田超 吳欽超 褚現(xiàn)明

阿霉素是一種細(xì)胞周期非特異性蒽環(huán)類化療藥物,通過抑制DNA 的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制、提高細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平殺傷腫瘤細(xì)胞,但是這種殺傷效應(yīng)具有非選擇性。 由于阿霉素的心肌親和力,其對心臟產(chǎn)生的毒副作用尤為明顯。 目前,研究人員認(rèn)為阿霉素心臟毒性(doxorubicin-induced cardiotoxicity, DIC)產(chǎn)生的原因主要與心肌細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高及其引起的心肌細(xì)胞受損和死亡有關(guān),但具體機(jī)制仍然不清楚,亦缺乏有效的DIC 早期檢測手段。 臨床醫(yī)師通常在癌癥患者化療時預(yù)防性給予心臟保護(hù)劑,如右丙亞胺和維生素E 等,但效果有限。

外泌體是所有細(xì)胞均可分泌的一種直徑在30 ~150 nm 的細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicle,EV),由磷脂雙分子層構(gòu)成骨架,四分子交聯(lián)蛋白和跨膜蛋白等嵌插和貫穿于雙分子層,內(nèi)部包含各種核酸(包括信使RNA 和非編碼RNA)、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等[1]。 外泌體非編碼RNA 不僅在疾病發(fā)生時有差異性表達(dá),而且還可作為治療性調(diào)控分子被遞送到受體細(xì)胞并發(fā)揮生物學(xué)功能。 基于以上特性,外泌體非編碼RNA 有望應(yīng)用于DIC 的早期診治[2]。 本文對DIC 目前常規(guī)的診療措施、外泌體非編碼RNA作為DIC 診治手段的研究以及未來發(fā)展前景進(jìn)行綜述,以期提高心內(nèi)科和腫瘤科醫(yī)師對外泌體非編碼RNA 應(yīng)用于腫瘤心臟病學(xué)領(lǐng)域的認(rèn)識。

1 阿霉素心臟毒性的常規(guī)監(jiān)測和治療手段

1.1 阿霉素心臟毒性的監(jiān)測手段

阿霉素的“脫靶效應(yīng)”會引起心肌細(xì)胞損傷,導(dǎo)致心律失常、心肌病甚至充血性心力衰竭[3]。 阿霉素造成的心肌損傷具有劑量依賴性,化療啟動之日即心功能損傷開始之時。 DIC 所致的心功能損傷早期表現(xiàn)隱匿,可通過觀察患者阿霉素化療后出現(xiàn)的心臟相關(guān)癥狀,并結(jié)合心肌損傷標(biāo)志物(如肌鈣蛋白、肌酸激酶和乳酸脫氫酶[4])以及心力衰竭標(biāo)志物(如利鈉肽家族[5]等)初步判斷,但這些方法的特異性較低。

雖然心電檢查能檢測出抗癌治療所致的心律失常,但美國梅奧診所的一項(xiàng)研究表明,阿霉素引發(fā)的心律失常發(fā)生率較低[6],因此心電檢查不適用于DIC 的篩查。 目前,指南推薦采用超聲心動圖進(jìn)行心臟整體收縮功能的評估[7]。 然而,采用左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)檢測阿霉素所致心臟損傷的敏感性不高,因?yàn)楹芸赡茉贚VEF 下降前患者心肌組織即發(fā)生了病理變性,如細(xì)胞水腫、心肌纖維化等[8]。 心臟磁共振可以檢測出蒽環(huán)類藥物導(dǎo)致的早期心肌纖維化[9],但患者體內(nèi)如存在起搏器、支架或鋼板等金屬植入物,則可使其應(yīng)用受限。 此外,心臟磁共振檢查價格較高,不宜作為常規(guī)篩查方式。 心臟放射性核素掃描被認(rèn)為是診斷DIC 的“金標(biāo)準(zhǔn)”[10-11],但存在輻射暴露風(fēng)險。

綜上,針對DIC 的早期診斷,目前臨床上尚無敏感性、特異性均較高,且兼具安全性與經(jīng)濟(jì)性的有效手段。

1.2 阿霉素心臟毒性的治療方法

阿霉素?fù)p傷心臟的主要機(jī)制包括三個方面:①嵌入心肌細(xì)胞DNA 雙鏈之間的堿基,從而抑制DNA 的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄;②抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ,使DNA去螺旋化,從而抑制DNA 的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄;③與鐵離子形成復(fù)合物,促進(jìn)自由基的生成,提高心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平,從而破壞細(xì)胞膜,導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷和死亡。

目前,對DIC 有預(yù)防作用的藥物右丙亞胺可通過競爭性螯合鐵離子來抑制自由基的產(chǎn)生,從而降低心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平,減輕DIC。 但右丙亞胺的作用有限,且存在引發(fā)繼發(fā)性腫瘤的風(fēng)險[12]。當(dāng)患者出現(xiàn)栓塞、冠脈痙攣、心肌病、心力衰竭或心律失常等DIC 相關(guān)后果時,臨床醫(yī)師除了停用、減少阿霉素用量和調(diào)整用藥策略外,常選擇β 受體阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、鈣通道阻滯劑、抗凝或抗心律失常藥物等對癥治療,但仍然無法從根本上解決問題。 我國癌癥發(fā)病率居高不下,患癌人口基數(shù)龐大,抗癌治療引發(fā)心臟毒性的問題將愈發(fā)突出,造成很多患者陷入“得了腫瘤卻死于心臟病”的困境。 在此背景下,探索新型、有效的DIC 治療藥物已是迫在眉睫。

2 外泌體非編碼RNA 在阿霉素心臟毒性診治中的作用

外泌體中包含豐富的非編碼RNA,既可以作為早期診斷DIC 的標(biāo)志物,也可作為遞送分子用于DIC 的治療。

2.1 阿霉素心臟毒性早期診斷的標(biāo)志物

微小RNA(microRNA, miRNA)是一類長度在19 ~23 nt 的非編碼RNA。 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明,血液中的非編碼RNA 在多種心血管疾病中的表達(dá)存在明顯差異[13-14]。 非編碼RNA 作為診治心血管疾病靶標(biāo)的作用已經(jīng)明確,并有部分已逐漸推廣應(yīng)用到臨床[15]。 已有相關(guān)綜述較為系統(tǒng)地總結(jié)了循環(huán)miRNA 作為預(yù)測DIC 標(biāo)志物的研究[16-17]。 與游離形式的非編碼RNA 特性類似,外泌體非編碼RNA亦具備成為DIC 診斷標(biāo)志物的潛力,且比前者更穩(wěn)定。

BEAUMIER 等[18]對患有骨肉瘤的實(shí)驗(yàn)犬在排除既往心臟疾病和易患心肌病體質(zhì)后給予單獨(dú)的阿霉素化療,在化療前、中、后分別檢測血漿肌鈣蛋白水平、血漿EV-miRNA 和進(jìn)行超聲心動圖檢查,并將上述幾種心功能損傷的檢測手段進(jìn)行對比。結(jié)果顯示,化療后血漿EV 中的miR-107、miR-146a和miR-502 與化療前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其中miR-502 的表達(dá)明顯升高,且這種變化早于現(xiàn)有的心肌損傷檢測(包括cTnT、超聲心動圖等)陽性結(jié)果之前;miR-107 和miR-146a 表達(dá)下降,這種差異性表達(dá)與之前研究中兒童接受單獨(dú)阿霉素化療后血液中miRNA 表達(dá)的變化結(jié)果一致[19]。 但是EV 來源的這三種miRNA 能否作為DIC 的標(biāo)志物,仍需更大臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證。 LI 等[20]用阿霉素處理AC16心肌細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)處理后的心肌細(xì)胞外泌體中circ-SKA3 表達(dá)升高,并且通過miR-1303/TLR4 軸增強(qiáng)阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞毒性。 雖然該研究只是闡明了外泌體來源環(huán)狀RNA 介導(dǎo)阿霉素?fù)p傷心肌的一種機(jī)制,但也提示了外泌體circ-SKA3 可能成為DIC 診斷標(biāo)志物。

現(xiàn)階段尚缺乏針對外泌體來源非編碼RNA 作為阿霉素化療心肌損傷標(biāo)志物的研究,其原因可能包括以下幾方面:①干擾因素較多,無法確定外泌體非編碼RNA 變化的原因。 目前臨床上多采用聯(lián)合化療方案,如對乳腺癌患者通常采用“阿霉素+曲妥珠單抗”的化療策略,對小細(xì)胞肺癌患者多采用“鉑類+依托泊苷”的經(jīng)典化療方案,因此,外泌體非編碼RNA 的變化可能是多種藥物綜合影響的結(jié)果;再者,腫瘤本身的變化是否會影響外泌體非編碼RNA 也需要納入考慮;加之癌癥患者通常合并其他慢性基礎(chǔ)疾病,如糖尿病、心腦血管疾病等,使外泌體非編碼RNA 的變化原因進(jìn)一步復(fù)雜化。 因此,最理想的是能夠找到僅采用阿霉素化療且無合并其他基礎(chǔ)疾病的患者,確定阿霉素化療為唯一變量。 ②化療患者出現(xiàn)心臟毒性的時間不定,目前我國患者隨訪意識淡薄,因此很難通過隨訪期間的心功能相關(guān)檢查發(fā)現(xiàn)DIC。 若能通過嚴(yán)格納入標(biāo)準(zhǔn)、開展長期大規(guī)模規(guī)律隨訪以及采用科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕y(tǒng)計(jì)分析手段等舉措排除以上干擾因素,明確與阿霉素?fù)p傷相關(guān)的外泌體非編碼RNA 的變化,則有望將外泌體非編碼RNA 用于DIC 的早期診斷。

2.2 阿霉素心臟毒性的治療

人類基因組中約98.5%的序列為非編碼RNA,其本身不編碼蛋白,但具有強(qiáng)大的基因調(diào)控功能。雖然非編碼RNA 已被證實(shí)在心血管系統(tǒng)中可發(fā)揮重要的調(diào)控作用,但由于存在胃腸道降解、靶向性不足等缺點(diǎn)而限制了其用于治療。 經(jīng)外泌體包被的非編碼RNA 有望克服上述不足,發(fā)揮更好的治療效果[21-23]。

2.2.1 外泌體微小RNA 治療阿霉素心臟毒性miRNA 通過與靶向信使RNA(mRNA)進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對, 調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)[24-25]。 某些miRNA 已被證明能調(diào)控心肌細(xì)胞增殖[26-29],外泌體及其遞送的非編碼RNA 對心肌損傷亦顯示出較強(qiáng)的修復(fù)能力[30-32]。 理論上,經(jīng)外泌體遞送的非編碼RNA 相較游離非編碼RNA 具有更好的穩(wěn)定性和修復(fù)效果。

由于氧化應(yīng)激在DIC 的發(fā)展過程中居于中心地位,因此,抑制氧化應(yīng)激造成的心肌細(xì)胞衰老[33]及程序性死亡[34-38]、促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖是DIC 的常規(guī)治療思路。 而對具有抑制氧化應(yīng)激或促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖效應(yīng)的miRNA 進(jìn)行外泌體包被,對外泌體進(jìn)行人工改造,可減少其被單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬[39],再經(jīng)過特異性靶向心肌細(xì)胞,即可減輕DIC。

除此以外,腫瘤細(xì)胞對阿霉素耐藥可造成阿霉素使用劑量的累加,由此產(chǎn)生的過量阿霉素對心肌細(xì)胞慢性炎癥損傷的問題亦有待解決。 化療耐藥的問題在乳腺癌治療過程中尤為明顯。 DENG等[40]采用阿霉素治療小鼠乳腺癌,發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)可在耐藥慢性炎癥環(huán)境中產(chǎn)生骨髓源性抑制細(xì)胞,該細(xì)胞分泌的外泌體miR-126 可誘導(dǎo)腫瘤血管形成,促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移,并且正反饋地促進(jìn)炎癥因子和炎性細(xì)胞生成,從而形成惡性循環(huán)。 因此,抑制骨髓源性抑制細(xì)胞來源的外泌體miR-126 將有助于解決阿霉素耐藥問題。 臨床上治療三陰性乳腺癌失敗的主要原因同樣是化療耐藥和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn),人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞(tohoku hospital pediatrics-1,THP-1)外泌體miR-770 可以通過促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞凋亡,降低癌細(xì)胞對阿霉素化療的耐藥性,而阿霉素化療敏感組織中的miR-770 表達(dá)上調(diào)則提供了臨床證據(jù)[41]。 研究發(fā)現(xiàn),對阿霉素耐藥的胃癌細(xì)胞株分泌的外泌體中富含miR-501,后者可通過絲氨酸或蘇氨酸激酶Akt 途徑抑制胃癌細(xì)胞的凋亡,并促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和遷移[42]。當(dāng)發(fā)生胃癌阿霉素化療耐藥時,通過抑制外泌體miR-501 或許可有效抑制癌癥并降低耐藥性。

2.2.2 外泌體長鏈非編碼RNA 治療阿霉素心臟毒性長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, lncRNA)是一類長度>200 nt 的非編碼RNA,可通過內(nèi)源性競爭海綿作用結(jié)合并抑制miRNA,從而間接調(diào)控靶基因的表達(dá)。 越來越多的證據(jù)顯示,lncRNA 參與心肌細(xì)胞的衰老、增殖和修復(fù)等過程。 有研究發(fā)現(xiàn)一種能夠負(fù)性調(diào)控心肌細(xì)胞增殖和修復(fù)的lncRNA CPR,在成年小鼠中特異性敲除CPR 可促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖并改善心臟功能[43]。 lncRNA 還具有改善心臟重構(gòu)[44]、抑制心肌細(xì)胞自噬[45]和細(xì)胞凋亡[46]的作用。 lncRNA 在腫瘤進(jìn)展調(diào)控[47]和心肌損傷修復(fù)方面作用強(qiáng)大,外泌體lncRNA 在治療DIC 方面的作用同樣值得期待。

WANG 等[48]研究發(fā)現(xiàn),對阿霉素耐藥的乳腺癌細(xì)胞分泌的外泌體lncRNA H19 表達(dá)明顯增加,而通過抑制H19 可降低癌細(xì)胞活力和誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡,從而顯著降低阿霉素抗性,這提示H19 可作為減輕乳腺癌阿霉素耐藥性的治療靶點(diǎn)。 既往研究支持間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體治療DIC 的作用和前景,基于此,我們團(tuán)隊(duì)對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體進(jìn)行了一系列研究,涉及其減輕阿霉素心臟毒性的機(jī)制和作為早期診斷標(biāo)志物等方面,初步發(fā)現(xiàn)外泌體lncRNA 介導(dǎo)鐵死亡的可能信號調(diào)控通路。 有報道指出,經(jīng)缺氧處理之后間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體lncRNA MALAT1 表達(dá)明顯增加,可通過競爭性結(jié)合miR-92a-3p 并激活A(yù)TG4a 來改善線粒體代謝,從而有效避免阿霉素引起的心肌損傷[49]。 根據(jù)當(dāng)前的研究結(jié)果,采用外泌體包被lncRNA 治療DIC 是一個有前景的研究方向和治療策略,但還需要更加深入和證據(jù)確鑿的應(yīng)用研究成果作為支撐。

3 存在的問題與未來展望

雖然外泌體非編碼RNA 在DIC 診治中表現(xiàn)出較大潛力,但要真正應(yīng)用于臨床道阻且長,目前仍然存在如下問題:①超高速離心法是分離外泌體的“金標(biāo)準(zhǔn)”,但離心過程中外泌體損失較多,而采用其他方法獲取外泌體雖然能克服上述缺點(diǎn),但是純度不高;②開展外泌體相關(guān)研究要么依賴于超高速離心設(shè)備,要么依賴于外泌體提取試劑盒,前者對實(shí)驗(yàn)室平臺要求較高,后者經(jīng)濟(jì)成本較高;③針對外泌體的基礎(chǔ)研究需要與臨床研究相結(jié)合,理想的臨床試驗(yàn)不僅納入標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格,而且由于其為前瞻性研究,因此需要多中心的研究人員多年協(xié)作參與。雖然存在種種困難,但是機(jī)遇與挑戰(zhàn)同在。 世界范圍內(nèi)的學(xué)者對外泌體研究仍保持飽滿的熱情與十足的信心,年發(fā)文量呈爆發(fā)式增長,外泌體?？粩嚅_設(shè);我國國家自然科學(xué)基金等科研項(xiàng)目對外泌體研究的支持力度較大,研究前景一片光明。

臨床上已經(jīng)探索出一些可用于DIC 監(jiān)測的超聲心動圖技術(shù),如實(shí)時三維超聲心動圖、心肌應(yīng)變的組織多普勒成像和應(yīng)變率成像[50-52]。 隨著相關(guān)技術(shù)的發(fā)展,未來的心臟超聲技術(shù)將會更早地發(fā)現(xiàn)心臟微小損傷,提供敏感性更高的DIC 早期檢測手段。 同樣,闡明各種化療藥物導(dǎo)致心臟毒性的機(jī)制,也將為尋找治療靶點(diǎn)提供科學(xué)依據(jù)[53]。

無論是蛋白修飾[54]還是外泌體,無論是影像學(xué)檢查還是非編碼RNA,無論是傳統(tǒng)中藥還是西藥,我們都應(yīng)當(dāng)保持開放的心態(tài),讓各種學(xué)術(shù)觀點(diǎn)百花齊放、百家爭鳴,彼此互為補(bǔ)充,最終殊途同歸,闡明心臟毒性具體機(jī)制,發(fā)現(xiàn)有效的診治手段。 相信隨著我國心內(nèi)科和腫瘤科專家對腫瘤心臟病學(xué)的認(rèn)識不斷加深,腫瘤心臟病學(xué)的多學(xué)科會診將在我國各級醫(yī)院逐步開展,符合我國國情的化療藥物引起心臟毒性的相關(guān)指南也將陸續(xù)發(fā)布,使臨床實(shí)踐有章可循,最終造福于患癌人群。