及Toll樣受體4蛋白的作用

李 娜 張 穎 李芳園 焦培英 張 義 王文娟

(1 哈勵遜國際和平醫(yī)院，衡水，053000； 2 河北工程大學，邯鄲，056038)

喉癌是發(fā)生在聲門部位及其周圍的組織，多數(shù)為原發(fā)性的頭頸部惡性癌癥，由于生活習慣的改變、工作環(huán)境、空氣污染等因素導致喉癌的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的態(tài)勢[1]。喉癌患者中男性所占比重較大，研究證明喉癌患者體內的睪酮含量較健康人體高[2]，喉癌細胞能夠通過對附近組織的浸潤和轉移，現(xiàn)有的喉癌治療方法有手術、放療、化療和生物治療等多種方式[3]。雖然喉癌治療方案已逐步改良，但是這些治療方法存在一定的缺點，例如：口干、味覺與嗅覺靈敏度下降等不良反應，因此，需要尋找一種不良反應較小的藥物進行治療至關重要。近幾年，中藥逐漸應用于腫瘤的治療，因其有害成分比較少、對聲門部位損害小、疾病藥效穩(wěn)定等多種原因被廣泛應用。小檗堿是在中藥黃連中提煉出的一種味極苦的黃色針狀結晶性的季銨生物堿粉末[4]。它能夠有效地治療多種疾病，如胃腸炎、化膿性中耳炎及惡性癌癥等。近年來臨床研究實驗證明小檗堿能夠增強白血球吞噬作用，能夠有效抑制細菌的大量繁殖[5]。但關于小檗堿對喉癌細胞的進行研究的相關文獻較少，在此基礎上本研究采用不同濃度的小檗堿對喉癌細胞進行干預，分析其對喉癌細胞克隆、轉移及Toll樣受體4蛋白的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞培養(yǎng)、分組及處理 將小牛血清在57 ℃的環(huán)境下滅活30 min，在RPMI1640培養(yǎng)基中接種含10%小牛血清的喉癌細胞，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)，細胞聚合90%時，按照1∶3傳代，研究選取指數(shù)增長期的癌細胞。在25 mL的培養(yǎng)瓶中加入不同劑量的小檗堿分為4組，空白對照組(喉癌細胞正常培養(yǎng))，5 μmol/L小檗堿干預組(喉癌細胞培養(yǎng)基中加入5 μmol/L小檗堿)，10 μmol/L小檗堿干預組(喉癌細胞培養(yǎng)基中加入10 μmol/L小檗堿)，20 μmol/L小檗堿干預組(喉癌細胞培養(yǎng)基中加入20 μmol/L小檗堿)。

1.1.2 藥品與試劑 喉癌細胞株(Hep2)(上海撫生實業(yè)有限公司，貨號：FS-0255)；小檗堿(上?；菡\生物科技有限公司，貨號：025-17181)；細胞培養(yǎng)基[賽百慷(上海)生物技術股份有限公司]；Toll樣受體4抗體、Toll樣受體2抗體(深圳市豪地華拓生物科技有限公司，貨號：PL0305463、OL0305461)；胎牛血清(內蒙古奧普賽生物科技有限公司，貨號：BS-1107-500 mL)；磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBS)(廣州環(huán)凱生物科技有限公司，貨號：022117)；結晶紫染色液(背景索萊寶科技有限公司，貨號：G1061-500)。

1.2 方法

1.2.1 細胞克隆形成實驗 選取對數(shù)生長期的喉癌細胞，將其消化為單細胞，進行活細胞計數(shù)實驗。將其密度調整為1×106細胞/L，加入5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L的小檗堿。進行高溫殺菌后，為使其保持液體狀態(tài)將溫度保持在36 ℃左右，模擬生理環(huán)境，在5%CO2中培養(yǎng)14 d，克隆喉癌細胞，甲醛固定15 min，用結晶紫染色液，在37 ℃的CO2溫箱中培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。把培養(yǎng)皿用儀器觀察，利用公式測算細胞克隆情況?？寺⌒纬陕?克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

1.2.2 蛋白質印跡法(Western Blotting)檢測Toll樣受體4、Toll樣受體2蛋白水平 將5×103細胞/mL各組喉癌細胞0.125%胰蛋白酶消化，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，300×g，取上清液，檢測蛋白濃度，每孔加樣20 μg蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉面膜后取上清液以BAC法檢測蛋白濃度，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(每孔加樣20 μg蛋白)，轉膜后在含50 g/L脫脂奶粉的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBS)，室溫封閉1 h后，洗滌緩沖液(Tris Buffered Saline Tween,TBST)洗膜，轉膜后加入脫脂奶粉(50 g/L)、緩沖液，室溫封閉1 h，再次洗膜，加入一抗(1∶1 000)，4 ℃過夜，洗膜后加入二抗(1∶1 000)，37 ℃孵育1 h，ECL發(fā)光，Image J軟件對蛋白灰度值進行計算。

1.2.3 MTT(噻唑藍)法檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期的喉癌細胞，加入蛋白酶消化，按照細胞數(shù)量5×104接種到96孔板，放置于37.4 ℃、5%CO2培養(yǎng)，每組設置6孔，培養(yǎng)0 h，24 h，48 h及72 h后，加入100 μL 10%的CCK-8培養(yǎng)基，按照常規(guī)進行噻唑藍(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2，5 diphenyhetrazolium bromide，MTT)實驗，繼續(xù)培養(yǎng)3.5 h后，利用酶標儀480 nm下計算細胞活力，細胞存活率=小檗堿組D值/空白對照組D值×100%。各設3個復孔進行實驗。

1.2.4 劃痕實驗檢測細胞遷移情況 將對數(shù)生長期的喉癌細胞取出，進行消化收集，接種在96孔板中，4組細胞鋪設范圍達到90%時，用10 μL無菌槍尖劃痕，用PBS清洗細胞3次，清除破損細胞；記錄0 h和24 h時劃痕的大小，進行拍照。劃痕閉合率(%)=(24 h劃痕寬度-0 h劃痕寬度)×100%。

1.2.5 流式法檢測細胞凋亡 將4組的細胞培養(yǎng)72 h后，進行收集，PBS清洗2次，再用75%預冷乙醇40 ℃固定過夜，隨后用PBS洗滌，并重懸于含0.1 mg/mL的碘化丙啶中，室溫避光孵育30 min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2 結果

2.1 小檗堿對喉癌細胞克隆形成率的影響 4組喉癌細胞在24 h、48 h及72 h時克隆形成率比較差異均有統(tǒng)計學意義(F24 h=3.469，F(xiàn)48 h=20.590，F(xiàn)72 h=30.691，均P<0.05)。在24 h時，空白對照組的細胞克隆形成能力與5 μmol/L小檗堿干預組相似(P>0.05)，空白對照組的細胞克隆能力較10 μmol/L小檗堿干預組、20 μmol/L小檗堿干預組高(P<0.05)；在48 h和72 h時，與空白對照組比較，其他加入小檗堿進行干預的3組細胞克隆形成率均有明顯下降(P<0.05)。且20 μmol/L小檗堿干預組的克隆形成率明顯低于10 μmol/L小檗堿干預組、5 μmol/L小檗堿干預組(P<0.05)，隨著小檗堿作用時間延長、濃度升高，喉癌細胞克隆形成率逐漸減弱。見表1，圖1。

表1 各組喉癌細胞不同時間段克隆形成率比較

2.2 小檗堿對喉癌細胞中Toll樣受體2、Toll樣受體4表達的影響 與空白對照組細胞中Toll樣受體2及Toll樣受體4表達比較，5 μmol/L小檗堿干預組、10 μmol/L小檗堿干預組、20 μmol/L小檗堿干預組均有所降低(P<0.05)，與5 μmol/L小檗堿干預組、10 μmol/L小檗堿干預組比較，20 μmol/L小檗堿干預組細胞中Toll樣受體2及Toll樣受體4蛋白表達均下降(P<0.05)，隨著小檗堿濃度的升高，Toll樣受體2與Toll樣受體4蛋白表達降低，小檗堿可抑制Toll樣受體2與Toll樣受體4蛋白活性。見表2，圖2。

表2 各組喉癌細胞中Toll樣受體2和Toll樣受體4蛋白表達比較

2.3 小檗堿對喉癌細胞增殖的影響 給藥24 h、48 h、72 h后，與空白對照組比較，5 μmol/L小檗堿干預組、10 μmol/L小檗堿干預組、20 μmol/L小檗堿干預組細胞增殖率均有所降低(P<0.01)；與5 μmol/L小檗堿干預組、10 μmol/L小檗堿干預組比較，20 μmol/L小檗堿干預組細胞的增殖率有明顯的下降趨勢(P<0.05)，且給予小檗堿干預3組喉癌細胞增殖率依次遞減，隨著小檗堿作用時間延長，喉癌細胞增殖率逐漸降低，小檗堿可抑制喉癌細胞增殖。見表3，圖3。

表3 各組喉癌細胞增殖率情況

2.4 小檗堿對喉癌細胞劃痕距離的影響 24 h空白對照組、5 μmol/L小檗堿干預組、10 μmol/L小檗堿干預組、20 μmol/L小檗堿干預組喉癌細胞劃痕距離分別為(21.32±4.37)μm、(17.87±3.43)μm、(14.65±3.26)μm、(9.84±2.13)μm，與空白對照組比較，5 μmol/L小檗堿干預組、10 μmol/L小檗堿干預組、20 μmol/L小檗堿干預組在24 h時喉癌細胞劃痕距離均有所下降(P<0.05)。與5 μmol/L小檗堿干預組、10 μmol/L小檗堿干預組比較，20 μmol/L小檗堿干預組喉癌細胞劃痕距離縮短(P<0.05)，隨著小檗堿作用時間延長，喉癌細胞劃痕距離逐漸縮短。見圖2。

2.5 小檗堿對喉癌細胞凋亡的影響 48 h后空白對照組、5 μmol/L小檗堿干預組、10 μmol/L小檗堿干預組、20 μmol/L小檗堿干預組喉癌細胞凋亡率分別為(3.97±0.52)%、(7.36±0.63)%、(11.49±1.04)%、(19.83±2.38)%，與空白對照組比較，其余3組的喉癌細胞凋亡率逐漸升高(P<0.05)，與5 μmol/L小檗堿干預組、10 μmol/L小檗堿干預組比較，20 μmol/L小檗堿干預組喉癌細胞凋亡率均有所升高(P<0.05)，隨著小檗堿作用時間延長，喉癌細胞凋亡率逐漸升高，說明小檗堿可促進喉癌細胞凋亡。見圖5。

3 討論

喉癌是喉黏膜上皮組織病變所造成鱗狀細胞癌，多發(fā)生在中國北部[6]。主要的誘發(fā)因素是煙酒刺激、飲食等，嚴重情況下喉部表面會出現(xiàn)惡臭氣味，以現(xiàn)有的醫(yī)學水平尚缺乏治療喉癌的靶向藥物，因此尋找不良反應較小且療效較好的中藥是關鍵的一步。在現(xiàn)代醫(yī)療中研究表明中藥具有抗癌作用，利用其有效成分抑制癌細胞的生物活性可達到改善癌癥之功效[7]。小檗堿是一種從黃連中提煉而成的能夠治療心律失常及細菌性胃腸炎的藥物，有關報道提出小檗堿能夠阻礙癌細胞的迅速增殖，但是關于不同濃度小檗堿對喉癌細胞克隆、轉移與Toll樣受體4蛋白表達的研究較少[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)空白對照組喉癌細胞增殖、克隆能力高于其他3組，細胞凋亡率低于其他3組，與5 μmol/L小檗堿干預組、10 μmol/L小檗堿干預組比較，20 μmol/L小檗堿干預組喉癌細胞克隆能力及增殖均減低，細胞凋亡率升高，且隨著小檗堿作用時間越長，效果更佳，說明小檗堿可抑制喉癌細胞增殖、克隆，促進細胞凋亡。當聲門部位血管發(fā)生損傷或者發(fā)生其他病理疾病，小檗堿能夠有效改善其炎癥的發(fā)生[9]。閆波等[10]指出形成克隆的細胞具有增殖活性，小檗堿能夠有效抑制克隆細胞的形成，從根本上降低癌細胞活性。這一結論與本研究結果相似。喉癌細胞的轉移是由多因素多路徑共同作用的結果，Ren等[11]研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿能夠有效減弱黑色素癌細胞中神經(jīng)鈣黏素的表達,從而達到癌細胞的遷移速率降低的目的。謝天飛等[12]學者通過離體實驗對Hep2細胞增進行研究，結果表明與空白空白對照組比較，小檗堿組Hep2細胞生活活性降低，侵襲數(shù)量減少，其作用機制與調控P磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)、p-蛋白激酶B表達水平有關，抑制細胞中血管內皮生長因子、基質金屬蛋白酶-2、基質金屬蛋白酶-9活性，從而促進Hep2細胞凋亡。小檗堿是小檗科植物中提取的一種含有氮雜環(huán)的季銨型生物堿，能發(fā)揮較好的抗炎、抗炎效果，可通過抑制蛋白、DNA的合成來抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13]。研究發(fā)現(xiàn)小檗堿抑癌作用在于阻滯細胞生長周期，使癌細胞停滯在G0/G1期[14]。有學者通過巨噬細胞與癌細胞共培養(yǎng)給予小檗堿干預，結果表明小檗堿可通過降低巨噬細胞來抑制癌細胞的活性[15]。邢天嬌等[7]學者通過建立皮膚鱗狀細胞癌大鼠模型給予小檗堿腹腔注射，結果表明，與空白對照組比較，小檗堿干預組裸鼠移植瘤細胞凋亡數(shù)量增加，凋亡蛋白Bcl-2表達水平降低，其作用機制與上調Bax、胱天蛋白酶-3水平有關[7]。多項研究表明小檗堿具有抗癌機制，可抑制腫瘤相關蛋白和酶的活性、阻斷鉀離子通道、降低炎癥反應，抑制腫瘤細胞的活性，同時小檗堿還可以提高腫瘤細胞對順鉑敏感性，達到抗腫瘤的結果[4,8,10]。

本研究表明，與空白對照組細胞中Toll樣受體2及Toll樣受體4蛋白表達比較，5 μmol/L小檗堿干預組、10 μmol/L小檗堿干預組、20 μmol/L小檗堿干預組均有所降低，與5 μmol/L小檗堿干預組、10 μmol/L小檗堿干預組比較，20 μmol/L小檗堿干預組細胞中Toll樣受體2及Toll樣受體4蛋白表達均下降，隨著小檗堿濃度的升高，Toll樣受體2與Toll樣受體4蛋白表達降低，說明小檗堿可抑制Toll樣受體2與Toll樣受體4蛋白活性。Toll樣受體是一類參與天然免疫的跨膜蛋白，通過樹突狀細胞、中性粒細胞等進行表達，當出現(xiàn)損傷肌體時，它激活免疫細胞應答，在免疫中發(fā)揮主要作用[16]。Toll樣受體2、Toll樣受體4是Toll樣受體中受體之一，Toll樣受體4與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有密切的關系，在多種腫瘤中如非小細胞性肺癌、甲狀腺癌、口腔癌等均異常表達[17-18]。王志平等[19]研究表明，發(fā)現(xiàn)爪蟾驅動蛋白樣蛋白的靶向蛋白(Targeting Protein for Xenopus Kinesin-like Protein 2，TPX2)、Toll樣受體4在癌組織中的表達高于癌旁組織，TPX2在癌細胞中的過表達，可控制細胞的有絲分裂，下調TPX2可調控紡錘體微管相關蛋白進而導致癌細胞的周期紊亂，使其增殖能力下降。Toll樣受體4可由局部內源性酶激活，可調控炎癥及信號轉導、細胞死亡，Toll樣受體4轉導免疫反應是炎癥疾病的起點，會引起病毒性炎癥病變。有研究表明炎癥介質最先轉入細胞膜中，與細胞膜受體(如Toll樣受體4等)結合，誘發(fā)炎癥反應，促進腫瘤細胞免疫逃逸，促進腫瘤發(fā)展[19-20]。蔡靜等[21]通過體外細胞實驗研究發(fā)現(xiàn)沉默Toll樣受體4信號可抑制宮頸癌增殖，穿膜細胞數(shù)明顯減少，降低Myd88,胞外信號調節(jié)激酶1/2及核因子κB蛋白的活性，從而抑制宮頸癌細胞的遷移及侵襲。熊鶯等通過對膀胱癌細胞進行實驗發(fā)現(xiàn)Toll樣受體2信號通路參與膀胱癌細胞免疫逃逸，其作用機制與上調血管內皮生長因子和TGF-β1信號通路有關[22]。有學者通過對Hela細胞進行體外研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量小檗堿干預的HeLa細胞，其增殖、遷移數(shù)量均降低，其作用機制與通過抑制p65、Bcl-2和Toll樣受體4表達水平來實現(xiàn)[23]。這與本研究結果相似，小檗堿通過調控TPX2、Toll樣受體4信號通路從而抑制喉癌細胞生物活性。

綜上所述，不同濃度小檗堿均可降低喉癌細胞克隆、增殖及遷移能力，其作用機制可能通過抑制Toll樣受體2、Toll樣受體4蛋白活性從而促進喉癌細胞凋亡。