黃鳳蕊，黃淡霞，黃楚燕

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510405)

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion，MIRI)指冠狀動脈缺血缺氧一定時(shí)間后恢復(fù)正常血流灌注時(shí)，缺血心肌組織損傷進(jìn)行性加重的過程，臨床多見于冠狀動脈搭橋術(shù)、溶栓術(shù)等術(shù)后的血管再通過程[1]。既往研究[2-3]認(rèn)為，MIRI是由于再灌注過程中，氧自由基的大量合成、炎性因子的大量釋放、鈣離子超負(fù)荷等引起的心功能障礙和心肌損傷，可影響患者心肌缺血后心功能的恢復(fù)。艾塞那肽是一種人工合成的胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)類似物，其生物學(xué)效應(yīng)與GLP-1類似，臨床常用于降血糖，保護(hù)心血管[4]。已有研究[5-6]顯示，艾塞那肽可降低MIRI大鼠的氧化應(yīng)激水平，減輕MIRI損傷，改善心功能。再灌注過程中產(chǎn)生的大量氧自由基可以激活線粒體凋亡途徑，誘導(dǎo)心肌組織細(xì)胞凋亡[7]。本研究擬探討艾塞那肽對MIRI大鼠線粒體凋亡途徑的影響，以分析其保護(hù)心肌組織的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑與儀器

艾塞那肽注射液購自美國Baxter Pharmaceutical Solutions LLC；TUNEL組織細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自中國艾美捷科技有限公司；肌酸激酶同工酶-MB(creatine kinase-MB，CK-MB)、肌紅蛋白(myoglobin，Mb)、心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-px)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒均購自南京森貝伽生物科技有限公司；組織線粒體分離試劑盒購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；兔抗鼠B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)基因、Bcl相關(guān)蛋白(Bcl-assaciated X protein，Bax)、細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt-c)、活化半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved caspase-3)、β-actin單克隆抗體和辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的二抗均購于美國CST公司；光學(xué)顯微鏡(BX60型)，由日本OLYMPUS公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

SD大鼠36只，SPF級，均為雄性，體重260～280 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供[許可證號SCXK(粵)2018-0034]，飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心實(shí)驗(yàn)室[許可證號SYXK(粵)2018-0001]。

1.3 動物造模和藥物干預(yù)

36只SD大鼠預(yù)飼養(yǎng)7 d后，采用隨機(jī)數(shù)表法分為假手術(shù)組(n=12)、MIRI組(n=12)、艾塞那肽組(n=12)。除假手術(shù)組外，所有大鼠均參考已有文獻(xiàn)制備MIRI模型[8]，方法：常規(guī)麻醉，依次剪毛、消毒皮膚、打開胸腔，暴露心臟，找到左冠狀靜脈主干，在距根部2 mm左右處，采用線栓結(jié)扎MIRI組和艾塞那肽組大鼠的冠狀動脈左前降支，30 min后松開線栓，恢復(fù)局部組織血流灌注，恢復(fù)灌注120 min后，采集組織標(biāo)本，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。若線栓結(jié)扎后，心肌組織出現(xiàn)顏色變化，且心電圖顯示大鼠的ST段抬高則為造模成功。假手術(shù)組大鼠只插入線栓，不結(jié)扎冠狀動脈。缺血前1 h，艾塞那肽組大鼠皮下注射10 μg/kg艾塞那肽(溶于生理鹽水)進(jìn)行預(yù)處理。假手術(shù)組和MIRI組皮下注射等體積生理鹽水。

1.4 標(biāo)本采集及心肌梗死面積檢測

再灌注120 min后，采集各組大鼠的頸動脈血液2 mL，設(shè)置轉(zhuǎn)速為3 000 rpm，離心10 min，分離上清，暫存于-20 ℃冰箱保存。再次結(jié)扎冠狀動脈前降支，經(jīng)頸靜脈注入1%伊文斯藍(lán)溶液2 mL，待大鼠口唇及肢體變藍(lán)，分離左心室組織，切片，進(jìn)行2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色，缺血區(qū)為紅色，梗死區(qū)為白色，正常心肌為藍(lán)色，經(jīng)Image-pro Plus軟件分析各組梗死面積。分離心臟組織，一部分暫存于-80 ℃冰箱保存，用于檢測組織中蛋白表達(dá)，另一部分置于甲醛中固定，用于檢測心肌組織損傷。

1.5 HE染色和TUNEL染色檢測各組大鼠心肌組織損傷

取甲醛固定的心肌組織，常規(guī)制作切片，一份切片采用TUNEL染色，依次進(jìn)行脫蠟至水、蛋白酶K細(xì)胞通透、多聚甲醛固定、封閉，加入100 μL TUNEL反應(yīng)混合液在37 ℃暗濕盒中反應(yīng)1 h，終止反應(yīng)后使用0.3%的H2O2封閉5 min，100 μL Streptavidin-HRP工作液反應(yīng)30 min，依次顯色、脫水、透明和封片，光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況，每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野拍照，計(jì)算每個(gè)視野下細(xì)胞總數(shù)及陽性細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算出比值，則視為細(xì)胞凋亡率。另一份切片經(jīng)HE染色后，在光學(xué)顯微鏡觀察三組大鼠組織的病理變化。

1.6 血清CK-MB、Mb、cTnI的測定

取大鼠血清，采用ELISA法檢測血清CK-MB和Mb水平，間接競爭ELISA法檢測血清cTnI水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。

1.7 心肌組織中相關(guān)因子的測定

將凍存的心肌組織取出后，勻漿，取上清，采用試劑盒檢測心肌組織SOD水平，比色法檢GSH-px水平，硫代巴比妥酸法檢測MDA水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。

1.8 Western blot檢測心肌組織Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3和Cyt-c表達(dá)情況

將凍存的心肌組織分成兩份，一份勻漿后，直接提取總蛋白，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加一抗(Bcl-2、Bax和Cleaved Caspase-3，稀釋比例均為1∶500)，4 ℃孵育過夜，加二抗，室溫孵育2 h，顯影，β-actin為內(nèi)參，凝膠成像系統(tǒng)分析各蛋白條帶，計(jì)算各組蛋白相對β-actin的表達(dá)量。另一份采用試劑盒提取線粒體和胞質(zhì)蛋白，向心肌組織中加入1 mL胞質(zhì)提取Buffer，冰上均質(zhì)30～50次，渦旋，離心(4 ℃，3 000 rpm，10 min)，取上清，離心(12 000 rpm，30 min)，將上清再次離心(4 ℃，3 000 rpm，10 min)，取上清為胞質(zhì)蛋白，向沉淀中加入1 mL胞質(zhì)提取Buffer，依次進(jìn)行渦旋，離心，取沉淀為線粒體，以β-actin為內(nèi)參，檢測線粒體和胞漿中Cyt-c蛋白相對β-actin的表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 艾塞那肽對MIRI大鼠心肌組織病理變化的影響

HE染色后經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察可見，假手術(shù)組大鼠的心肌組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，未見明顯異常；MIRI組顯示心肌纖維斷裂，大量細(xì)胞出現(xiàn)變性、壞死，且伴隨大量炎性細(xì)胞浸潤；與MIRI組比較，艾塞那肽組顯示心肌纖維斷裂減少，部分細(xì)胞出現(xiàn)了變性、壞死，病變明顯減輕。見圖1。艾塞那肽組大鼠的心肌梗死面積低于MIRI組[(34.72±5.63)%vs.(51.22±8.40)%，P<0.05]。

2.2 艾塞那肽對MIRI大鼠血清心肌損傷標(biāo)志物的影響

艾塞那肽組的血清CK-MB、Mb和cTnI水平低于MIRI組(P<0.05)；MIRI組血清CK-MB、Mb和cTnI水平高于假手術(shù)組(P<0.05)。見表1。

表1 血清心肌損傷標(biāo)志物水平

2.3 艾塞那肽對MIRI大鼠心肌組織MDA、SOD和GSH-px水平的影響

艾塞那肽組心肌組織MDA水平低于MIRI組，SOD和GSH-px水平高于MIRI組(P<0.05)；MIRI組各指標(biāo)水平變化均大于假手術(shù)組(P<0.05)。見表2。

表2 心肌組織MDA、SOD和GSH-px水平

2.4 艾塞那肽對MIRI大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡的影響

艾塞那肽組心肌組織細(xì)胞凋亡率低于MIRI組[(18.25±4.10)%vs.(27.83±5.26)%，P<0.05]，MIRI組心肌組織細(xì)胞凋亡率高于假手術(shù)組[(27.83±5.26)%vs.(7.82±1.55)%，P<0.05]。見圖2。

2.5 艾塞那肽對MIRI大鼠心肌組織Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3和Cyt-c表達(dá)的影響

艾塞那肽組心肌組織Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3和胞漿Cyt-c表達(dá)水平低于MIRI組，線粒體Cyt-c表達(dá)高于MIRI組(P<0.05)；MIRI組心肌組織Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3和胞漿Cyt-c表達(dá)水平均高于假手術(shù)組，線粒體Cyt-c表達(dá)水平低于假手術(shù)組(P<0.05)。見圖3及表3。

表3 心肌組織Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3和Cyt-c表達(dá)

3 討論

MIRI是缺血組織恢復(fù)血流供應(yīng)時(shí)損傷加重的現(xiàn)象，與缺血時(shí)間、側(cè)支循環(huán)、需氧程度等多種因素有關(guān)，可導(dǎo)致嚴(yán)重的心律失常，甚至猝死，臨床尚缺乏治療的特效藥物[9]。GLP-1受體廣泛分布于大鼠和人類的血管內(nèi)皮、冠狀動脈、心肌細(xì)胞中，GLP-1可與相應(yīng)受體結(jié)合，發(fā)揮心肌保護(hù)作用，增強(qiáng)胰島素敏感性[10]。艾塞那肽是GLP-1同源物，與GLP-1具有相似的作用，且穩(wěn)定性好，可以促進(jìn)心肌細(xì)胞的能量代謝，減輕心肌組織的缺血缺氧損傷，改善心功能[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，艾塞那肽可降低MIRI大鼠的心肌梗死面積，減輕心肌組織損傷，說明艾塞那肽可以保護(hù)MIRI大鼠心肌組織免于損傷。本研究結(jié)果還顯示，相比于假手術(shù)組，MIRI大鼠血清中CK-MB、Mb和cTnI水平升高，經(jīng)艾塞那肽作用后，其水平降低。CK-MB、Mb和cTnI均在心肌組織內(nèi)分布廣泛，在心肌細(xì)胞受到損傷時(shí)，可以釋放進(jìn)入血液循環(huán)，引起血清中水平升高，是臨床常用的反映心肌組織損傷的標(biāo)志蛋白[12]。艾塞那肽可能通過改善心肌細(xì)胞的能量代謝，減輕MIRI大鼠的心肌細(xì)胞損傷，降低血清中心肌損傷標(biāo)志物水平。王東娟等[13]研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1可以調(diào)節(jié)機(jī)體的氧化應(yīng)激信號通路，減輕心肌組織的氧化應(yīng)激損傷，說明艾塞那肽可能也通過調(diào)節(jié)MIRI大鼠的氧化應(yīng)激水平，保護(hù)心肌組織，其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

本研究中，相比于假手術(shù)組，MIRI大鼠心肌組織中MDA水平顯著升高，SOD和GSH-px顯著降低，經(jīng)艾塞那肽作用后，MDA顯著降低其水平，SOD和GSH-px水平顯著升高。SOD和GSH-px是機(jī)體主要的抗氧化酶，可與體內(nèi)過多的過氧化物作用，并通過氧化還原反應(yīng)將其轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)，抑制氧自由基產(chǎn)生，降低細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平[14]。MDA是細(xì)胞內(nèi)氧自由基代謝過程中生成的中間產(chǎn)物，可以反映機(jī)體的氧化應(yīng)激水平[15]。機(jī)體氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡產(chǎn)生的大量氧自由基可以破壞線粒體膜結(jié)構(gòu)，影響心肌細(xì)胞能量代謝障礙，激活線粒體凋亡途徑，誘導(dǎo)心肌組織細(xì)胞死亡，導(dǎo)致MIRI損傷[16-17]。表明艾塞那肽可能通過維持氧化/抗氧化平衡，改善心肌細(xì)胞能量代謝，減輕MIRI大鼠心肌組織氧化應(yīng)激損傷。

本研究發(fā)現(xiàn)，相較于假手術(shù)組，MIRI大鼠的Bax/Bcl-2和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)升高，胞漿Cyt-c升高，線粒體Cyt-c下降，心肌細(xì)胞凋亡率升高，經(jīng)艾塞那肽干預(yù)后，Bax/Bcl-2和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)下降，細(xì)胞凋亡率下降，表明艾塞那肽可以抑制凋亡蛋白表達(dá)，抑制MIRI大鼠的細(xì)胞凋亡。Bcl-2/Bax是1組重要的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞線粒體膜的通透性，介導(dǎo)多種細(xì)胞凋亡。正常情況下，Bcl-2位于線粒體膜表面，在凋亡信號刺激下，細(xì)胞核的Bax會轉(zhuǎn)移至線粒體膜表面與Bcl-2相結(jié)合，引起線粒體膜結(jié)構(gòu)變化，繼發(fā)通透性改變，線粒體Cyt-c釋放入胞漿，激活細(xì)胞凋亡信號通路[18]。線粒體Cyt-c釋放入細(xì)胞漿后，與相應(yīng)的凋亡蛋白酶激活因子結(jié)合，激活Caspase凋亡級聯(lián)反應(yīng)，啟動細(xì)胞凋亡程序[19]。Cleaved Caspase-3是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白，可進(jìn)入細(xì)胞核，裂解相應(yīng)的多種胞質(zhì)胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[20]。本研究表明，艾塞那肽可能通過抑制線粒體凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax表達(dá)，抑制線粒體Cyt-c釋放，抑制心肌細(xì)胞凋亡。Yu等[21]研究顯示，MIRI大鼠再灌注過程中大量生成的氧自由基可以激活線體體凋亡途徑，誘導(dǎo)心肌組織細(xì)胞損傷，本研究結(jié)果與其相似，即艾塞那肽可能通過降低MIRI大鼠氧化應(yīng)激水平，抑制心肌細(xì)胞凋亡，減輕心肌組織損傷。

綜上，艾塞那肽可降低MIRI大鼠的氧化應(yīng)激水平，抑制心肌組織細(xì)胞凋亡，減輕心肌組織損傷。但本研究尚處于基礎(chǔ)研究階段，仍需大量的臨床前研究以進(jìn)一步驗(yàn)證。