馬立克氏病病毒RLORF1編碼蛋白通過抑制宿主IFN-β表達(dá)促進(jìn)病毒復(fù)制

江 波，蔡云虹，曹夢瑤,2，劉文曉，程 晶，許 健,3，李永清

(1. 北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 海淀 100097；2. 北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 昌平 102206；3. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730046)

馬立克氏病病毒(Marek's disease virus，MDV)屬于α皰疹病毒亞科，是雞馬立克氏病的病原，是一種雞高度易感的細(xì)胞結(jié)合型病毒，雞感染后表現(xiàn)為臟器的多發(fā)性腫瘤、神經(jīng)麻痹以及免疫系統(tǒng)損傷，常誘發(fā)其他病原體的合并感染[1]。目前，弱毒疫苗很大程度上控制了雞馬立克氏病的大規(guī)模暴發(fā)，但不能清除雞群中潛伏的致病性MDV，也無法阻止在免疫壓力下田間MDV的毒力增強(qiáng)[2]。

病毒感染宿主細(xì)胞后，宿主細(xì)胞通過模式識別受體識別病原相關(guān)分子模式后，通過調(diào)節(jié)干擾素調(diào)節(jié)因子(Interferon regulatory factor，IRF)、核轉(zhuǎn)錄激活蛋白1(Nuclear transcription factor activator protein-1，AP-1)和核因子NF-κB等激活I(lǐng)型干擾素(Type I interferon,IFN-I)的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抗病毒免疫作用[3]。MDV感染后，宿主通過模式識別受體介導(dǎo)IFN-I產(chǎn)生來抵抗病毒感染的同時(shí)，MDV也可以通過Meq、pp38、RLORF4等基因抑制宿主細(xì)胞IFN-I信號通路的激活，實(shí)現(xiàn)其在宿主體內(nèi)的復(fù)制[4-5]。α皰疹病毒的早期轉(zhuǎn)錄因子在病毒感染過程中可抑制宿主IFN-I信號通路激活，是α皰疹病毒抵抗宿主天然免疫反應(yīng)實(shí)現(xiàn)感染的新途徑[6-7]。感染細(xì)胞蛋白0(Infected cell protein 0，ICP0)作為α皰疹病毒的早期轉(zhuǎn)錄因子編碼蛋白，可以通過多種途徑抑制宿主細(xì)胞IFN-I抗感染免疫作用。單純皰疹病毒I型(Herpes simplex virus type 1，HSV-1)可通過ICP0抑制人上皮成纖維細(xì)胞DNA中受體干擾素誘導(dǎo)蛋白16(Interferon gamma inducible protein 16，IFI16)活性，進(jìn)而阻斷干擾素調(diào)節(jié)因子3(IFN regulatory factor 3，IRF3)的活化，抑制干擾素-β(Interferon-β，IFN-β)的表達(dá)與分泌，增強(qiáng)病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制[8]。牛皰疹病毒I型(Bovine herpes virus 1，BoHV-1)的ICP0通過直接降解宿主IRF3抑制IFN-β抗感染免疫反應(yīng)[9]。偽狂犬病毒(Pseudorabies，PRV)的ICP0與P65蛋白互作后限制P65磷酸化，進(jìn)而抑制NF-κB信號通路的活化[10]。水痘帶狀皰疹病毒(Varicella-zoste virus，VZV)的ORF61編碼蛋白利用其E3泛素連接酶活性阻斷NF-κB亞基入核，抑制IFN-β的抗感染作用[11]。

MDV基因組中不具備典型的ICP0編碼基因，但其RLORF1基因與α皰疹病毒的ICP0編碼基因部分同源[12-13]，提示了RLORF1可能在MDV感染過程中也發(fā)揮抑制天然免疫的作用。本試驗(yàn)利用細(xì)菌人工染色體技術(shù)制備了缺失RLORF1基因的重組MDV(CVI988△RLORF1和RB1B△RLORF1)，利用基因缺失毒和真核過表達(dá)質(zhì)粒，檢測RLORF1基因?qū)DV復(fù)制和宿主IFN-β應(yīng)答的影響，進(jìn)而研究RLORF1編碼蛋白在MDV抑制I型干擾素信號通路過程中的作用方式，以期為探明MDV致病機(jī)制提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒和質(zhì)粒 雞胚成纖維細(xì)胞(Chicken embryo fibroblast，CEF)：按常規(guī)方法取9～11日齡SPF雞胚制備單層CEF[14]；DF-1細(xì)胞、馬立克氏病病毒MDV疫苗株CVI988/Risepens株、雞MDV疫苗株CVI988株及超強(qiáng)毒株RB1B株的細(xì)菌人工染色體(Bacteria artificial chromosome，BAC)系統(tǒng)及其拯救毒株、含有半乳糖激酶Galk基因(GenBank 登錄號：945358)的質(zhì)粒pSK-Galk，均由本實(shí)驗(yàn)室保存。表達(dá)雞MDVRLORF1基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGF-N1-RLORF1，由本實(shí)驗(yàn)室采用pEGF-N1(英濰捷基上海貿(mào)易有限公司)真核表達(dá)載體構(gòu)建并保存。

1.2 主要試劑 DL2 000 DNA Marker，購自大連TaKaRa生物工程公司；質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠純化試劑盒，均購自天根生化科技有限公司；DMEM、MEM和轉(zhuǎn)染用營養(yǎng)液opti-MEM，均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；脂質(zhì)體LipofectamineTM3000，購自英濰捷基上海貿(mào)易有限公司；Poly(I∶C)、環(huán)鳥苷單磷酸腺苷(Cyclic GMP-AMPs，cGAMPs)，均購自Selleck公司；Maxiprep質(zhì)粒提取試劑盒，購自QIAGEN公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物 SFP級雞胚，購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司。

1.4RLORF1基因缺失MDV的構(gòu)建 設(shè)計(jì)同源重組引物RLORF1-G-FP和RLORF1-G-RP，以pSK-Galk載體為模板，通過PCR擴(kuò)增攜帶MDVRLORF1基因同源臂的Galk基因片段。PCR程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。將獲得攜帶MDVRLORF1基因同源臂的Galk基因片段電轉(zhuǎn)化至含有MDV BAC的EL250大腸桿菌感受態(tài)中(電轉(zhuǎn)化條件：1 850 V，25 μF，100 Ω，1 mm)，置于32 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，挑取單克隆用Galk鑒定引物Galk PF和Galk PR進(jìn)行PCR鑒定。PCR程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。利用Galk平板將鑒定陽性的細(xì)菌單克隆劃線純化1次，提取質(zhì)粒后使用MDVRLORF1基因特異性引物RLORF1 PF和RLORF1 PR進(jìn)行PCR鑒定。PCR程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。選定Galk基因鑒定為陽性，同時(shí)RLORF1基因鑒定為陰性的重組EL250菌，提取MDV BAC質(zhì)粒。將重組MDV BAC DNA轉(zhuǎn)染含CEF的6孔板中(1 μg/孔，參照LipofectamineTM3000說明書)以用來拯救重組MDV。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞置于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d后，將轉(zhuǎn)染的CEF進(jìn)行100倍稀釋后重新接種到新制備的CEF中繼續(xù)培養(yǎng)5 d，可以觀察到典型的MDV細(xì)胞病變效應(yīng)，即為制備的RLORF1基因缺失MDV，擴(kuò)增后置液氮中保存，用于研究RLORF1基因在MDV復(fù)制和激活I(lǐng)FN-β反應(yīng)過程中的作用。本試驗(yàn)中所用引物信息見表1。

表1 PCR引物信息

1.5RLORF1基因缺失對MDV復(fù)制的影響 為研究RLORF1基因缺失對MDV復(fù)制的影響，將MDV(CVI988、CVI988ΔRLORF1、RB1B、RB1BΔRLORF1)接種CEF(6孔板，200 PFU/孔)，置37 ℃ CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別在24、48、72、96 h和120 h收取細(xì)胞，提取細(xì)胞總DNA，稀釋至50 ng/μL。采用SYBR Green熒光定量PCR方法，以 MDVMeq基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)引物(Meq PF:5′-CCCAACAGCCCCTCCAAACAC-3′，Meq PR:5′-CTTCATGGAGTTTGTCTACA-3′)，10倍倍比稀釋CVI988 BAC和RB1B BAC質(zhì)粒并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測MDV的絕對含量。PCR程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，58.6 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。

1.6RLORF1基因過表達(dá)對MDV復(fù)制的影響 將表達(dá)RLORF1基因的pEGF-N1-RLORF1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染CEF(6孔板，2.5 μg/孔)，以pEGF-N1空載體為對照，培養(yǎng)24 h后，將MDV(CVI988、RB1B)分別以相同劑量接種轉(zhuǎn)染了真核表達(dá)質(zhì)粒的CEF(6孔板，200 PFU/孔)，在感染后的24、48、72、96 h和120 h收取細(xì)胞，提取總DNA檢測病毒復(fù)制水平，方法同1.5。

1.7RLORF1基因?qū)DV誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生IFN-β的影響 以野生型MDV(CVI988和RB1B)為對照，將MDV病毒(CVI988、CVI988ΔRLORF1、RB1B、RB1BΔRLORF1)接種CEF(6孔板，200 PFU/孔)，置37 ℃ CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別在24、48、72、96 h和120 h收取細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以雞GAPDH為內(nèi)參，采用SYBR Green熒光定量PCR方法檢測IFN-β的轉(zhuǎn)錄情況。PCR程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s,58.6 ℃ 1 min,40個(gè)循環(huán)。

1.8RLORF1基因?qū)F-1細(xì)胞表達(dá)IFN-β的影響 將表達(dá)RLORF1基因的pEGF-N1-RLORF1真核表達(dá)載體按照每孔0.25、0.50 μg和1.00 μg轉(zhuǎn)染12孔細(xì)胞板中的DF-1細(xì)胞，以1.00 μg pEGF-N1空載體為對照按照操作說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)24 h后分別用免疫刺激劑Poly(I ∶C)、cGAMPs處理細(xì)胞(1 μg/孔)，12 h后收取細(xì)胞，提取RNA反轉(zhuǎn)錄后檢測IFN-β的轉(zhuǎn)錄情況，方法同1.7。

2 結(jié)果

2.1RLORF1基因缺失MDV的構(gòu)建 利用細(xì)菌人工染色體技術(shù)拯救后分別利用MDVRLORF1特異性引物和Galk特異性引物對RLORF1基因缺失的重組MDV(CVI988ΔRLORF1和RB1BΔRLORF1)進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)，CVI988ΔRLORF1和RB1BΔRLORF1均無法擴(kuò)增出RLORF1基因(717 bp，GenBank登錄號：ADA83408.1)，野生型MDV(CVI988和RB1B)能夠擴(kuò)增出RLORF1基因(圖1A)，CVI988ΔRLORF1和RB1BΔRLORF1能夠擴(kuò)增出標(biāo)記基因Galk(1 381 bp)，而野生型CVI988和RB1B不能夠擴(kuò)增出Galk基因片段(圖1B)，表明CVI988ΔRLORF1和RB1BΔRLORF1病毒基因組DNA構(gòu)建成功。重組病毒轉(zhuǎn)染CEF后，均產(chǎn)生典型的MDV空斑，且重組病毒在形態(tài)上與野生型MDV具有相似的致細(xì)胞堆積的特點(diǎn)(圖2)，表明重組RLORF1基因缺失MDV拯救成功。但CVI988ΔRLORF1和RB1BΔRLORF1在CEF中復(fù)制時(shí)形成的MDV空斑面積明顯小于野生型MDV(圖2)。

圖1 RLORF1基因缺失的重組MDV的PCR鑒定

圖2 RLORF1基因缺失的重組MDV的細(xì)胞病變

2.2RLORF1基因缺失抑制MDV的復(fù)制 CVI988ΔRLORF1重組病毒復(fù)制水平在24～120 h內(nèi)均顯著低于野生型CVI988病毒(P<0.001)(圖3A)，同時(shí)RB1BΔRLORF1重組病毒復(fù)制水平在48～120 h內(nèi)均顯著低于其母本病毒RB1B(P<0.001)(圖3B)。結(jié)果表明，缺失RLORF1基因后MDV仍然可以進(jìn)行增殖，但缺失RLORF1基因可抑制MDV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。

圖3 RLORF1基因缺失對MDV復(fù)制的影響

2.3RLORF1過表達(dá)增強(qiáng)MDV的復(fù)制 表達(dá)MDVRLORF1編碼蛋白的真核表達(dá)載體pEGF-N1-RLORF1可以在感染后的48～120 h顯著增強(qiáng)MDV CVI988的復(fù)制(P<0.001) (圖4A)，表達(dá)MDVRLORF1編碼蛋白的真核表達(dá)載體pEGF-N1-RLORF1可以在感染后的24～120 h顯著增強(qiáng)MDV RB1B的復(fù)制水平(P<0.001)(圖4B)。結(jié)果表明，RLORF1編碼蛋白可以增強(qiáng)MDV的復(fù)制。

圖4 RLORF1編碼蛋白對MDV復(fù)制的影響

2.4RLORF1基因缺失MDV刺激宿主表達(dá)IFN-β的能力增強(qiáng) 在感染后的72～120 h內(nèi)CVI988ΔRLORF1誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生IFN-β的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于野生型MDV CVI988(P<0.05或P<0.001)(圖5A)，在感染后的72～120 h內(nèi)RB1BΔRLORF1誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生IFN-β的轉(zhuǎn)錄水平也明顯高于野生型MDV RB1B(P<0.05或P<0.001)(圖5B)。結(jié)果表明，缺失RLORF1基因的MDV誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生IFN-β的能力比野生型MDV強(qiáng)，RLORF1編碼蛋白可能是MDV抑制宿主IFN-β產(chǎn)生的蛋白因子。

圖5 RLORF1基因缺失對MDV誘導(dǎo)宿主細(xì)胞IFN-β產(chǎn)生的影響

2.5RLORF1基因編碼蛋白抑制宿主細(xì)胞IFN-β的轉(zhuǎn)錄 空白CEF和轉(zhuǎn)染pEGF-N1空載體的CEF在受到Poly(I∶C)和cGAMPs刺激時(shí)IFN-β轉(zhuǎn)錄水平均明顯上調(diào)，且兩者之間無顯著差異(P>0.05)。然而，轉(zhuǎn)染pEGF-N1-RLORF1質(zhì)粒的CEF在受到Poly(I∶C)和cGAMPs刺激時(shí)IFN-β的轉(zhuǎn)錄水平顯著低于轉(zhuǎn)染pEGF-N1空載體的CEF(P<0.001)(圖6)，說明MDVRLORF1基因在過表達(dá)情況下可以顯著抑制宿主細(xì)胞表達(dá)IFN-β的能力。

圖6 過表達(dá)RLORF1基因?qū)Υ碳┱T導(dǎo)DF-1細(xì)胞IFN-β產(chǎn)生的影響

3 討論

近年來，以MDV CVI988/Rispens株及MDV 814中國分離株為代表的弱毒活疫苗的大規(guī)模接種初步控制了馬立克氏病大規(guī)模暴發(fā)[15-17]。然而，鑒于MDV特殊的“潛伏-再活化”感染機(jī)制，弱毒疫苗誘導(dǎo)的特異性免疫反應(yīng)不能徹底清除潛伏感染的MDV病毒粒子，在雞T細(xì)胞中潛伏感染的MDV會在雞免疫低下或應(yīng)激時(shí)再次被激活，并經(jīng)羽毛皮屑等向環(huán)境排毒，導(dǎo)致養(yǎng)殖環(huán)境中持續(xù)存在MDV強(qiáng)毒粒子，使得養(yǎng)雞業(yè)仍然面臨巨大風(fēng)險(xiǎn)[18-19]。免疫抑制導(dǎo)致的混合感染和繼發(fā)感染是MDV給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失的重要原因，需要進(jìn)一步揭示宿主抗MDV感染免疫機(jī)制，解決免疫抑制導(dǎo)致的混合感染和繼發(fā)感染問題。本試驗(yàn)以MDV抑制先天性免疫反應(yīng)為切入點(diǎn)，首次發(fā)現(xiàn)了MDVRLORF1編碼蛋白可以抑制宿主IFN-β的表達(dá)進(jìn)而有利于病毒復(fù)制這一現(xiàn)象。

為研究MDVRLORF1基因在病毒感染過程中的作用，本試驗(yàn)利用細(xì)菌人工染色體技術(shù)將MDV超強(qiáng)毒株RB1B和疫苗毒株CVI988的RLORF1基因進(jìn)行缺失。MDV缺失毒CVI988ΔRLORF1和RB1BΔRLORF1均可以在CEF中復(fù)制并產(chǎn)生MDV典型細(xì)胞堆積樣空斑，說明在MDV超強(qiáng)毒株和弱毒株中RLORF1基因均為病毒復(fù)制的必需基因。HSV-1的RLORF1基因編碼蛋白ICP0缺失后，病毒同樣可以復(fù)制，但致病性和復(fù)制能力明顯減弱[20]。在本試驗(yàn)中MDVΔRLORF1在CEF中形成的空斑形態(tài)典型，但空斑面積較野生型MDV明顯變小，且缺失RLORF1之后MDV復(fù)制能力比野生型MDV明顯減弱，說明RLORF1基因盡管不是MDV復(fù)制的必需基因，但在病毒復(fù)制中發(fā)揮著正向調(diào)控的作用，從功能上與α皰疹病毒的ICP0相似[21]。轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體pEGF-N1-RLORF1過表達(dá)RLORF1基因時(shí)，MDV的復(fù)制能力明顯強(qiáng)于轉(zhuǎn)染空表達(dá)載體pEGF-N1時(shí)的MDV，可見RLORF1基因過表達(dá)可以促進(jìn)MDV在CEF中的復(fù)制。研究發(fā)現(xiàn)，α皰疹病毒多通過抑制IFN-I的抗病毒反應(yīng)來增強(qiáng)病毒在細(xì)胞中的復(fù)制[22]。本試驗(yàn)后繼檢測了RLORF1基因缺失以及過表達(dá)對病毒誘導(dǎo)的宿主IFN-I通路激活的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MDVRLORF1基因缺失毒復(fù)制能力弱于野生型母本毒，但誘導(dǎo)IFN-β的能力明顯強(qiáng)于野生型母本毒，說明MDVRLORF1編碼蛋白在其感染過程中發(fā)揮了抑制宿主INF-β表達(dá)的作用。在病毒模擬物誘導(dǎo)IFN-I激活的試驗(yàn)中也得到了相同的結(jié)果。病毒RNA模擬物Poly(I∶C)和cGAS激活劑cGAMPs可以用來激活CEF中的IFN-I信號通路進(jìn)而上調(diào)IFN-β的轉(zhuǎn)錄[23-24]。在DF-1細(xì)胞中過表達(dá)RLORF1可以破壞Poly(I∶C)和cGAMPs對CEF IFN-I信號通路的激活，這進(jìn)一步說明了MDVRLORF1基因表達(dá)產(chǎn)物可以抑制宿主IFN-I信號通路。盡管轉(zhuǎn)錄蛋白RLORF1抑制宿主細(xì)胞IFN-I信號通路激活的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，但綜上結(jié)果表明,MDV感染過程中可通過RLORF1編碼蛋白抑制宿主IFN-I信號通路，從而有利于病毒的復(fù)制。

本試驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)了MDV的RLORF1轉(zhuǎn)錄蛋白具備通過抑制IFN-β表達(dá)以增強(qiáng)自身復(fù)制的能力，為探明MDV感染導(dǎo)致宿主免疫抑制的發(fā)生機(jī)理提供參考，也為研究MDV感染機(jī)制提供了新的線索。