王文慶，李 翠，馬 恒，方良艷，郝樹彬

(1. 山東省醫(yī)療器械和藥品包裝檢驗(yàn)研究院微生物室，山東 濟(jì)南 250101；2. 國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)用衛(wèi)生材料及生物防護(hù)器械質(zhì)量評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101；3. 山東省醫(yī)療器械和藥品包裝檢驗(yàn)研究院業(yè)務(wù)辦公室，山東 濟(jì)南 250101)

無論是嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)還是新型冠狀病毒肺炎(簡稱新冠肺炎)疫情，都使我們深刻認(rèn)識到醫(yī)用生物防護(hù)器械在保護(hù)醫(yī)務(wù)人員和患者乃至普通人群的健康和安全的重要性。特別是隨著本次新冠肺炎疫情在全球的暴發(fā)，生物安全及個(gè)人防護(hù)更是迎來了前所未有的挑戰(zhàn)，防護(hù)物資也成為阻止病毒傳播的有效物品，如口罩、防護(hù)服、消毒液等[1]。目前國際上尚無醫(yī)用生物防護(hù)器械對應(yīng)的國際標(biāo)準(zhǔn)化組織，各國家/地區(qū)均采用本國家/地區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)，而各國家/地區(qū)標(biāo)準(zhǔn)的不協(xié)調(diào)限制了全球防疫物資的互通性。在新冠肺炎疫情防控初期，由于我國醫(yī)用生物防護(hù)器械標(biāo)準(zhǔn)與美國、歐盟等國家/地區(qū)標(biāo)準(zhǔn)的不一致、不協(xié)調(diào)，導(dǎo)致我國醫(yī)用生物防護(hù)器械出口貿(mào)易受到阻礙。

國家衛(wèi)生健康委員會印發(fā)的《新型冠狀病毒感染不同風(fēng)險(xiǎn)人群防護(hù)指南和預(yù)防新型冠狀病毒感染的肺炎口罩使用指南》中推薦進(jìn)入人員密集或密閉公共場所佩戴醫(yī)用外科口罩或顆粒物防護(hù)口罩[2]。由于各類普通口罩不能發(fā)揮防護(hù)作用，醫(yī)用口罩備受關(guān)注。醫(yī)用外科口罩對氣溶膠、飛沫等具有良好的過濾阻隔效果，能夠預(yù)防呼吸系統(tǒng)疾病[3-5]，但同時(shí)由于其直接與佩戴者口鼻接觸，自身的微生物污染直接影響佩戴者的身體健康[6]。目前，我國主要依據(jù)《醫(yī)用外科口罩(YY 0469—2011)》[7]對外科口罩進(jìn)行微生物控制；歐盟主要依據(jù)《醫(yī)用口罩 要求和試驗(yàn)方法(EN 14683—2019)》[8]進(jìn)行微生物控制；美國目前沒有外科口罩的國家標(biāo)準(zhǔn)，僅有《醫(yī)用面罩材料的性能規(guī)范(ASTM F2100-19)》，將醫(yī)用外科口罩分為3類，且對微生物清潔度、生物相容性、血液穿透性等作出了相關(guān)規(guī)定[9]，其中并未規(guī)定微生物控制指標(biāo)。我國標(biāo)準(zhǔn)中明確了為一次性使用產(chǎn)品，而歐洲和美國在其產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)中則不局限于一次性產(chǎn)品[10]。本研究主要比較分析YY 0469—2011和EN 14683—2019的微生物試驗(yàn)方法回收率以及對檢測結(jié)果的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 試樣：無菌外科口罩?jǐn)?shù)只。洗脫液：0.9%無菌氯化鈉溶液，由華魯技術(shù)股份有限公司提供；蛋白胨：由北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；氯化鈉：由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；吐溫20：由羅氏公司提供。培養(yǎng)基：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基由北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司提供。菌株：萎縮芽孢桿菌ATCC 9372芽孢懸液。儀器：往復(fù)式搖床(WIGGENS)；微生物過濾裝置(Millipore)，配套水系微孔濾膜(直徑50 mm，孔徑0.45 μm)；電子天平(METTLER TOLEDO)，分度值0.1 g；立式壓力蒸汽滅菌器(SYSTEC)；培養(yǎng)箱(Memmert)；生物安全柜(BIOBASE)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) YY 0469—2011和EN 14683—2019規(guī)定的微生物計(jì)數(shù)方法見表1。本研究依據(jù)《醫(yī)療器械的滅菌 微生物學(xué)方法 第1部分：產(chǎn)品上微生物總數(shù)的測定(GB/T 19973.1—2015)》，用產(chǎn)品接種法[11]制備人工污染試樣，采用微生物回收的方法對兩種計(jì)數(shù)方法進(jìn)行回收率研究。另根據(jù)兩種檢測方法中洗脫液種類、洗脫方式及參數(shù)這兩個(gè)關(guān)鍵方法與環(huán)節(jié)設(shè)計(jì)兩組交叉試驗(yàn)，見表1。

1.2.2 YY 0469—2011方法回收率研究 (1)制備接種芽孢懸液。將萎縮芽孢桿菌ATCC 9372芽孢懸液稀釋至約1 000 CFU/mL，精確測定0.1 mL芽孢懸液的芽孢數(shù)量。(2)制備人工污染試樣。取無菌試樣10 g，共10份，分別向試樣上接種芽孢懸液0.1 mL，在生物安全柜中干燥。(3)供試液制備。將人工污染試樣分別投入到200 mL洗脫液(0.9%無菌氯化鈉溶液)中，手動震蕩混勻，獲得供試液。(4)微生物回收。各取供試液1 mL傾注營養(yǎng)瓊脂，共5個(gè)平板。平板放置35℃培養(yǎng)48 h。點(diǎn)計(jì)平板上的菌落數(shù)并進(jìn)行洗脫菌落數(shù)計(jì)算。(5)回收率計(jì)算。按式(1)計(jì)算每個(gè)試樣的回收率。

(1)

式中：R— 回收率；X—試樣洗脫菌落數(shù)，CFU；Z— 接種芽孢數(shù)，CFU。

1.2.3 EN 14683—2019方法回收率研究 (1)制備接種芽孢懸液。同YY0469—2011接種芽孢懸液的制備方法。(2)制備人工污染試樣。取無菌口罩，共10個(gè)，分別向試樣上接種芽孢懸液0.1 mL，在生物安全柜中干燥。(3)供試液制備。將人工污染試樣分別投入到300 mL洗脫液(1 g/L蛋白胨、5 g/L氯化鈉、2 g/L吐溫20)中，250 rpm搖床振蕩5 min，獲得供試液。(4)微生物回收。各取供試液100 mL進(jìn)行薄膜過濾，濾膜貼至胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上，平板放置30℃培養(yǎng)3 d。點(diǎn)計(jì)平板上的菌落數(shù)并進(jìn)行洗脫菌落數(shù)計(jì)算。(5)回收率計(jì)算。見式(1)。

1.2.4 交叉試驗(yàn)組方法回收率研究 具體試驗(yàn)操作參照1.2.2、1.2.3。

2 結(jié)果

2.1 四種試驗(yàn)方法結(jié)果 EN 14683—2019方法的回收率高達(dá)65.1%，高于YY 0469—2011方法的回收率近4倍。且YY 0469—2011方法回收率僅14.4%。

根據(jù)YY 0469—2011、EN 14683—2019兩種檢測方法中洗脫液種類和洗脫方式及參數(shù)設(shè)計(jì)兩組交叉試驗(yàn)，交叉試驗(yàn)組1與YY 0469—2011試驗(yàn)組比較，因更換洗脫液為1 g/L蛋白胨、5 g/L氯化鈉、2 g/L吐溫20，方法回收率提高到65.6%，表明加有活性成分吐溫20的洗脫液能更好的洗脫微生物；交叉試驗(yàn)組2與EN 14683—2019試驗(yàn)組比較，因更換洗脫方式及參數(shù)為手動振搖，回收率提高到68.6%。且YY 0469—2011、交叉試驗(yàn)組1、交叉試驗(yàn)組2中采用的手動振搖的標(biāo)準(zhǔn)差(3.8、6.6、7.4)較EN 14683—2019中采用機(jī)械振搖方法(8.2)低，表明在微生物洗脫中手動振搖法重復(fù)性及穩(wěn)定性較好。見表2。

2.2 YY 0469—2011、EN 14683—2019方法的修正系數(shù)換算結(jié)果比較 根據(jù)上述YY 0469—2011、EN 14683—2019方法的回收率結(jié)果，比較兩種方法可接受標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)格程度以及對檢測結(jié)果的影響。YY 0469—2011要求細(xì)菌菌落總數(shù)≤100 CFU/g，真菌不得檢出，即微生物總數(shù)≤100 CFU/g；EN 14683—2019要求微生物總數(shù)≤300 CFU/g。假設(shè)某產(chǎn)品A按照YY 0469—2011方法獲得的試驗(yàn)結(jié)果為100 CFU/g，通過修正系數(shù)換算，結(jié)果見表3。

雖然產(chǎn)品A的實(shí)際微生物總數(shù)為694 CFU/g，但按照YY 0469—2011方法進(jìn)行檢測時(shí)，判定為合格產(chǎn)品，按照EN 14683—2019方法檢測時(shí)，產(chǎn)品A獲得的試驗(yàn)結(jié)果為451 CFU/g，此時(shí)已經(jīng)超出EN 14683—2019規(guī)定的限值(300 CFU/g)，此時(shí)可判定產(chǎn)品不合格。

3 討論

在試驗(yàn)方法方面，EN 14683—2019檢測方法具有較高的回收率。方法回收率是定量檢測方法的重要屬性，回收率越高，方法計(jì)數(shù)準(zhǔn)確度也越高。通過設(shè)計(jì)交叉試驗(yàn)組1，認(rèn)為EN 14683—2019方法具有較高回收率的原因是在洗脫液中加入了表面活性劑(吐溫20)。由于口罩的纖維結(jié)構(gòu)不同于普通的膜或袋類，故通過常規(guī)的生理鹽水洗脫污染微生物極其困難，YY 0469—2011試驗(yàn)使用生理鹽水洗脫，微生物回收效率極低(14.4%)，不符合《中國藥典》2020年版四部非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法中規(guī)定的“微生物回收率應(yīng)在0.5～2范圍內(nèi)”的要求[12]，表明該方法對微生物的洗脫效果不理想。ISO 11737—1∶2018標(biāo)準(zhǔn)中指出，當(dāng)用液體從固體表面洗脫微生物時(shí)，可考慮結(jié)合使用表面活性劑[13]，吐溫20是一種非離子型表面活性劑，具有較強(qiáng)的去污能力。馬妮等[14]在對醫(yī)用一次性防護(hù)服生物負(fù)載檢測時(shí)，添加表面活性劑后的微生物回收率反而低于普通洗脫液，考慮到不適量的表面活性成分可能會對微生物有一定影響，因此需嚴(yán)加控制表面活性劑的使用量。通過設(shè)計(jì)交叉試驗(yàn)2，認(rèn)為EN 14683—2019方法雖然具有較高的方法回收率，但仍有需要改進(jìn)的地方，如洗脫方式及參數(shù)更換為手動振搖后，方法回收率也相對提高了5.4%，試驗(yàn)過程中也發(fā)現(xiàn)，EN 14683—2019方法中洗脫液在經(jīng)過機(jī)械振搖后會出現(xiàn)大量泡沫，在一定程度上影響洗脫液的過濾，這也是手動振搖法具有較好洗脫效果的原因。

在可接受標(biāo)準(zhǔn)方面，EN 14683—2019的可接受標(biāo)準(zhǔn)(≤300 CFU/g)實(shí)際要嚴(yán)于YY 0469—2011的可接受標(biāo)準(zhǔn)(≤100 CFU/g)。產(chǎn)品實(shí)際微生物總數(shù)為694 CFU/g，EN 14683—2019的檢測結(jié)果為不合格，而YY 0469—2011的檢測結(jié)果為合格，認(rèn)為方法回收率有較大差異，可一定程度影響各自的檢測結(jié)論。

本研究通過對比分析，YY 0469—2011和EN 14683—2019因檢測方法不同回收率存在較大差異，其中EN 14683—2019的微生物控制方式，包括微生物總數(shù)高回收率的檢測方法以及較為嚴(yán)格的可接受標(biāo)準(zhǔn)，對我國醫(yī)用外科口罩乃至其他非無菌醫(yī)療器械微生物污染指標(biāo)的設(shè)計(jì)具有很大借鑒意義。