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      水蛭提取液通過VEGF/PI3K/AKT通路抑制WERI-RB-1細(xì)胞表達(dá)VEGF

      2022-12-09 08:35:18李園媛鄭燕林李建超惠延年馬士航馬宏杰
      國際眼科雜志 2022年12期
      關(guān)鍵詞:水蛭提取液抑制率

      李園媛,鄭燕林,李建超,惠延年,馬士航,黃 慧,王 芳,馬宏杰

      0引言

      視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma,RB)是3歲以下嬰幼兒最常見的眼內(nèi)惡性腫瘤,也可見于年長的兒童甚至成年人[1-3]。腫瘤早期局限于眼球內(nèi),隨病程進(jìn)展可發(fā)生眼外轉(zhuǎn)移甚至致命[4]。近30a來,RB的治療取得明顯進(jìn)展,靜脈化學(xué)藥物療法、眼動脈超選介入化療等可以保留患眼,但存在明顯的副作用[5]。尋求更有效、安全的藥物或生物療法是必要的。

      RB細(xì)胞可分泌多種生長因子,如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。研究發(fā)現(xiàn),VEGF蛋白在RB細(xì)胞中呈高表達(dá)[6],VEGF是RB研究中最徹底和廣泛被探索的促血管生成因子,在調(diào)節(jié)腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移中起重要作用[7-10]。另有研究發(fā)現(xiàn),磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶(PI3K/AKT)信號通路調(diào)控與增殖、轉(zhuǎn)化、存活、遷移、血管生成相關(guān)的多種因子,包括基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、缺氧誘導(dǎo)因子-1a(HIF-1a)[11-13]。有報道稱,PI3K信號通路可被包括VEGF在內(nèi)的多種生長因子激活[14-15]。PI3K/AKT信號通路激活后,下游靶基因HIF-1a被激活,調(diào)節(jié)刺激血管生成基因的轉(zhuǎn)錄,如VEGF和MMP-9[16-19]。HIF-1a、MMP-9在腫瘤細(xì)胞侵襲中具有特殊作用,二者可通過多種信號作用方式相互調(diào)節(jié)[20-21]。機(jī)體缺氧時,組織缺氧釋放大量的MMP-9,從而促使MMP-9信號通路相關(guān)因子的表達(dá)增加,即HIF-1a上調(diào)MMP-9的表達(dá)。阻斷HIF-1a/MMP-9信號通路可促進(jìn)腫瘤無功能血管的發(fā)生,這些無功能血管不能有效輸送腫瘤生長所需的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì),達(dá)到延緩和抑制腫瘤生長的目的[22-25]。因此,VEGF/PI3K/AKT、HIF/MMP-9等信號通路為靶點的研究可作為抑制RB的重點。然而,目前關(guān)于VEGF/PI3K/AKT、HIF/MMP-9信號通路在RB中的研究較少,其作用仍需進(jìn)一步探索。前期研究發(fā)現(xiàn),水蛭提取物具有抑制成纖維細(xì)胞增生的作用[26],水蛭提取液可有效抑制人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞WERI-Rb-1細(xì)胞系增殖和侵襲,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[27]。因此,本研究通過VEGF/PI3K/AKT通路及相關(guān)因子,豐富和完善水蛭提取液對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲作用的影響,為其潛在的治療作用提供理論基礎(chǔ)。

      1材料和方法

      1.1材料WERI-RB-1細(xì)胞(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院,No.3131C0001001200012)。水蛭干粉(蘭州安泰堂中藥飲片公司;生產(chǎn)批號:14082702;GMP證書號:甘J0071;水蛭提取液提取方法及濃度選擇參考文獻(xiàn)[26]);Human VEGF Elisa試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司);總RNA抽提試劑TRIZOL、PrimeScript RT reagent Kit、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ Kit、HIF-1a、MMP-9鼠單克隆抗體(美國Santa公司); 預(yù)染蛋白Marker(美國NEB公司);ECL發(fā)光試劑盒(美國Thermo公司);PVDF膜(美國Hybond公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒(南京凱基生物公司)。RT-PCR儀(美國Thermo Fisher公司);垂直電泳槽、DYY-6C電泳儀、Image Lab凝膠分析系統(tǒng)(美國Bio-rad 公司)。

      1.2方法

      1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)WERI-RB-1細(xì)胞從液氮容器中快速取出,提前備好約50℃無菌水,迅速解凍,2500g 20℃離心10min,丟棄上清液,加入2mL完全培養(yǎng)基RPMI-1640重懸細(xì)胞,以適當(dāng)密度接種到6孔板中,然后在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基每隔1天更換1次。待培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)胞生長至70%~80%時以1∶2比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

      1.2.2實驗分組及藥物干預(yù)取對數(shù)生長期的WERI-RB-1細(xì)胞,以5×105cells/mL接種于6孔板中,每孔加入800μL細(xì)胞懸液,細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后分3組,對照組加完全培養(yǎng)基,0.04U/mL水蛭提取液組、0.08U/mL水蛭提取液組分別加入含0.04、0.08U/mL的含藥培養(yǎng)基,置培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。

      1.2.3ELISA檢測VEGF表達(dá)水平將試劑盒和樣品(各組細(xì)胞培養(yǎng)基上清液)平衡至室溫,樣品分別用標(biāo)本稀釋液稀釋(1∶100),混合均勻后各取100μL加入到96板孔。設(shè)陰陽性對照各一孔組,同時設(shè)加入100μL標(biāo)準(zhǔn)通用稀釋液作為空白對照孔,每組設(shè)6孔。37℃孵育60min。吸取孔內(nèi)液體,用洗滌液連續(xù)洗滌3次,每次停留30s后吸取孔內(nèi)液體,并在吸水紙上拍干,空白孔加生物素化抗體稀釋液,其余孔加生物素化抗體工作液(每孔100μL),37℃孵育60min。用洗滌液連續(xù)洗滌3次,吸水紙上拍干。空白孔加酶結(jié)合物稀釋液,其余孔加酶結(jié)合物工作液(每孔100μL),37℃孵育30min。每孔加入顯色底物(TMB)100μL,37℃避光孵育15min。每孔加入終止液100μL,混勻后即刻測量450nm處OD值。

      1.2.4RT-PCR檢測HIF-1a和MMP-9mRNA相對表達(dá)水平收集各組細(xì)胞,分別加入1mL TRIZOL,充分勻漿、萃取RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。RT-PCR法檢測HIF-1a和MMP-9 mRNA表達(dá)情況,配制20μL PCR 反應(yīng)體系,反應(yīng)條件: 95℃ 10min,95℃ 15s,58℃ 50s,58℃ 50s,45個循環(huán),β-Actin 為內(nèi)參基因,使用Thermo Scientific PikoReal軟件(Thermo公司)分析各檢測樣本的CT值,并通過2-△△CT法計算目的基因相對表達(dá)水平。所有樣本重復(fù)檢測3次,取平均值。引物序列見表1。

      1.2.5WesternBlot檢測HIF-1a、MMP-9、PI3K、p-AKT蛋白相對表達(dá)水平收集各組細(xì)胞,裂解提取蛋白,BCA 法進(jìn)行蛋白定量,35μg樣本蛋白混合等體積上樣,電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜,封閉液封閉,室溫孵育2h,加入PI3K(1∶800)、p-AKT(1∶500)、HIF-1a(1∶500)、MMP-9(1∶800)一抗,4℃過夜,TBST洗膜3次,每次10min,加入二抗(1∶10000),室溫孵育45min,顯色,并采用LabWorks軟件分析蛋白條帶灰度值,以目的條帶與內(nèi)參條帶β-Actin比值表示目的蛋白的表達(dá)水平,計算p-AKT、PI3K、HIF-1a及MMP-9蛋白相對表達(dá)量。

      2結(jié)果

      2.1水蛭提取液對WERI-RB-1細(xì)胞表達(dá)VEGF的影響ELISA檢測結(jié)果顯示,對照組、0.04U/mL水蛭提取液組、0.08U/mL水蛭提取液組細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中VEGF表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=93.4,P<0.05),且水蛭提取液組均低于對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖1。0.04、0.08U/mL水蛭提取液對VEGF表達(dá)的抑制率分別為32.43%、38.92%。

      圖1 ELISA檢測VEGF蛋白的表達(dá) aP<0.05,bP<0.01 vs 對照組。

      2.2水蛭提取液對WERI-RB-1細(xì)胞表達(dá)HIF-1a和MMP-9mRNA的影響RT-PCR檢測結(jié)果顯示,對照組、0.04U/mL水蛭提取液組、0.08U/mL水蛭提取液組細(xì)胞HIF-1a和MMP-9 mRNA的相對表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=36.7、74.5,均P<0.05),且水蛭提取液組均低于對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖2。0.04、0.08U/mL水蛭提取液對HIF-1a mRNA表達(dá)的抑制率分別為27.64%和24.75%,對MMP-9 mRNA表達(dá)的抑制率分別為43.97%和51.48%。

      圖2 RT-PCR檢測HIF-1a和MMP-9 mRNA的表達(dá) A:HIF-1a;B:MMP-9。aP<0.05,bP<0.01 vs 對照組。

      2.3水蛭提取液對WERI-RB-1細(xì)胞表達(dá)PI3K和p-AKT蛋白的影響Western Blot檢測結(jié)果顯示,對照組、0.04U/mL水蛭提取液組、0.08U/mL水蛭提取液組細(xì)胞PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義((F=51.8、70.4,均P<0.05),且水蛭提取液組均低于對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖3。0.04、0.08U/mL水蛭提取液對PI3K蛋白表達(dá)的抑制率分別為33.27%、29.83%,對p-AKT蛋白表達(dá)的抑制率分別為52.07%、30.21%。

      圖3 Western Blot檢測PI3K和p-AKT蛋白相對表達(dá)水平 A:Western Blot檢測結(jié)果;B:PI3K蛋白相對表達(dá)水平;C:p-AKT蛋白相對表達(dá)水平。aP<0.05,bP<0.01 vs 對照組。

      2.4水蛭提取液對WERI-RB-1細(xì)胞表達(dá)HIF-1a和MMP-9蛋白的影響Western Blot檢測結(jié)果顯示,對照組、0.04U/mL水蛭提取液組、0.08U/mL水蛭提取液組細(xì)胞HIF-1a、MMP-9蛋白表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=66.2、80.9,均P<0.05),且水蛭提取液組均低于對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖4。0.04、0.08U/mL水蛭提取液對MMP-9蛋白表達(dá)的抑制率分別為39.49%、47.23%,對HIF-1a蛋白表達(dá)的抑制率分別為55.81%、43.85%。

      圖4 Western Blot檢測MMP-9和HIF-1a蛋白相對表達(dá)水平 A:Western Blot檢測結(jié)果;B:MMP-9蛋白相對表達(dá)水平;C:HIF-1a蛋白相對表達(dá)水平。aP<0.05,bP<0.01 vs 對照組。

      3討論

      本研究首先觀察水蛭提取液處理WERI-RB-1細(xì)胞后VEGF的表達(dá)情況,通過ELISA分析發(fā)現(xiàn),0.04、0.08U/mL水蛭提取液處理WERI-RB-1細(xì)胞48h后,VEGF表達(dá)被抑制,0.04、0.08U/mL水蛭提取液對VEGF表達(dá)的抑制率分別為32.43%、38.92%,呈現(xiàn)劑量依賴趨勢。李先建等[28]關(guān)于水蛭素對肝癌細(xì)胞HepG2的抑制作用及其分子機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn),水蛭素能抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲,其機(jī)制可能是通過下調(diào)VEGF表達(dá)。諸佳瑜[29]研究水蛭含藥血漿、血清對人胰腺癌PANC-1細(xì)胞的影響,結(jié)果表明水蛭含藥血漿、血清對人胰腺癌PANC-1細(xì)胞具有抑制增殖、遷移及抑制VEGF表達(dá)的作用。上述研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致。本研究采用RT-PCR法檢測經(jīng)0.04、0.08U/mL水蛭提取液處理的WERI-RB-1細(xì)胞中MMP-9和HIF-1a mRNA相對表達(dá)水平,采用Western Blot法檢測細(xì)胞中MMP-9和HIF-1a蛋白及PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白PI3K和p-AKT蛋白的相對表達(dá)水平。結(jié)果顯示,與對照組比較,水蛭提取液干預(yù)下細(xì)胞HIF-1α和MMP-9 mRNA相對表達(dá)水平下降,HIF-1a、MMP-9、PI3K和p-AKT蛋白相對表達(dá)水平均降低。張景容等[30]研究水蛭素對特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化病的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)水蛭素能降低模型小鼠肺中AKT、p-AKT蛋白的表達(dá)量。另有研究發(fā)現(xiàn),雷帕霉素可通過抑制PI3K/AKT信號通路抑制RB細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[31]。

      此外,本研究結(jié)果表明,水蛭提取液可能通過抑制WERI-RB-1細(xì)胞表達(dá)VEGF降低VEGF下游PI3K的表達(dá),抑制p-AKT活性,進(jìn)一步抑制下游靶基因HIF-1a和MMP-9的表達(dá),從而抑制RB血管生成和腫瘤生長。其次,水蛭提取液可能直接抑制了HIF-1a的表達(dá),進(jìn)一步抑制下游靶基因VEGF和MMP-9的表達(dá),而VEGF又抑制了PI3K/AKT通路的活性,從而發(fā)揮抑制腫瘤血管生成和生長的作用。此外,水蛭提取液也可能直接抑制MMP-9的活性,進(jìn)而抑制MMP-9對WERI-RB-1細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解,從而抑制VEGF從ECM中釋放,并在一定程度上抑制VEGF-VEGF受體的相互作用,最終抑制PI3K/AKT通路的活性,抑制RB血管生成和轉(zhuǎn)移。既往研究觀察水蛭素對化療誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)病變(CIPN)的影響發(fā)現(xiàn),水蛭素可明顯減輕奧沙利鉑(L-OHP)化療副作用,顯著抑制L-OHP誘導(dǎo)的CIPN小鼠體內(nèi)p38、HIF-1的過表達(dá)和MMP-9/2的活化,達(dá)到改善CIPN的作用[32]。另有研究觀察水蛭素對急性肺損失大鼠的影響發(fā)現(xiàn),水蛭素可減少大鼠體內(nèi)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和MMP-12的釋放,推測水蛭素可抑制肺損傷引起的炎癥和纖維化,并作為抗炎介質(zhì)在肺保護(hù)中發(fā)揮作用[33]。因此,初步推測,水蛭提取液可能通過VEGF/PI3K/AKT信號通路和HIF-1a、MMP-9因子發(fā)揮抑制RB的作用,這為水蛭提取液的抗腫瘤作用機(jī)制提供了新的見解。然而,本研究的局限性和不足在于采用的藥物干預(yù)劑量分組較少,且0.04U/mL水蛭提取液的干預(yù)劑量對HIF-1a、PI3K和p-AKT的抑制作用強(qiáng)于0.08U/mL水蛭提取液,后期研究應(yīng)進(jìn)一步縮小劑量之間的跨度,設(shè)置更多劑量組,尋找最佳的藥物干預(yù)劑量。此外,由于時間和經(jīng)費限制,本研究觀察時間點較少,不能夠顯示動態(tài)的量效、時效曲線,同時缺少陽性對照,未進(jìn)行刺激、抑制信號通路的實驗證實相關(guān)通路的作用,后期研究將力爭進(jìn)一步完善。

      表1 引物序列

      綜上所述,水蛭提取液可能通過VEGF/PI3K/AKT信號通路介導(dǎo)的信號及抑制MMP-9和HIF-1a的表達(dá)抑制RB的發(fā)生發(fā)展,提示VEGF/PI3K/AKT可能是水蛭提取液在RB治療中的一個有前途的靶點。雖然該結(jié)論還需要進(jìn)一步完善和驗證,如進(jìn)行動物實驗/體內(nèi)試驗等,但本研究結(jié)果為目前研究RB提出了新的興趣點和潛在的研究價值。

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