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      CAR-T 細(xì)胞治療實體瘤的現(xiàn)存挑戰(zhàn)及優(yōu)化策略

      2022-12-12 21:18:07郭菲菲綜述崔久嵬審校
      中國腫瘤臨床 2022年12期
      關(guān)鍵詞:免疫抑制靶點抗原

      郭菲菲 綜述 崔久嵬 審校

      自2017 年至今,以Kymriah(CTL019)和Yescarta(KTE-C19)為代表的系列嵌合抗原受體T 細(xì)胞(chimeric antigen receptor T-cell,CAR-T)治療相繼被批準(zhǔn)上市,CAR-T 療法在血液腫瘤治療中取得突破性進(jìn)展[1]。然而,當(dāng)研究進(jìn)一步將注意力轉(zhuǎn)向占據(jù)全部腫瘤90%比例的實體瘤時,CAR-T 療法并未得到令人滿意的結(jié)果,實體瘤本身及其微環(huán)境的特殊性為CAR-T 細(xì)胞治療帶來了巨大挑戰(zhàn)。一方面,實體瘤細(xì)胞抗原的異質(zhì)性以及特異性腫瘤抗原(tumor-specific antigen,TSA)的缺乏使CAR-T 難以對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行精準(zhǔn)的靶向性識別和殺傷[2];另一方面,實體瘤特殊的腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME),包括異常血管結(jié)構(gòu)和基質(zhì)成分組成的第一道物理屏障,以及TME 中多種免疫抑制細(xì)胞、抑制性免疫及代謝分子組成的二次屏障,使CAR-T 難以浸潤腫瘤組織,同時面臨活性衰竭及功能失調(diào)的風(fēng)險[3]。針對這些問題,基于CAR-T 自身改造以及CAR-T 聯(lián)合治療兩個方向的研究取得了較好的結(jié)果。本文對CAR-T 治療實體瘤最新的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述以供參考。

      1 CAR-T 治療實體瘤的優(yōu)化靶點選擇

      僅表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的TSA 是抗腫瘤治療的理想靶點,然而,由于TSA 極其缺乏且大部分存在于細(xì)胞內(nèi),靶點選擇投向同時表達(dá)于腫瘤細(xì)胞(高表達(dá))和正常組織(低表達(dá))的腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associated antigen,TAA),面臨潛在的脫靶效應(yīng)(on-target/off-tumor)[4]。據(jù)報道,1 例伴有肝肺轉(zhuǎn)移的晚期結(jié)腸癌患者,在接受抗HER2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2) CAR-T 治療5 天后發(fā)生死亡。CART 對表達(dá)低水平HER2 肺上皮細(xì)胞的攻擊所導(dǎo)致的血液高水平細(xì)胞因子狀態(tài)被認(rèn)為是主要的致死原因[5]。實體瘤細(xì)胞的抗原異質(zhì)性是限制靶點選擇的又一關(guān)鍵因素,單靶點CAR-T 難以根除同一腫瘤病灶中的所有實體瘤細(xì)胞[2]。

      1.1 增強CAR-T 的抗原特異性識別

      理想的特異性靶點是增強CAR-T 抗原識別的根本方法。表皮生長因子受體Ⅲ型突變體(epidermal growth factor receptor variant Ⅲ,EGFRvⅢ)是目前研究較為廣泛的靶點之一,由EGFR 的第一和第八外顯子在一個新甘氨酸的連接作用下融合而成。因其具有高度腫瘤組織特異性,臨床前研究將其作為CAR-T治療靶點,并取得了較好的效果[6]。更有臨床試驗進(jìn)一步肯定了EGFRvⅢ作為CAR-T 臨床治療靶點的可行性。由O'Rourke 等[7]開展的一項針對9 例復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma,GBM)患者的I 期臨床研究結(jié)果顯示,EGFRvⅢ CAR-T 治療具有良好抗腫瘤效果、安全性(無脫靶毒性)及耐受性。由溶瘤病毒(oncolytic virus,OV)介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞抗原遞送與標(biāo)記是提供CAR-T 特異性靶點的另一有效途徑。典型的是編碼截短CD19 蛋白(truncated CD19,CD19t)的溶瘤病毒抗原遞送標(biāo)記系統(tǒng)。Park 等[8]利用編碼CD19t 的溶瘤牛痘病毒(OV19t)感染多種實體瘤細(xì)胞,均顯著促進(jìn)了CAR-T 細(xì)胞浸潤及腫瘤殺傷。同時,CAR-T 介導(dǎo)的腫瘤裂解進(jìn)一步導(dǎo)致OV19t 釋放,促進(jìn)了CD19t 在實體瘤細(xì)胞上的表達(dá),形成腫瘤清除的正反饋。

      通過區(qū)分腫瘤組織與正常組織TAA 密度的不同,也能夠增加CAR-T 抗原識別的特異性和敏感性。Hernandez-Lopez 等[9]利用synNotch(synthetic Notch)受體系統(tǒng)構(gòu)建了一種超靈敏抗原密度感應(yīng)性CAR-T,即由一個針對HER2 的低親和力synNotch 受體控制一個針對HER2 的高親和力CAR 的表達(dá)。當(dāng)syn-Notch 受體被高抗原密度HER2 完全激活時,則會誘導(dǎo)高親和力CAR 的表達(dá),隨后啟動CAR-T 對腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷。經(jīng)體外及體內(nèi)研究證實,表達(dá)這一系統(tǒng)的CAR-T 細(xì)胞對表達(dá)正常數(shù)量HER2 的非腫瘤細(xì)胞和表達(dá)100 倍HER2 的腫瘤細(xì)胞的殺傷具有顯著性差異。另外,多種傳統(tǒng)表觀遺傳調(diào)節(jié)劑對抗原密度的調(diào)節(jié)也被證實能夠增加CAR-T 抗原識別的敏感性。如地西他濱,作為一種DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑,被發(fā)現(xiàn)可以通過DNA 去甲基化上調(diào)胰腺癌細(xì)胞上抗原MUC1 的表達(dá),增加MUC1 CAR-T 的特異性識別和殺傷[10]。

      1.2 克服腫瘤細(xì)胞抗原異質(zhì)性

      對于實體瘤的高度異質(zhì)性,同時靶向兩種或兩種以上腫瘤抗原是一種有效的解決辦法,可以通過構(gòu)建包含不同scFv(single-chain variable fragment)結(jié)構(gòu)的CAR-T 及CAR-T 聯(lián)合雙特異性抗體來實現(xiàn),從而有效清除表達(dá)任一靶點抗原的腫瘤細(xì)胞。目前,雙特異性CAR-T 已經(jīng)得到廣泛研究且效果顯著。與針對單一抗原的CAR-T 相比,Kloss 等[11]構(gòu)建的同時靶向前列腺特異性膜抗原(prostate-specific membrane antigen,PSMA)和前列腺干細(xì)胞抗原(prostate stem cell antigen, PSCA)的CAR-T 細(xì)胞被證實能夠在前列腺癌小鼠模型中實現(xiàn)對表達(dá)單靶點和雙靶點抗原腫瘤細(xì)胞的清除。近期一項研究利用synNotch 受體系統(tǒng)設(shè)計了一種“prime-and-kill”邏輯門控回路,從而更好實現(xiàn)了精確的腫瘤控制。在這一回路中,只有當(dāng)syn-Notch 受體識別特異性的腫瘤啟動抗原(如EGFRvⅢ和MOG)后,識別廣泛存在的腫瘤殺傷抗原(如EphA2 和IL13Rα2)的CAR 才能啟動轉(zhuǎn)錄并發(fā)揮抗腫瘤作用。在GBM 小鼠模型中,這一新型CAR-T 顯示出優(yōu)于傳統(tǒng)CAR-T 的抗腫瘤療效和持久性,且無脫靶毒性,提供了一種適用于實體瘤的一般識別策略[12]。

      CAR-T 與雙特異性抗體的聯(lián)合主要包括雙特異性T 細(xì)胞銜接器(bi-specific T-cell engager,BiTE)和雙特異性適配器(bi-specific adapter)。BiTE 由兩種scFv 組成,一種識別T 細(xì)胞表面蛋白CD3ε,另一種識別腫瘤細(xì)胞表面抗原,從而介導(dǎo)CAR-T 及內(nèi)源性T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷。Choi 等[13]設(shè)計了一種自分泌anti-EGFR BiTE 的anti-EGFRvⅢ CAR-T,證實其在GBM 小鼠模型中根除異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞的能力。雙特異性適配器由一個標(biāo)簽蛋白(如生物素)和一個針對單個抗原的抗體片段偶聯(lián)而成,將靶向不同抗原的雙特異性適配器組合與靶向標(biāo)簽蛋白的通用型CAR-T聯(lián)合也能夠克服腫瘤異質(zhì)性。如通過與anti-CD19與CD20 adapters 的聯(lián)合,anti-biotin CAR-T 被發(fā)現(xiàn)能夠以抗體劑量依賴的方式實現(xiàn)干擾素釋放及異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞殺傷[14]。

      2 CAR-T 治療實體瘤克服TME

      實體瘤具有極為復(fù)雜的微環(huán)境,對CAR-T 細(xì)胞的浸潤、活性及功能有不同程度的抑制。實體瘤微環(huán)境中高度異常的血管和基質(zhì)結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是阻礙CART 細(xì)胞浸潤的關(guān)鍵因素。與正常組織相比,腫瘤血管常呈不規(guī)則形狀并伴有不同程度塌陷,而腫瘤基質(zhì)則更為致密和剛性。兩者共同形成的物理屏障導(dǎo)致CAR-T 難以浸潤[3]。實體瘤的免疫抑制性微環(huán)境主要由免疫抑制細(xì)胞如髓源性抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cell,MDSC)及調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(regulatory T cell,Treg),免疫抑制性檢查點如PD-L1 以及多種免疫抑制性因子如TGF-β 組成,被認(rèn)為是影響CAR-T細(xì)胞活性及功能的關(guān)鍵因素[15]。腫瘤異常的代謝物累積以及典型的缺氧、低PH、氧化應(yīng)激等條件構(gòu)成了損害CAR-T 抗腫瘤作用的代謝微環(huán)境。如吲哚胺2,3雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)被發(fā)現(xiàn)能夠通色氨酸消耗和犬尿氨酸累積來抑制CAR-T 細(xì)胞毒性,缺氧環(huán)境中的CAR-T 細(xì)胞也被發(fā)現(xiàn)功能嚴(yán)重受損[16]。

      2.1 增強CAR-T 的TME 浸潤

      多種傳統(tǒng)療法因其對TME 的重塑作用,在促進(jìn)CAR-T 的腫瘤組織浸潤中占有著優(yōu)勢?;燁A(yù)處理聯(lián)合CAR-T 已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床研究。一項研究(NCT01869166)提示,在anti-EGFR CAR-T 治療前給與白蛋白結(jié)合型紫杉醇聯(lián)合環(huán)磷酰胺治療,可通過結(jié)合富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine,SPARC)來消耗腫瘤基質(zhì),從而促進(jìn)CAR-T 細(xì)胞浸潤并提升其抗腫瘤療效[17]。局部放療也能夠顯著增強CAR-T 細(xì)胞的腫瘤浸潤。如在GBM 小鼠模型中,研究發(fā)現(xiàn)在靜脈注射anti-GD2CAR-T 后進(jìn)行局部放療能夠有效促進(jìn)CAR-T 細(xì)胞的血管外滲及腫瘤浸潤,并增強其抗腫瘤作用[18]。鑒于熱療對TME 的重塑作用,包括破壞基質(zhì)及擴張血管結(jié)構(gòu)等,CAR-T 聯(lián)合光熱治療也能夠顯著促進(jìn)CAR-T 累積及腫瘤控制。在激光照射下的實體瘤小鼠模型中,聯(lián)合應(yīng)用具有雙光熱-納米催化性質(zhì)的納米酶被發(fā)現(xiàn)能夠增強anti-B7-H3 CAR-T 細(xì)胞的浸潤[19]。

      腫瘤抗血管生成治療和基質(zhì)降解治療對CAR-T細(xì)胞浸潤的促進(jìn)則更為直接。在原位人神經(jīng)母細(xì)胞瘤的小鼠模型中,Bocca 等[20]證實貝伐單抗治療能夠通過促進(jìn)腫瘤血管正常化來增強anti-GD2 CAR-T 細(xì)胞的大量浸潤。腫瘤基質(zhì)中硫酸乙酰肝素蛋白多糖成分(heparan sulfate proteoglycans,HSPG)的降解被認(rèn)為是CAR-T 細(xì)胞跨越腫瘤基質(zhì)屏障的第一步?;诖嗽O(shè)計的表達(dá)肝素酶的CAR-T(anti-HPSE CAR-T)被證實通過降解HSPG 增強自身浸潤[21]。另外,由腫瘤相關(guān)基質(zhì)細(xì)胞組成的纖維結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是形成腫瘤基質(zhì)屏障的主要原因,成纖維細(xì)胞激活蛋白(fibroblast activation protein,F(xiàn)AP)作為腫瘤相關(guān)纖維母細(xì)胞的標(biāo)志成為一個潛在治療靶點。如anti-FAP CAR-T 被發(fā)現(xiàn)在肺癌及胰腺癌小鼠模型中能夠有效減少腫瘤基質(zhì)并抑制腫瘤生長[22]。

      2.2 克服腫瘤免疫微環(huán)境的抑制

      免疫抑制細(xì)胞的功能抑制或清除是維持腫瘤浸潤CAR-T 細(xì)胞功能的有效途徑之一。低劑量化療作為目前臨床CAR-T 治療的主要預(yù)處理方法之一,能夠通過誘導(dǎo)免疫抑制細(xì)胞清除來重塑腫瘤免疫微環(huán)境以增強CAR-T 療效。Guo 等[17]對晚期膽管癌患者的anti-EGFR CAR-T 治療進(jìn)行白蛋白結(jié)合型紫杉醇和環(huán)磷酰胺預(yù)處理,顯著提高了CAR-T 的治療效果。另外,越來越多的臨床前研究提示,CAR-T 與現(xiàn)存療法的聯(lián)合或CAR-T 自身的改造都能夠有效清除免疫抑制細(xì)胞并增強CAR-T 療效。Watanabe 等[23]將表達(dá)TNF-α 和IL-2 的溶瘤腺病毒(oncolytic adenovirus,OAd)聯(lián)合CAR-T,發(fā)現(xiàn)其能夠促進(jìn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞向M1 型極化并增加DC 細(xì)胞成熟,從而顯著提升CAR-T 浸潤及抗腫瘤作用。近期一項研究提出,利用CAR-T 細(xì)胞遞送模式識別受體激動劑RN7SL1(一種激活RIG-I/MDA5 信號通路的內(nèi)源性RNA),能夠顯著抑制MDSCs 發(fā)育并促進(jìn)具有共刺激特征DC 細(xì)胞亞群的生長,從而促進(jìn)CAR-T 功能[24]。

      免疫檢查點是幫助CAR-T 克服實體瘤免疫抑制微環(huán)境的另一個選擇。CAR-T 聯(lián)合免疫檢查點抑制劑已被廣泛證明能夠有效增強CAR-T 對實體瘤的控制。近期一項研究顯示,臨床惡性胸膜間皮瘤患者在接受派姆單抗聯(lián)合anti-MSLN CAR-T 治療后,表現(xiàn)出良好安全性及耐受性,患者中位總生存期可達(dá)23.9個月[25]。CAR-T 聯(lián)合編碼免疫檢查點抗體的OA 也能夠有效幫助CAR-T 克服免疫抑制。Tanoue 等[26]設(shè)計的編碼PD-L1 迷你抗體的OAd 被證實能夠在前列腺癌模型中增強anti-HER2 CAR-T 功能。此外,通過對CAR-T 進(jìn)行改造,包括抑制免疫檢查點的表達(dá)或阻斷其信號傳遞,也能夠有效增強CAR-T 療效。Zou 等[27]研究發(fā)現(xiàn),同時下調(diào)抑制性免疫檢查點受體PD-1、Tim-3 和Lag-3 表達(dá)的CAR-T 細(xì)胞具有更好的抗腫瘤作用。除了通過CRISPR/Cas9技術(shù)對PD-1進(jìn)行敲除,利用腺嘌呤堿基編輯器改變PD-1 的糖基化殘基也能夠降低PD-1 表達(dá),從而增強CAR-T 細(xì)胞毒性[28]。通過對PD-1 的胞外區(qū)進(jìn)行修飾可以阻斷其信號傳遞。如Pan 等[29]通過在anti-GPC3 CAR-T 中引入一個由PD-1 的胞外結(jié)構(gòu)域和IgG4 的CH3 構(gòu)成的可溶性PD1-CH3 融合蛋白來切斷PD-1/PD-L1 信號傳遞,并證實了其在肝細(xì)胞癌小鼠模型中顯著的抗腫瘤作用。

      2.3 克服腫瘤代謝微環(huán)境的抑制

      對于實體瘤異常的代謝微環(huán)境,通過對CAR-T進(jìn)行改造或與相關(guān)抑制劑聯(lián)合均能有效提高CAR-T療效。腺苷是TME 中高度累積的代謝物之一,能夠通過激活CAR-T 細(xì)胞表面腺苷受體(adenosine 2a receptor,A2aR)來抑制其功能。Masoumi 等[30]研究發(fā)現(xiàn),無論是在CAR-T 結(jié)構(gòu)中同時表達(dá)anti-A2aRshRNA序列,還是將CAR-T 聯(lián)合A2aR 特異性小分子拮抗劑SCH-58 261,均能有效提高CAR-T 功能。腺苷脫氨酶1(adenosine deaminase 1,ADA 1)能夠?qū)⑾佘辗纸鉃榧≤眨琎u 等[31]據(jù)此設(shè)計的過表達(dá)ADA 的CART 細(xì)胞在卵巢癌及結(jié)腸癌小鼠模型中呈現(xiàn)顯著擴增,并有效控制腫瘤生長及延長小鼠存活期。IDO 是腫瘤代謝微環(huán)境中另一潛在靶點。Huang 等[32]研究證實,miR-153 能夠通過靶向IDO1 的3’非編碼區(qū)抑制其在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá),在體外及小鼠體內(nèi)模型中增強CAR-T 的抗腫瘤作用。TME 的氨基酸水平對CAR-T 細(xì)胞功能同樣影響巨大。如TME 中的低水平精氨酸會損害缺乏精氨酸再合成酶精氨琥珀酸合酶(arginine resynthesis enzymes argininosuccinate synthase,ASS)和鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶(ornithine transcarbamylase,OTC)表達(dá)的CAR-T 細(xì)胞的功能?;诖嗽O(shè)計的表達(dá)功能性ASS 或OTC 的酶修飾CAR-T 被證實能夠有效增加CAR-T 細(xì)胞增殖,并在不影響CAR-T 的細(xì)胞毒性或衰竭程度的基礎(chǔ)上,提高實體瘤清除率[33]。

      除了異常的代謝物,缺氧和氧化應(yīng)激等條件也被利用以解除腫瘤代謝微環(huán)境對CAR-T 功能的限制。碳酸酐酶IX(carbonic anhydrase IX, CAIX)是一種參與 缺 氧 誘 導(dǎo) 因 子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF1α)缺氧信號通路的關(guān)鍵蛋白及潛在靶點,Cui 等[34]研究發(fā)現(xiàn),anti-CAIX CAR-T 能夠在GBM 小鼠模型中發(fā)揮有效抗腫瘤作用。另外,為了應(yīng)對腫瘤相關(guān)的氧化應(yīng)激,Ligtenberg 等[35]構(gòu)建了一種過表達(dá)過氧化氫酶的CAR-T,其能夠高效地將過氧化氫催化成水和氧氣并減少活性氧(reactive oxygen species,ROS)累積,從而維持低氧化狀態(tài)及具有顯著抗腫瘤活性。

      3 結(jié)語與展望

      CAR-T 在實體瘤治療中雖面臨諸多困境,但隨著對實體瘤及CAR-T 細(xì)胞自身特征認(rèn)識的不斷加深,不斷涌現(xiàn)的創(chuàng)新性解決策略為這一療法帶來了新的希望。無論是針對CAR-T 自身結(jié)構(gòu)的優(yōu)化改造,還是將CAR-T 與其他腫瘤治療方法相結(jié)合,均呈現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。CAR-T 細(xì)胞治療有望在實體瘤領(lǐng)域血液腫瘤的取得成效,最終使臨床腫瘤患者獲益最大化。

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