外源非淀粉多糖酶復(fù)合配比優(yōu)化及其對(duì)體外發(fā)酵特性的影響

薛玉洋 孫浩彬 王銀玲 李佳橙 劉保倉(cāng),2 韓 坤,2 齊亞銀 陳 程* 張文舉*

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832003；2.新疆泰昆集團(tuán)昌吉飼料有限責(zé)任公司，昌吉 831199)

纖維是反芻動(dòng)物的主要能量來(lái)源[1]，是構(gòu)成細(xì)胞壁的主要成分。由于其復(fù)雜的結(jié)合形式，限制了胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的降解，導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大量排泄和細(xì)胞壁部分不完全利用，在理想飼喂條件下，其降解率仍不超過(guò)65%。因此，為降解細(xì)胞壁釋放胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，提高飼料利用率，研究人員提出過(guò)許多方法，如添加不同的化學(xué)物質(zhì)(氫氧化鈉、尿素等)、粉碎揉碎原料、進(jìn)行生物處理等，但結(jié)果都不能達(dá)到需求。吳爽[2]研究表明，在飼糧中添加外源纖維復(fù)合酶可有效提高反芻動(dòng)物的采食量和飼料轉(zhuǎn)化率，且添加外源纖維復(fù)合酶可提高底物可發(fā)酵部分，改善瘤胃發(fā)酵；另有研究表明添加外源纖維復(fù)合酶可降低腸道食糜黏度，提高纖維消化率[3]，釋放出可支持有益于微生物區(qū)系的低聚糖，同時(shí)抑制致病菌增殖[4]。因此，添加外源復(fù)合非淀粉多糖酶制劑(來(lái)自具有高纖維素和半纖維素活性的真菌、細(xì)菌)是提高動(dòng)物能量利用率和生產(chǎn)性能的有效途徑之一。將其以液體或顆粒形式與飼糧、干草、青貯、精料等飼料混合，可破解細(xì)胞壁，從而釋放更多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，提高飼料的消化率[5]。本試驗(yàn)通過(guò)體外發(fā)酵法研究外源非淀粉多糖酶的最適配比及對(duì)體外發(fā)酵的綜合影響效果，探討外源復(fù)合非淀粉多糖酶的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控作用，為外源酶制劑在生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及供體動(dòng)物

試驗(yàn)所用非淀粉多糖酶制劑均由山東某酶制劑有限公司提供。4種酶制劑纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶的菌種來(lái)源為里氏木霉，標(biāo)識(shí)酶活分別為300 000、300 000、50 000和50 000 U/g。其他試劑除特殊說(shuō)明外，均為分析純，水均為符合GB/T 6682-2008中規(guī)定的二級(jí)水。

在石河子大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)站選取6只60日齡的羊作為瘤胃液供體羊。基礎(chǔ)飼糧根據(jù)NRC(2004)日增重100 g肉羊的營(yíng)養(yǎng)需要量配制，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目 Items含量 Content粗脂肪 EE2.82粗蛋白質(zhì) CP18.94中性洗滌纖維 NDF19.21酸性洗滌纖維 ADF10.26鈣 Ca0.66磷 P0.44消化能 DE/(MJ/kg)12.40

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 模擬瘤胃條件下單酶活性測(cè)定

酶活測(cè)定采用3，5-二硝基水楊酸(DNS)法，分光光度計(jì)(精科721G，上海)540 nm處測(cè)量吸光度值。纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶活性測(cè)定所用底物分別為羧甲基纖維素鈉、小麥粉木聚糖(可溶性)和小麥粉木聚糖(不可溶性)、葡聚糖、甘露聚糖。

本試驗(yàn)中酶活定義為：在39 ℃、pH 6.5條件下，每分鐘從1 mg/mL溶液中釋放1 μmoL還原糖所需酶量，即定義為1個(gè)酶活單位(U)。

1.2.2 單酶最適添加量的體外篩選

采用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將4種酶按照在飼糧中的添加量分別設(shè)定7個(gè)水平(0、50、125、250、750、1 000、2 000 U/g，干物質(zhì)基礎(chǔ))，每個(gè)水平設(shè)3個(gè)重復(fù)，添加到飼糧中，模擬瘤胃體外消化試驗(yàn)，培養(yǎng)12 h，并記錄12 h累積產(chǎn)氣量(GP)及干物質(zhì)降解率(DMD)。

1.2.3 復(fù)合酶酶譜的體外篩選

根據(jù)單酶最適添加量的體外篩選試驗(yàn)結(jié)果，將纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶再設(shè)計(jì)3個(gè)梯度。按照三元正交表中L9(34)設(shè)計(jì)9組復(fù)合酶配比，進(jìn)行體外瘤胃消化試驗(yàn)。記錄不同時(shí)間段(2、6、8、12、24、36、48 h)的GP及發(fā)酵48 h后pH、DMD。采用正交試驗(yàn)極差分析方法，求出體外酶解反應(yīng)中pH、平均GP和DMD提高率3個(gè)指標(biāo)下4種酶的主次順序，并得出最佳配比。

表2 試驗(yàn)因素與水平

表3 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案

1.2.4 外源復(fù)合非淀粉多糖酶對(duì)瘤胃體外發(fā)酵特性的影響

根據(jù)復(fù)合酶酶譜的體外篩選試驗(yàn)結(jié)果，確定4種酶最佳配比為纖維素酶∶木聚糖酶∶β-葡聚糖酶為∶甘露聚糖酶=1 000∶250∶500∶50(U/g，干物質(zhì)基礎(chǔ))。再設(shè)定2組，分別為對(duì)照組(基礎(chǔ)飼糧)和試驗(yàn)組(基礎(chǔ)飼糧+復(fù)合酶)。每組設(shè)置24個(gè)玻璃注射器。培養(yǎng)至2、4、6、8、12、24、48 h，隨機(jī)取3個(gè)注射器快速讀取活塞所處刻度值并測(cè)定pH，用冰水終止反應(yīng)，抽取發(fā)酵液用低溫離心機(jī)(4 ℃，5 400 r/min，10 min)離心，取上清液-20 ℃條件下保存，用來(lái)測(cè)定總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)、乙酸(acetic acid)、丙酸(propionic acid)、丁酸(butyric acid)的濃度、氨態(tài)氮(NH3-N)、微生物蛋白(MCP)的含量，并計(jì)算乙丙比(A/P)；將玻璃注射器內(nèi)的濾袋取出，沖洗干凈后，105 ℃烘干，稱重，用來(lái)測(cè)定發(fā)酵后DMD。

1.3 體外發(fā)酵及樣品采集

晨飼前采集瘤胃內(nèi)容物，裝于提前預(yù)溫并充滿CO2的保溫瓶中，用4層紗布過(guò)濾在預(yù)熱39 ℃的容器中并持續(xù)通CO25 min。整個(gè)操作于39 ℃水浴中進(jìn)行。按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在飼糧中加入相應(yīng)的酶，混合均勻。根據(jù)Menke等[6]的方法將瘤胃液與人工培養(yǎng)液以1∶2的體積混合制成人工瘤胃液，每個(gè)注射器中加入200 mg飼糧和30 mL人工瘤胃液后，迅速放入39 ℃恒溫振蕩水浴箱中。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及測(cè)定方法

發(fā)酵液用pH計(jì)(力辰科技筆式酸度計(jì)pH-10，上海)測(cè)定；NH3-N濃度使用比色法測(cè)定[7]；MCP濃度采用試劑盒(北京全式金生物技術(shù)公司)使用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Multiskan GO，美國(guó))測(cè)定，測(cè)定方法按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行；揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度采用液相色譜儀(Agilent 1100，美國(guó))測(cè)定[8]。發(fā)酵殘?jiān)?05 ℃烘箱中烘12 h至恒重后測(cè)定干物質(zhì)含量。

DMD(%)=[(樣本干物質(zhì)重-殘?jiān)晌镔|(zhì)重+
空白干物質(zhì)重)/樣本干物質(zhì)重]×100。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)整理后，采用SPSS 19.0軟件對(duì)單酶添加量進(jìn)行單因素方差分析，復(fù)合酶酶譜的體外篩選試驗(yàn)進(jìn)行正交極差分析，外源復(fù)合非淀粉多糖酶體外發(fā)酵試驗(yàn)采用一般線性模型進(jìn)行方差分析，試驗(yàn)結(jié)果以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示。采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 模擬瘤胃條件下單酶活性測(cè)定結(jié)果

模擬瘤胃(39 ℃，pH 6.5)條件下測(cè)得的纖維素酶、木聚糖酶(底物為可溶性)、木聚糖酶(底物為不可溶性)、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶的活性分別為18 000、76 000、100 000、61 000、30 000 U/mL。

2.2 單酶最適添加量的體外篩選

4種單酶不同添加量對(duì)GP和DMD的影響分別見圖1、圖2。由圖可知，GP和DMD均隨纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶添加量的增加呈現(xiàn)先增加后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)。根據(jù)表6中差異顯著性分析結(jié)果判斷出單酶最適添加量。

根據(jù)圖1、圖2和表6得出，纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶體外發(fā)酵GP最優(yōu)的添加量分別為750、125、750、125 U/g；對(duì)DMD最優(yōu)的添加量分別為125、125、750、125 U/g。綜合GP和DMD 2個(gè)指標(biāo)，確定飼糧在體外發(fā)酵時(shí)各單酶的最佳添加量為纖維素酶750 U/g、木聚糖酶125 U/g、葡聚糖酶750 U/g、甘露聚糖酶125 U/g。

2.3 外源復(fù)合非淀粉多糖酶酶譜的體外篩選

不同配比的非淀粉多糖酶對(duì)瘤胃體外發(fā)酵的pH、GP和DMD的影響如表7所示。采用正交試驗(yàn)極差法得出，4種單酶對(duì)pH的影響主次順序依次為纖維素酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶，最佳組合配比為A3B1C1D3；4種單酶對(duì)GP的影響主次順序依次為纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶，最佳組合配比為A3B3C1D2；4種單酶對(duì)DMD的影響主次順序依次為木聚糖酶、纖維素酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶，最佳組合配比為A3B3C1D3；

圖1 4種單酶不同添加量對(duì)體外GP的影響

圖2 4種單酶不同添加量對(duì)體外DMD的影響

根據(jù)pH、GP和DMD這3項(xiàng)指標(biāo)的極差分析的試驗(yàn)結(jié)果，最終以編號(hào)為9的組合A3B3C1D1[纖維素酶∶木聚糖酶∶β-葡聚糖酶∶甘露聚糖酶=1 000∶250∶500∶50(U/g，干物質(zhì)基礎(chǔ))]為最優(yōu)配比。

2.4 外源復(fù)合非淀粉多糖酶對(duì)瘤胃體外發(fā)酵特性的影響

外源復(fù)合非淀粉多糖酶對(duì)瘤胃體外發(fā)酵特性的影響見表8。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組48 h 平均DMD極顯著升高6.67%(P<0.01)，處理和發(fā)酵時(shí)間對(duì)平均DMD均有極顯著影響(P<0.01)，且二者互作效應(yīng)極顯著(P<0.01)。由圖5可以看出，在48 h內(nèi)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，DMD隨之增加，且試驗(yàn)組均不同程度高于對(duì)照組，至48 h時(shí)，試驗(yàn)組DMD與對(duì)照組相似。試驗(yàn)組平均GP高出對(duì)照組5.69 mL(P<0.01)，處理和發(fā)酵時(shí)間對(duì)平均GP均有極顯著影響(P<0.01)，且二者互作效應(yīng)極顯著(P<0.01)。由圖5可以看出，在48 h內(nèi)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，GP隨之增加，且試驗(yàn)組均不同程度高于對(duì)照組。

表6 4種單酶體外消化對(duì)GP和DMD的影響

圖3 不同配比外源復(fù)合非淀粉多糖酶對(duì)GP的影響

試驗(yàn)組平均NH3-N濃度高出對(duì)照組2.57 mg/dL(P<0.01)，處理和發(fā)酵時(shí)間對(duì)平均NH3-N濃度有極顯著影響(P<0.01)，且二者互作效應(yīng)極顯著(P<0.01)。由圖5可以看出，0～8 h，試驗(yàn)組NH3-N濃度不同程度高于對(duì)照組，12～24 h，試驗(yàn)組NH3-N濃度與對(duì)照組相似。試驗(yàn)組平均MCP濃度較對(duì)照組低2.16 mg/dL(P>0.05)，處理對(duì)平均MCP濃度有顯著影響的趨勢(shì)(0.05

圖4 不同配比外源復(fù)合非淀粉多糖酶對(duì)DMD的影響

表7 外源復(fù)合非淀粉多糖酶酶譜篩選結(jié)果

試驗(yàn)組平均TVFA濃度比對(duì)照組高2.44 mmol/L(P<0.05)，處理對(duì)平均TVFA濃度無(wú)顯著影響(P>0.05)，但發(fā)酵時(shí)間對(duì)平均TVFA濃度有極顯著影響(P<0.01)，且二者互作效應(yīng)極顯著(P<0.01)。由圖5可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，TVFA濃度整體呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，在0～8 h，試驗(yàn)組的TVFA濃度高于對(duì)照組，在12～24 h，試驗(yàn)組的TVFA濃度低于對(duì)照組。試驗(yàn)組平均乙酸濃度與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)，處理對(duì)平均乙酸濃度無(wú)顯著影響(P>0.05)，發(fā)酵時(shí)間對(duì)平均乙酸濃度有極顯著影響(P<0.01)，二者互作效應(yīng)不顯著(P>0.05)。由圖5可以看出，對(duì)照組與試驗(yàn)組的乙酸濃度變化趨勢(shì)一致。試驗(yàn)組平均丙酸與丁酸濃度極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，處理和發(fā)酵時(shí)間對(duì)平均丙酸與丁酸濃度均有極顯著影響(P<0.01)，且二者互作效應(yīng)極顯著(P<0.01)。由圖5可以看出，在0～8 h，試驗(yàn)組的丙酸和丁酸濃度高于對(duì)照組；在12～48 h，試驗(yàn)組的丙酸和丁酸濃度低于對(duì)照組。試驗(yàn)組平均A/P極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，處理和發(fā)酵時(shí)間對(duì)平均A/P均有極顯著影響(P<0.01)，且二者互作效應(yīng)極顯著(P<0.01)。由圖5可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組與試驗(yàn)組A/P變化趨勢(shì)不一致，在2～4 h，各試驗(yàn)組的A/P低于對(duì)照組，在6～48 h，對(duì)照組與試驗(yàn)組A/P趨于相等。

表8 外源復(fù)合非淀粉多糖酶對(duì)瘤胃體外發(fā)酵特性(平均值)的影響

續(xù)表8項(xiàng)目Items對(duì)照組 Control group試驗(yàn)組 Test groupSEMP值 P-value處理 Treatment發(fā)酵時(shí)間 Fermentation time互作效應(yīng)Interaction effect丁酸 Butyric acid/(mmol/L)5.50B6.41A0.122<0.001<0.001<0.001乙丙比 A/P2.84A2.48B 0.024<0.001<0.001<0.001總揮發(fā)性脂肪酸 TVFA/(mmol/L)53.3955.831.1190.134<0.0010.001

圖5 外源復(fù)合非淀粉多糖酶對(duì)瘤胃體外發(fā)酵特性的影響

3 討 論

3.1 單酶添加量對(duì)瘤胃體外發(fā)酵GP和DMD的影響

同一種試驗(yàn)動(dòng)物，所用酶制劑的添加量不同產(chǎn)生的效果也不同[9-10]。對(duì)于酶制劑添加量的高低，并沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)衡量。因?yàn)槊傅奶砑恿啃枰C合酶的活性、底物和環(huán)境等來(lái)確定。而酶的活性受多種因素的影響，如酶的來(lái)源、濃度、作用的底物及溫度、pH等。Sakita等[9]的研究從里氏木霉中提取纖維分解酶，設(shè)置了5個(gè)劑量(0、5、50、500和5 000 μL)，探究其對(duì)不同底物的影響，結(jié)果表明，高劑量組的DMD、中性洗滌纖維降解率(DNFD)顯著高于其他組。Abid等[11]利用瘤胃中的長(zhǎng)柄木霉產(chǎn)生的纖維分解酶在體外降解橄欖葉，設(shè)置了0、1、2和4 μL/g(干物質(zhì)基礎(chǔ))4個(gè)添加量，結(jié)果表明中添加量的纖維分解酶可增加GP、DMD、MCP濃度，而高添加量的纖維分解酶對(duì)GP、DMD無(wú)顯著影響，且導(dǎo)致MCP濃度降低。在本研究中，針對(duì)特定底物，對(duì)選用的4種酶均設(shè)置了7個(gè)添加量，結(jié)果顯示，各酶處理的GP和DMD均隨添加量的增加而升高，當(dāng)超出一定水平時(shí)，則表現(xiàn)出不增加或呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，說(shuō)明隨酶添加量的增加加速了底物反應(yīng)，在達(dá)到一定值后，GP和DMD受底物限制，趨于平緩。在實(shí)際應(yīng)用中，酶添加量并非越高越好，前人研究顯示酶添加過(guò)量會(huì)降低營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率[12]。Arif等[13]研究表明，酶添加過(guò)量時(shí)，底物被酶解效果下降，這與Parwiyanti等[14]的研究結(jié)果一致。因此，本試驗(yàn)以GP和DMD為指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，當(dāng)纖維素酶為750 U/g、木聚糖酶為125 U/g、葡聚糖酶為750 U/g、甘露聚糖酶為125 U/g(均為干物質(zhì)基礎(chǔ))時(shí)，各酶分別發(fā)揮出最佳水平。通過(guò)與底物的反應(yīng)選出各酶的最適添加量，為下一步進(jìn)行4種酶的復(fù)合配比奠定基礎(chǔ)。

3.2 不同復(fù)合酶酶譜對(duì)瘤胃體外發(fā)酵GP和DMD的影響

由于飼糧中底物成分復(fù)雜，運(yùn)用單酶進(jìn)行復(fù)合配比后產(chǎn)生協(xié)同作用，效果通常要優(yōu)于單一酶制劑[15]。在使用復(fù)合酶制劑時(shí)應(yīng)把握好各單酶間的相互作用，發(fā)掘不同單酶之間的協(xié)同作用，同時(shí)降低拮抗作用。有研究表明，復(fù)合酶的不同添加量對(duì)GP、DMD及瘤胃發(fā)酵參數(shù)等的影響不一致[16]。Malathi等[5]的研究表明，對(duì)于不同的底物，不同的復(fù)合酶所產(chǎn)生的效果不一致。酶具有專一性，要根據(jù)底物的不同來(lái)調(diào)節(jié)酶的添加量，使其發(fā)揮出更好的效果。張順?lè)业萚17]探究了不同外源酶組合對(duì)2種不同來(lái)源棕櫚粕的體外降解特性的影響，結(jié)果表明，不同外源酶組合極顯著地影響了棕櫚粕的體外干物質(zhì)消化率、粗蛋白質(zhì)消化率和能量消化率。劉匯濤等[18]的研究表明，在飼糧中添加不同配比及添加量的復(fù)合酶制劑對(duì)飼糧的改善效果不一致，其中添加890 mg/kg復(fù)合酶制劑Ⅰ時(shí)，育成期水貂生長(zhǎng)性能、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率和氮代謝均明顯提高，并由此推測(cè)，造成該結(jié)果的原因可能為不同配比的復(fù)合酶制劑對(duì)內(nèi)源酶的影響不同。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，4種酶的配比為纖維素酶∶木聚糖酶∶β-葡聚糖酶∶甘露聚糖酶=1 000∶250∶500∶50(U/g，干物質(zhì)基礎(chǔ))時(shí)，效果最佳。上述研究結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果都表明，不同添加量和種類的外源酶，其適宜配比為提升飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收作用的關(guān)鍵[19]，將外源酶配比使用時(shí)互補(bǔ)作用更明顯，其對(duì)飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率的提升效果也更明顯。

3.3 外源復(fù)合非淀粉多糖酶對(duì)瘤胃體外發(fā)酵特性的影響

3.3.1 外源復(fù)合非淀粉多糖酶對(duì)瘤胃體外發(fā)酵GP和DMD的影響

GP為第一指標(biāo)，因?yàn)楫a(chǎn)氣率與底物降解率成正比，是評(píng)估底物降解的簡(jiǎn)單篩選工具[6]，是衡量瘤胃中可發(fā)酵物質(zhì)的含量、微生物活性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)之一[6,20]。GP越高，飼糧的發(fā)酵強(qiáng)度越大[21]。DMD主要用于評(píng)價(jià)飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，DMD越高，說(shuō)明飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用更充分[22]。

有研究表明，在飼料中添加外源纖維酶，其發(fā)酵過(guò)程有利于GP的提高[23]。此外，Colombatto等[24]和Wang等[25]報(bào)道，在飼糧中添加外源纖維酶有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)釋放，促進(jìn)瘤胃發(fā)酵，提高底物的降解率，后經(jīng)瘤胃微生物作用產(chǎn)生能量和VFA以供動(dòng)物吸收利用，從而提高DMD。本試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)組的GP高于對(duì)照組，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，各組產(chǎn)氣速率均減緩，但試驗(yàn)組發(fā)酵后期GP在數(shù)值上仍高于對(duì)照組。體外培養(yǎng)48 h后，試驗(yàn)組的平均DMD極顯著高于對(duì)照組。這可能是因?yàn)樘砑油庠磸?fù)合非淀粉多糖酶使細(xì)胞壁破解，部分難消化利用的纖維類物質(zhì)被降解為利于消化吸收的單糖、寡糖等小分子物質(zhì)，從而提高飼料的利用率，與王紅梅[26]的研究結(jié)果相似。

3.3.2 外源復(fù)合非淀粉多糖酶對(duì)瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)的影響

瘤胃pH是反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵最直觀的反映和基本指標(biāo)，其正常范圍為5.4～7.5[27]。本研究中各組發(fā)酵液pH為6.25～6.40，均在正常范圍，且試驗(yàn)組與對(duì)照組間無(wú)顯著差異，說(shuō)明添加外源復(fù)合非淀粉多糖酶對(duì)體外瘤胃內(nèi)環(huán)境未造成不良影響。

反芻動(dòng)物瘤胃中NH3-N是瘤胃微生物降解飼料中蛋白質(zhì)、氨基酸等含氮成分產(chǎn)生的，是合成MCP的重要原料，也是反映反芻動(dòng)物氮代謝的主要指標(biāo)，綜合反映了瘤胃內(nèi)氮代謝的過(guò)程[28]。Murphy等[28]的研究表明，瘤胃中NH3-N濃度正常范圍是6.3～27.5 mg/dL，過(guò)高或過(guò)低都對(duì)動(dòng)物機(jī)體不利，過(guò)高說(shuō)明氮產(chǎn)生量大于利用量，易造成氨中毒，過(guò)低說(shuō)明MCP的合成率降低即微生物活性降低[29-30]。在本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組和對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)的NH3-N濃度均在正常范圍內(nèi)，說(shuō)明添加外源復(fù)合非淀粉多糖酶不會(huì)影響瘤胃氮利用率。但8 h前試驗(yàn)組NH3-N濃度均大于對(duì)照組，可能是因?yàn)樘砑油庠磸?fù)合非淀粉多糖酶后加速了瘤胃中降解蛋白質(zhì)的菌群的增殖，增強(qiáng)了固定分子氮的能力；還可能是因?yàn)樵谀M瘤胃體外發(fā)酵過(guò)程中沒有瘤胃壁對(duì)NH3-N的吸收環(huán)節(jié)，導(dǎo)致其在培養(yǎng)管中累積[31]。因此，在8 h前試驗(yàn)組NH3-N濃度比對(duì)照組高。總體上看，NH3-N濃度的升高表明對(duì)底物利用率提高。

瘤胃微生物可將碳水化合物降解為VFA、二氧化碳(CO2)和甲烷(CH4)等，大部分VFA則通過(guò)瘤胃壁擴(kuò)散進(jìn)入血液，為動(dòng)物機(jī)體提供60%～80%的能量，也是其能量和碳的主要來(lái)源[32]。其中，碳原子含量不同，吸收速度也不同，吸收速度為丁酸>丙酸>乙酸[33]。有研究表明，A/P>3時(shí)為乙酸發(fā)酵，反之，則為丙酸發(fā)酵。本試驗(yàn)中，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中試驗(yàn)組丙酸、丁酸濃度均高于對(duì)照組，且在4 h前，試驗(yàn)組丙酸、丁酸濃度遠(yuǎn)超出對(duì)照組，A/P則低于對(duì)照組，而后，對(duì)照組與試驗(yàn)組趨于一致。Wang等[34]和國(guó)春艷[31]的研究表明，添加外源纖維素酶后，試驗(yàn)組丙酸濃度增加，瘤胃發(fā)酵類型轉(zhuǎn)變?yōu)楸岚l(fā)酵。而本試驗(yàn)中，在體外培養(yǎng)前對(duì)底物進(jìn)行了24 h預(yù)處理，使得外源復(fù)合非淀粉多糖酶能夠直接作用于底物，釋放還原糖，增加微生物對(duì)底物的附著能力，從而說(shuō)明添加外源復(fù)合非淀粉多糖酶增加了瘤胃內(nèi)碳水化合物的降解利用，能夠在前期提高培養(yǎng)液中的丙酸和丁酸濃度，改變發(fā)酵類型，但作用時(shí)間不長(zhǎng)，其原因可能是預(yù)處理加速了外源復(fù)合非淀粉多糖酶破解植物細(xì)胞壁，促進(jìn)了降解產(chǎn)物寡糖的發(fā)酵，加快了飼料的利用，這與Malathi等[5]的研究結(jié)果相似。

MCP作為反芻動(dòng)物最主要的氮源供應(yīng)者，能為動(dòng)物機(jī)體提供所需要蛋白質(zhì)的40%～90%[35]。瘤胃液中MCP的合成需要提供一定的能量、氮源及其他營(yíng)養(yǎng)成分。本試驗(yàn)中，在12和24 h時(shí)，試驗(yàn)組MCP濃度低于對(duì)照組，其他時(shí)間2組差異不顯著。12和24 h時(shí)，試驗(yàn)組丙酸和丁酸濃度也遠(yuǎn)低于對(duì)照組，但NH3-N濃度無(wú)顯著差異，推斷這由于能量和氮利用率之間的不同步造成的。Elghandour等[23]研究外源纖維復(fù)合酶處理4種不同纖維飼料時(shí)發(fā)現(xiàn)，各組除了MCP濃度下降外，GP、DMD、VFA濃度均增加。這與本試驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步說(shuō)明了添加外源復(fù)合非淀粉多糖酶促進(jìn)了飼糧的發(fā)酵。

4 結(jié) 論

① 綜合試驗(yàn)結(jié)果，在本試驗(yàn)所用飼糧和體外條件下，外源復(fù)合非淀粉多糖酶最適添加量及配比為纖維素酶∶木聚糖酶∶β-葡聚糖酶∶甘露聚糖酶=1 000∶250∶500∶50(U/g，干物質(zhì)基礎(chǔ))。

② 添加適宜配比的外源非淀粉多糖酶可以提高瘤胃體外DMD和GP，改善瘤胃發(fā)酵功能。