葉酸-磁雙靶向多功能納米分子探針用于視網膜母細胞瘤體外多模態(tài)成像的研究

李 醒，鄭文笛，鄒宏密，武明星

0引言

視網膜母細胞瘤[1-2](retinoblastoma，RB)是嬰幼兒常見的眼內惡性腫瘤，其中多數患者(85%)來自于低收入和中等收入國家。在這些地區(qū)，患者最常見的臨床表現包括白瞳癥、斜視和眼球突出，發(fā)現時已有近半數患者有眼外腫瘤，甚至發(fā)生遠處轉移[3]，發(fā)展到晚期患者不得不面臨眼球摘除的風險，這為患者及其家庭的心理健康和生活質量帶來了嚴重負擔[4-5]。因此，早期診斷和治療是控制RB的關鍵。分子影像技術的發(fā)展為早期診斷RB提供了新的方向，為了更好地滿足醫(yī)學多樣化和個性化需求，靶向多模態(tài)顯像的分子探針成為了研究熱點[6-7]。

以Fe3O4為核心的超順磁性氧化鐵納米粒子(SPION)，能夠在外加磁場下向靶組織聚集[8]，結合配體修飾型主動靶向探針，有望進一步提升探針的靶向性能[9]。研究發(fā)現，SPION能夠吸收近紅外光進行光成像，并且能夠作為磁共振成像(MRI)的陰性對比劑使用[10-11]。將SPION與液態(tài)氟碳(perfluorohexane，PFH)共同組裝成相變型納米分子探針，在激光作用下會發(fā)生液氣相變，從而增強超聲顯像[12]。葉酸是一種水溶性維生素，將其修飾納米粒上，可以和RB細胞上的受體通過受體-配體介導作用特異性結合。阿霉素[13](adriamycin，ADM)作為廣譜化療藥物，通過藥物遞送系統，在光觸發(fā)下治療眼內疾病很有潛力。本研究擬制備一種新型的、高靶向性的納米級多模態(tài)造影劑，以葉酸(folic acid，FA)、Fe3O4為雙重靶向，載PFH、ADM的相變型多功能脂質體納米粒(FA-PFH-Fe3O4@ADM)，研究其靶向視網膜母細胞瘤Y79細胞及體外超聲/光聲/MRI三模態(tài)成像能力，通過分子影像技術，為早期、高效、精準診斷RB提供新的思路。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1主要材料二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC，瑞禧生物、LP-R4-057)，葉酸修飾磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000-FA，瑞禧生物、R-0043)，膽固醇(瑞禧生物、117298)，全氟己烷(PFH，STREM、09-6072)，葉酸(Sigma、R010338)，鹽酸阿霉素(ADM，阿拉丁、D107159)，超順磁性氧化鐵(SPION，瑞禧生物、R-C1002)，三氯甲烷(上海生化)，DAPI染色液(碧云天、AR1176)，CCK-8試劑盒(同仁化學、CK04)，人視網膜母細胞瘤細胞(Y79，上海斯信生物科技有限公司)，RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco、C11875500BT)。

1.1.2主要儀器旋轉蒸發(fā)儀(亞榮)，超聲波聲振儀(Sonics)，低溫離心機(Eppendorf)，馬爾文粒徑分析儀(Malvern)，紫外分光光度計(島津UV2600)，電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES)(Agilent 720ES)；紅外成像儀(Fotric 226)，808nm激光儀(FC808-2W-MM，西安中川光電科技有限公司)，振動樣品磁強計(VSM)(LakeShore 7404型)，多功能酶標儀(BioTek)，Vevo Laser光聲成像系統(Visual Sonics)，磁共振成像系統(SIEMENS)，激光共聚焦顯微鏡(Andor2000)。

1.2方法

1.2.1FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒的制備納米粒采用雙乳化法制備，按照5∶2∶2比例稱取DPPC、DSPE-PEG2000-FA、膽固醇共5mg，溶于6mL三氯甲烷中。旋轉蒸發(fā)2h，得到白色薄膜，使用2mL PBS充分水化脂膜備用。稱取ADM 1mg于100μL PBS中溶解，加入200μL SPION，100μL PFH，冰浴下進行第1次超聲乳化(功率：35%；時間：1min，5s，5s)，再加入水化液進行第2次超聲乳化(功率：40%；時間：3min，5s，5s)。低溫離心3次(8000r/min，5min)，即可得到FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒乳液。制備過程中，使用DSPE-PEG2000替代DSPE-PEG2000-FA即可得到PFH-Fe3O4@ADM納米粒，不加入SPION即可得到FA-PFH@ADM納米粒。

1.2.2FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒的基本特征檢測觀察納米粒乳液的性狀，稀釋后分別于光鏡、透射電鏡下觀察納米粒的形態(tài)，使用馬爾文粒徑分析儀分析其粒徑、電位分布情況。分別使用紫外分光光度計及ICP-OES檢測納米粒，根據以下公式：包封率(%)=[(m加入試劑-m上清液中試劑)/m加入試劑] ×100%；載藥量(%)=[(m加入試劑-m上清液中試劑)/m納米粒] ×100%，計算納米粒中ADM及Fe的包封率和載藥量。VSM檢測納米粒的磁性能，并給納米粒施加磁場，觀察其順磁性能。

1.2.3細胞培養(yǎng)及細胞毒性檢測使用含20%胎牛血清、1%青/鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基，在5%CO2，37℃的恒溫孵箱中培養(yǎng)Y79細胞。傳代4次后，取對數生長期細胞接種于96孔板(1×104細胞/孔)，加入不同濃度的FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒共同孵育24h。離心除去培養(yǎng)基，每孔加入10% CCK-8試劑100μL，繼續(xù)孵育1h，用酶標儀檢測各孔在450nm處的吸光度，各組細胞存活率根據以下公式計算：細胞存活率(%)=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.2.4FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒的光熱效應及光致相變能力檢測將納米粒分為PBS組、FA-PFH@ADM組、不同濃度(0.156、0.313、0.625、1.25mg/mL)FA-PFH-Fe3O4@ADM組，置于96孔板中，使用808nm激光(2W/cm2)輻照5min，并記錄其升溫情況。取0.625mg/mL的納米粒于96孔板中，使用不同功率(1.0、1.5、2.0、2.5W/cm2)808nm激光輻照5min，并記錄其升溫情況。在升溫過程中，使用光學顯微鏡觀察納米粒微氣泡產生情況，探索納米粒發(fā)生相變條件。

1.2.5FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒體外靶向性取對數生長期的Y79細胞接種于6孔板，分為對照組、非靶向組、單葉酸靶組、單磁靶組、葉酸-磁雙靶組。對照組不加入納米粒，非靶向組及單磁靶組加入PFH-Fe3O4@ADM納米粒(0.625mg/mL)，單葉酸靶組及葉酸-磁雙靶組加入FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒(0.625mg/mL)，并于單磁靶組和葉酸-磁雙靶組的孔板側放約4T磁鐵1枚，靠近磁鐵側的細胞視為磁靶區(qū)域內的細胞。細胞與納米粒共同孵育1h，離心除去未吞噬的納米粒，使用4%多聚甲醛固定細胞，DAPI染色液染色細胞核，通過激光共聚焦顯微鏡觀察各組細胞吞噬情況，并進行流式細胞學檢測進行定量分析。

1.2.6FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒體外超聲/光聲/MRI三模態(tài)成像將1.25mg/mL FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒置于4%的凝膠孔洞模型中，使用808nm激光儀(2W/cm2)分別作用0、1、2、3、5min，再使用光聲成像儀的B模式和造影模式分別記錄其超聲圖像并讀取相應聲強值。將FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒配制為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL五個不同濃度，取200μL于3%的凝膠孔洞模型中，于光聲成像儀上檢測各濃度的光聲圖像并讀取相應光聲信號值。將H2O和不同濃度(0.025、0.05、0.1、0.2、0.4mg/mL)FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒置于2mL圓底離心管中，使用磁共振成像系統檢測其T2像的磁共振圖像，并讀取計算相應T2信號值。

2結果

2.1FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒的基本特征FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒制備成功，呈棕紅色乳液，鏡下可見其為大小均勻、分散性好的球形結構(圖1A)，馬爾文粒徑分析儀檢測其分布為單峰，粒徑為338.6±2.20nm(圖1B)，電位為-26.6±0.62mV。紫外分光光度法檢測ADM的回歸方程為：y=0.01474x+0.04893(x表示ADM溶液濃度，y表示吸光度)，R2=0.9975(圖1C)，ADM的包封率為(41.76±4.12)%，載藥量為(6.96±0.69)%。ICP-OES檢測Fe的回歸方程為：y=17183.6480x-46.8579(x表示標準Fe溶液濃度，y表示響應強度)，R2=1.0000(圖1C)，Fe的包封率為(59.06±13.63)%，載藥量為(7.13±1.65)%。VSM檢測納米粒具有超順磁性，并觀察到納米粒能夠在磁場下定向聚集(圖1D)。

圖1 FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒的基本特征 A：納米粒乳液及光鏡和透射電鏡下觀察情況；B：納米粒粒徑分布圖；C：ADM及Fe檢測的標準曲線；D：納米粒的磁滯曲線及磁性能觀察圖。

2.2FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒的細胞毒性CCK-8實驗結果顯示，不同濃度(0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6mg/mL FA-PFH-Fe3O4@ADM)組細胞存活率分別為(1.00±0.00)%、(0.96±0.12)%、(0.94±0.06)%、(0.95±0.16)%、(0.88±0.06)%、(0.87±0.11)%，各組細胞存活率均較高，即使在高濃度下，細胞存活率也能達到85%以上，且各組細胞存活率差異無統計學意義(F=0.80，P>0.05)，證明納米粒的生物安全性良好。

2.3FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒的光熱效應及光致相變能力體外光熱實驗顯示，FA-PFH-Fe3O4@ADM納米?？梢栽?08nm激光輻照下產生光熱效應，且升溫速度和最高溫度與納米粒的濃度及激光功率呈正相關(圖2A～D)。激光輻照后，顯微鏡下觀察納米?？梢园l(fā)生液氣相變，生成微氣泡(圖2E)。

圖2 FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒的光熱效應及光致相變能力 A：不同濃度納米粒在808nm激光輻照(2W/cm2)下的升溫曲線；B：不同濃度納米粒在808nm激光輻照(2W/cm2)下的升溫圖；C：納米粒(0.625mg/mL)在不同功率808nm激光輻照下的升溫曲線；D：納米粒(0.625mg/mL)在不同功率808nm激光輻照下的升溫圖；E：相變前后納米粒光鏡下觀察結果。

2.4FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒體外靶向性激光共聚焦顯微鏡下，ADM呈紅色熒光，Y79細胞核DAPI染色呈藍色熒光。對照組和非靶向組細胞中幾乎不可見納米粒，單葉酸靶組和單磁靶組細胞中可見部分納米粒，葉酸-磁雙靶組細胞中可見大量納米粒(圖3A)。流式細胞學檢測結果顯示，非靶向組、單葉酸靶組、單磁靶組、葉酸-磁雙靶組吞噬率分別為(6.99±0.16)%、(43.36±5.91)%、(28.58±3.23)%、(86.19±0.55)%，差異有統計學意義(F=196.3，P<0.05，圖3B)，與激光共聚焦顯微鏡所示結果一致。

圖3 FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒體外靶向性 A：激光共聚焦顯微鏡觀察各組細胞吞噬納米粒情況；B：流式細胞學檢測各組細胞吞噬納米粒情況，bP<0.01 vs 非靶向組。

2.5FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒體外超聲/光聲/MRI三模態(tài)成像體外超聲成像結果顯示，FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒在808nm激光輻射后，超聲信號明顯增強，且在B模式和造影模式下，平均聲強值與激光輻照時間均呈明顯正相關(R2=0.9812、0.9426，圖4A)。體外光聲成像結果顯示，FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒有明顯的光聲成像能力，其平均光聲信號值與納米粒濃度呈明顯正相關(R2=0.9721，圖4B)。體外MRI結果顯示，隨著納米粒濃度的增加，其平均信號值逐漸降低，呈明顯負相關(R2=0.9905，圖4C)，FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒r2值為43.73mM-1S-1。

圖4 FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒體外超聲/光聲/MRI三模態(tài)成像 A：納米粒在B模式和造影模式下經808nm激光激發(fā)不同時間后體外超聲成像圖及聲強分析；B：不同濃度納米粒體外光聲成像圖及光聲信號分析；C：不同濃度納米粒體外MRI圖及信號分析。

3討論

臨床上通常使用眼底檢查、眼部B超、MRI檢查、熒光素眼底血管造影等手段確診RB，但這些檢查往往難以查明早期病變，從而延誤治療[14]。因此，目前仍然急需能夠在出現明顯可見的形態(tài)學改變之前，及早發(fā)現RB的診斷方法。近年來，分子成像技術逐漸被運用到各類惡性腫瘤的研究中[15-16]，其可視化、靶向、無創(chuàng)等優(yōu)點在RB的早期診療上很有發(fā)展前景。基于臨床上的迫切需求，本研究結合分子影像學技術構建了一種新型多功能納米分子探針FA-PFH-Fe3O4@ADM，其作為載體可以將藥物遞送至靶部位，進行無創(chuàng)、實時、精細顯像。本研究成功使用雙乳化法，以生物相容性好、易載藥、易修飾的脂質體[17]作為載體，制備了雙靶向多模態(tài)成像分子探針。

高效的靶向性是分子探針發(fā)揮效用的基礎，本研究制備的FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒平均粒徑僅338.6±2.20nm，可以穿過血管內皮細胞到達腫瘤部位，通過實體瘤的高通透性和滯留效應被動聚集于腫瘤組織，但其作用能力有限。主動靶向作用能使納米粒更高效地聚集于目標組織，其中配體-受體介導的主動靶向及磁靶向是近年研究的熱點。葉酸受體在多種惡性腫瘤高表達[18]，具有葉酸靶向功能的納米粒已成功應用于多種惡性腫瘤的診療，Wu等[19]制備的葉酸靶向納米分子探針可通過與RB細胞表面的葉酸受體結合，特異性地聚集于RB細胞周圍。但由于特異性受體具有飽和效應及腫瘤微環(huán)境的阻礙，導致配體修飾型主動靶向探針的靶向能力受到一定限制。磁靶向是一種新型主動靶向模式，Suciu等[20]發(fā)現SPION作為磁靶，在外加磁場的作用下會聚集在作用部位，并且具有穩(wěn)定、高效、低毒的特點?；谝陨涎芯?，結合本課題組前期對葉酸-磁雙靶向納米粒的探索[21]，本研究將配體-受體介導的分子靶向的特異性與磁靶向的高效性相結合，構建了雙靶向分子探針。尋靶實驗驗證了FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒的雙重靶向性能，葉酸-磁雙靶組視網膜母細胞瘤Y79細胞吞噬納米粒的數量約為單葉酸靶組和單磁靶組的2～3倍，實現了探針在Y79細胞內的高效聚集。

目前，分子成像技術包括超聲、電子計算機斷層掃描(CT)、熒光、MRI、單光子發(fā)射計算機斷層掃描儀/正電子發(fā)射計算機斷層掃描(SPECT/PET)等，單一成像技術難以滿足臨床多樣化的需求，集其中多種成像優(yōu)勢于一體的多模態(tài)造影劑是研究的熱點。Xiao等[22]制備的以PFH為內核的相變型納米超聲分子，能夠通過近紅外激光的激發(fā)，發(fā)生光致相變，將PFH由液態(tài)轉變成氣態(tài)，即液氣相變，從而增強超聲顯影，實現了腫瘤的早期診斷。光聲成像是一種新型的成像方式，通過物質吸收光產生超聲信號，具有高對比度和分辨率。MRI是臨床常用的RB診斷方式，SPION作為美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)認證用于腫瘤的磁共振顯像劑，可以準確提供腫瘤及其周邊組織信息。Sivakumar等[23]設計的靶向納米復合材料中，SPION既可以通過吸收近紅外光進行光聲成像，也可以通過對T2像的負性增強來進行磁共振成像。結合以上研究，本研究制備的FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒在體外通過激光激發(fā)可增強超聲/光聲成像，且以SPION作為T2對比劑增強了磁共振成像，實現了實時全面精準的成像。

此外，Dolatkhah等[24]制備了GO-SPION-MTX納米復合材料，其中SPION在近紅外光的作用下具有光熱轉換能力，可以對乳腺癌進行光熱治療。本研究探究了在808nm激光作用下FA-PFH-Fe3O4@ADM的光熱性能，證明納米粒有進行光熱治療的潛力。與此同時，隨著納米粒溫度升高，PFH發(fā)生液氣相變，有利于化療藥物的釋放。由此可見，FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒具有激光作用下治療RB的潛力，但其治療效果和作用機制還有待進一步研究。

綜上所述，本研究成功制備了葉酸靶向聯合磁靶向、包裹ADM的相變型納米粒(FA-PFH-Fe3O4@ADM)，在優(yōu)化的葉酸-磁雙靶作用下，納米粒在視網膜母細胞瘤Y79細胞內大量聚集，并進行了體外超聲/光聲/MRI三模態(tài)顯像，實現了體外精準靶向及顯像，為RB的早期診斷帶來了新的希望。與此同時，FA-PFH-Fe3O4@ADM納米粒具有光熱效應并能在激光下發(fā)生光致相變，為進一步的光熱聯合化療奠定了基礎。