顏仁梁，梁永樞，沈小鐘

（廣東食品藥品職業(yè)學院，廣東 廣州 510520）

陳皮為蕓香科植物橘Citrus reticulataBlanco及其栽培變種的干燥成熟果皮，陳皮作為藥用歷史悠久，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，名橘柚，列為上品。2020年版《中國藥典》載有陳皮、廣陳皮2 個藥材品種，其中，廣陳皮（Citrus reticulate‘Chachi’）主產(chǎn)于廣東新會，新會陳皮最為道地，具有理氣健脾、燥濕化痰的功效，現(xiàn)代藥理研究表明，陳皮具有抗氧化、抗腫瘤、降脂等作用[1-2]。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論及歷代本草論述中均認為陳皮“陳久者良”，指出陳皮需放置陳久方能作為藥用。關(guān)于陳皮陳化時限的界定，歷代本草說法不一，有1 a、2 a、3 a 至數(shù)十年、幾十年不等，也有“陳久”“陳年”“多年”“經(jīng)年”等不能明確具體時間的說法[3]。陳皮主要含黃酮類[4-6]、生物堿類[7]、揮發(fā)油[8-10]及多糖[11]類成分，目前研究者對不同貯藏年限陳皮化學成分研究主要集中在黃酮類及揮發(fā)性成分上[8，10，12]，常采用的液質(zhì)聯(lián)用法[13-16]或氣質(zhì)聯(lián)用法[9，17-18]。

鑒于陳皮臨床用藥量大，具有較大藥用價值，本研究采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）結(jié)合植物廣靶代謝組學技術(shù)整體表征3 種不同陳化時間下廣陳皮化合物差異性，利用主成分分析（PCA）和偏最小二乘判別分析法（PLS-DA）等多元統(tǒng)計方法鑒定主導差異的標志性代謝物，發(fā)掘潛在的規(guī)律，并對相關(guān)的代謝通路進行了分析，為深入研究陳皮陳化機制提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

U3000 超快速液相色譜儀（美國Thermo Scien‐tific 公司）；TripleTOF5600 質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX公司）；Concentrator plus 真空濃縮儀（德國Eppen‐dorf 公司）；Microfuge22R 臺式高速冷凍離心機（美國Beckman Coulter 公司）；KQ5200DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；M16710-33 漩渦振蕩器（美國Thermo Scientific公司）。

質(zhì)譜乙腈（美國Thermo Fisher 公司）；質(zhì)譜甲醇（美國Thermo Fisher 公司）；甲酸（美國Sigma-Aldrich公司）。

21 個廣陳皮樣本均采自廣東省江門市新會陳皮核心產(chǎn)區(qū)，部分由世紀茗家新會柑生態(tài)專業(yè)種植合作社提供，經(jīng)廣東食品藥品職業(yè)學院梁永樞副研究員鑒定為蕓香科植物廣陳皮Citrus reticulate‘Chachi’干燥成熟果皮，陳化年份分別為2020年（1 a）、2018年（3 a）和2016年（5 a）新會陳皮，每年7 個樣本，分為3組。樣品及其采樣地與年份見表1。

表1 新會陳皮及其采樣地和年份信息Table 1 Sampling location and storage year information of xinhui Citri reticulatae Pericarpium“Chachi”

2 方法

2.1 樣品制備

稱取300 mg 左右樣品，加入3 mL 色譜甲醇，超聲30 min后，離心（5 000 r/min），取出上清，殘渣再加入3 mL 色譜甲醇，超聲30 min，離心（5 000 r/min），合并上清，上清濃縮至3 mL，過0.22 μm 濾膜后進樣10 μL，用UPLC-MS檢測。

2.2 色譜和質(zhì)譜采集條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Waters ACQUITY BEH C18Column（150 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱溫為35 ℃，流速為0.300 mL/min，流動相：0.1%甲酸水為流動相A，乙腈為流動相B，梯度洗脫程序見表2。

表2 流動相梯度洗脫方案Table 2 Gradient elution procedure of mobile phase

2.2.2 質(zhì)譜條件 分別采用電噴霧電離（ESI）正離子和負離子模式進行檢測。離子源氣1（Gas 1）：50，離子源氣2（Gas 2）：50，氣簾氣（CUR）：25，離子源溫度：500 ℃（正離子）和450 ℃（負離子），離子噴霧電壓浮動（ISVF）：5 500 V（正離子）和4 400 V（負離子），TOF MS 掃描范圍：100～1 200 u，子離子掃描范圍：50～1 200 u，TOF MS 掃描積累時間：0.2 s，子離子掃描積累時間：0.01 s，二級質(zhì)譜采用基于信息采集（IDA）獲得并采用高分辨模式，去簇電壓（DP）：±60 V，碰撞能量：（35±15）eV。

2.3 數(shù)據(jù)處理

通過Analysis Base File Converter軟件將LC-MS獲得的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成ABF格式，將ABF格式文件導入MS-DIAL 4.60 軟件進行預(yù)處理，包括峰提取、去噪音、反卷積，峰對齊，導出CSV 格式的三維數(shù)據(jù)矩陣（原始數(shù)據(jù)矩陣），三維矩陣包括的信息有：樣品信息、保留時間、質(zhì)核比和質(zhì)譜響應(yīng)強度（峰面積），導出時峰面積除去該樣品的稱樣量。將提取的峰信息與數(shù)據(jù)庫進行比對，運用MassBank（http：//www.massbank.jp/），ReSpect（http：//spectra.psc.riken.jp/），GNPS（https：//gnps.ucsd.edu/）3 個質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進行全庫檢索比對鑒定。鑒于代謝組數(shù)據(jù)一般都是多維多變量間高度相關(guān)的，使用傳統(tǒng)的單變量分析方法無法快速、充分、準確地發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)內(nèi)潛在的信息。因此本試驗要運用化學計量學原理和多元統(tǒng)計的方法，對采集的多維數(shù)據(jù)進行降維與歸類分析，采用R 軟件（ropls 包）對三維數(shù)據(jù)矩陣進行主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA），鑒定出3 組廣陳皮樣品間的差異性代謝產(chǎn)物。使用R 軟件繪制熱圖（pheatmap 包）進行層次聚類分析（HCA），以表征3組廣陳皮樣品間代謝物的積累模式。采用KEGG數(shù)據(jù)庫（https：//www.genome.jp/kegg/pathway.html）對鑒定的廣陳皮化合物進行代謝通路分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 廣陳皮代謝組化合物的鑒定

UPLC-MS/MS 首先以正、負離子模式對混樣質(zhì)控QC 樣品進行檢測，質(zhì)控樣本TIC 曲線重疊性高、質(zhì)譜峰保留時間和強度一致，表明所建方法可靠、儀器穩(wěn)定性較好。所獲得的代謝物高分辨二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)與公共數(shù)據(jù)庫比對，共鑒定562個化合物，其中黃酮化合物109 個［如：3′-羥基-4′，5，6，7，8-五甲氧基黃酮（3′-demethylnobiletin）、5-羥基-6，7，8，4′-四甲氧基黃酮（gardenin B）］、苷類成分86 個、萜類50 個、酸性物質(zhì)及其衍生物54 個，此外還包含少量脂類（7 個）、蒽酮（5 個）等物質(zhì)，其中鑒定分數(shù)（total score）大于90%的成分31個，見表3。不同離子模式下UPLC-MS/MS總離子流圖如圖1A，1B所示。

圖1 不同陳化時間廣陳皮化合物正離子（A）和負離子（B）模式總離子圖譜Figure 1 Total ion maps of compounds from Citri reticulatae Pericarpium “Chachi” under different aging years under positive ion model（A）and negative ion model（B）

表3 不同陳化時間廣陳皮鑒定分數(shù)大于90%以上的代謝物Table 3 Metabolites with scores above 90 identified in Citri reticulatae Pericarpium“Chachi”under different aging years

3.2 廣陳皮代謝組代謝通路分析

對鑒定的562 個成分進行KEGG 代謝通路分析，共發(fā)現(xiàn)119個成分能映射到KEGG 數(shù)據(jù)庫，其中涉及的代謝通路有14條，分別為不飽和脂肪酸的生物合成（biosynthesis of unsaturated fatty acids）、黃酮類生物合成（flavonoid biosynthesis）、黃酮和黃酮醇的生物合成（flavone and flavonol biosynthesis）、角質(zhì)、軟木脂和蠟的生物合成（cutin，suberine and wax biosynthesis）、玉米素生物合成（zeatin biosynthesis）、淀粉和蔗糖代謝（starch and sucrose metabolism）、脂肪酸伸長率（fatty acid elongation）、色氨酸代謝（tryptophan metabolism）、半乳糖代謝（galactose metabolism）、α-亞麻酸代謝（alpha-linolenic acid metabolism）、苯丙烷生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）、脂肪酸降解（fatty acid degradation）、脂肪酸生物合成（fatty acid biosynthesis）、嘌呤代謝（purine metabolism）。

3.3 廣陳皮代謝組多元變量統(tǒng)計分析

采用的多元變量統(tǒng)計分析包括主成分分析（PCA），偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）。代謝組數(shù)據(jù)經(jīng)標準化處理后進行PCA 分析，PCA 得分見圖2，表明各組樣本成分有一些重疊，所建立方法可一定程度上表征不同陳化年限廣陳皮代謝物的差異性。由于PCA 分析不能忽略組內(nèi)誤差、消除與研究目的無關(guān)的隨機誤差，過分關(guān)注于細節(jié)、忽略了整體和規(guī)律，最終不利于發(fā)現(xiàn)組間差異和差異化合物。所以，又進行了PLS-DA分析。

圖2 廣陳皮廣靶代謝組PCA分析Figure 2 Widely targeted metabonomic PCA analysis of Citri reticulatae Pericarpium“Chachi”

本研究廣陳皮代謝組PLS-DA分析結(jié)果見圖3，R2為0.999 37，表示模型可靠，分析顯示，不同組間代謝物積累模式存在明顯的差異，同一組的樣本代謝物積累趨勢較為一致且高度聚合一支。說明3組樣品的代謝輪廓存在差異，總體說明不同年份的廣陳皮是有差異的。PLS 與PCA 分析時，前5種代表性化合物為：四甲基高黃芩素、梔子黃素B、5-O-去甲腎上腺素、6-羥基-7-甲氧基香豆素、橙黃酮。PLS-DA 載荷圖見圖4，結(jié)果顯示，24-表羅漢松甾酮A、蒜藜蘆堿、五味子酚、咖啡醇、robustic acid、水化氧化前胡素是對這個模型貢獻比較大的物質(zhì)。

圖3 廣陳皮代謝組PLS-DA分析Figure 3 Widely targeted metabonomic PLS-DA analysis of Citri reticulatae Pericarpium“Chachi”

圖4 廣陳皮代謝組PLS-DA分析載荷圖Figure 4 Widely targeted metabonomic PLS-DA analysis loading diagram of Citri reticulatae Pericarpium“Chachi”

3.4 不同陳化年限廣陳皮差異代謝物分析

本研究中，差異代謝物是指在倍數(shù)檢驗中|log2FC|值大于0.58（FC 大于1.5）并且T檢驗中P值小于0.05，并且在PLS-DA 中變量投影重要度值（variable importance for the projection,VIP）大于1的物質(zhì)。VIP值可以衡量各代謝物組分含量對樣本分類判別的影響強度和解釋能力，輔助標志代謝物的篩選（閾值通常設(shè)為1）。本研究結(jié)果顯示：不同陳化年限廣陳皮代謝物中有387 種是共有的，占總檢出成分的68.86%；另外，3組樣品間的差異代謝物175 個，占總檢出成分的31.14%，其中陳化5 a 組與1 a組比較差異代謝物最多有126個（其中千屈茶堿-D3、苦丁冬青苷D、粉防己堿等75 個化合物含量增加，千金藤素、桑皮苷C、蔓荊子黃素等51 個化合物含量下降），陳化3 a 組與1 a 組比較差異代謝物有105個（其中千屈茶堿-D3、原阿片堿、秋水仙堿等78個化合物含量增加，蔓荊子黃素、桑皮苷C、闊葉千里光堿等27 個化合物含量下降），陳化5 a 組與3 a組比較差異代謝物最少，僅41 個（其中二氫吳茱萸新堿、天門冬氨酸、地骨皮乙素等31 個化合物含量下降，三角葉薯蕷皂苷、苦丁冬青苷D、andrastin A 等10 個化合物含量增加），各組差異代謝物分布情況見圖5。

圖5 不同陳化年限廣陳皮差異代謝物比較韋恩圖Figure 5 Venn diagram for differential metabolite comparison of Citri reticulatae Pericarpium “Chachi” under different aging years

聚類分析結(jié)果以熱圖表示，熱圖表現(xiàn)的是一個數(shù)據(jù)矩陣，通過使用顏色梯度使數(shù)據(jù)間的差異實現(xiàn)可視化，通過數(shù)據(jù)縮放，保留較大差異，同時也能突顯較小差異。不同顏色的區(qū)域代表不同的聚類分組信息，同組內(nèi)的代謝模式相似，可能具有相似的功能或參與相同的生物學過程。因此，通過將代謝模式相同或者相近的代謝物聚成類，可以用來推測已知或未知代謝物的生物學功能。在175個差異代謝物中有42個化合物映射到KEGG 數(shù)據(jù)庫，涉及不飽和脂肪酸的生物合成、角質(zhì)、軟木脂和蠟的生物合成、脂肪酸伸長率、α-亞麻酸代謝、色氨酸代謝、脂肪酸降解、苯丙烷生物合成、脂肪酸生物合成這8條代謝通路。

42 個差異代謝物的熱圖分析結(jié)果見圖6，其在各組中的含量比較結(jié)果見表4。

表4 不同陳化年限廣陳皮42個KEGG差異代謝物信息Table 4 Information of 42 KEGG different compounds detected in Citri reticulatae Pericarpium“Chachi”under different aging years

圖6 廣陳皮廣靶代謝組熱圖分析Figure 6 Widely targeted metabonomic clustering heat map analysis of Citri reticulatae Pericarpium“Chachi”

4 討論

本研究利用廣靶代謝組學技術(shù)對3種陳化年限的21 個廣陳皮樣品進行成分分析，共檢測到562 個化學成分，主要成分為黃酮類（109 個）和苷類（86個）等，略高于曹烙文等[19]利用頂空固相微萃取-全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜結(jié)合化學計量學方法檢測到的約500 種廣陳皮化合物。分析發(fā)現(xiàn)其中119 個成分能映射到KEGG 數(shù)據(jù)庫，涉及不飽和脂肪酸的生物合成、黃酮類生物合成、黃酮和黃酮醇的生物合成等14 條代謝通路，與文獻報道一致[20]。本研究采用廣靶代謝組學技術(shù)對不同陳化年限廣陳皮化學成分進行分析，結(jié)合進行應(yīng)用多元統(tǒng)計分析和熱圖區(qū)分，建立一種快速鑒別廣陳皮成分的方法，為通過成分確定廣陳皮真實的陳化年份奠定了科學基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)的562 個廣陳皮化學成分中，不同陳化年限廣陳皮差異代謝物有175個，說明5 a陳化過程中約2/3的成分保持穩(wěn)定，1/3是差異代謝物，不同陳化年限廣陳皮代謝物有較大差異，在五年的陳化過程中，隨著陳化時間的增加，廣陳皮化學成分逐漸趨于穩(wěn)定，差異代謝物的聚類分析結(jié)果也顯示了這一特征。另外，本文研究結(jié)果表明，與陳化1 a組比較，陳化3 a組和陳化5 a組差異化學成分較多，而且以含量增加的成分數(shù)量多于含量減少的成分數(shù)量；與陳化3 a組的差異化學成分比較，陳化5 a組差異代謝物以含量減少為主，說明廣陳皮陳化3～5 a間化學成分有一個相對較多的頂峰階段。有學者[13]報道采用超高效液相色譜四極桿/飛行時間質(zhì)譜（UPLC-QTOFMS）的代謝組學技術(shù)鑒定出31 種代謝物來區(qū)分不同貯藏年份的新會陳皮與普通陳皮，其中僅3′-羥基-4′，5，6，7，8-五甲氧基黃酮、5-羥基-6，7，8，4′-四甲氧基黃酮（去甲基橘皮素）這兩個化合物與本試驗發(fā)現(xiàn)的175 種差異代謝物相一致；另外，他們研究發(fā)現(xiàn)，代謝物水平在陳化3～10 a 后升高，在陳化15～30 a 后降低，與本試驗結(jié)果不一致。因為本試驗僅對陳化5 a內(nèi)的廣陳皮樣本進行研究，隨著存儲年限再延長，廣陳皮成分是否會產(chǎn)生新的差異？亟待下一步驗證研究。

3 組不同陳化年限成品差異化學成分分析結(jié)果顯示，在175 個差異代謝物中有42 個化合物映射到KEGG 數(shù)據(jù)庫，涉及不飽和脂肪酸的生物合成、角質(zhì)、軟木脂和蠟的生物合成、脂肪酸伸長率、α-亞麻酸代謝、色氨酸代謝、脂肪酸降解、苯丙烷生物合成、脂肪酸生物合成等8 條代謝通路。在活性差異化合物方面，隨著陳化時間的增加，3 組共有的差異代謝物奎拉酸和地骨皮乙素均呈現(xiàn)下降趨勢，次野鳶尾黃素、闊葉千里光堿等成分含量降低，但千屈茶堿-D3、粉防己堿、原阿片堿、秋水仙堿、土大黃苷、十六烷二酸、納曲酮、獐牙菜苦苷、野鳶尾黃素、奎寧、甲芬那酸、去氫紫堇堿、橘皮素、高三尖杉酯堿、胭脂紅酸含量均升高，暗示這些增加的成分可能是廣陳皮陳化質(zhì)優(yōu)的物質(zhì)基礎(chǔ)，如橘皮素（tangeritin）是Notch-1 的有效抑制劑，具有保護神經(jīng)[21]、抑制脂肪生成[22]等作用；原阿片堿（protopine）具有抗腫瘤[23]、抗炎活性[24]；秋水仙堿（colchicine）具有降脂[25]、抗炎[26]等作用，廣陳皮陳化后使用增效降燥機制是否與這些成分變化有關(guān)，有待進一步研究。