丁羽 趙永超 趙然尊

纖維化以成纖維細(xì)胞增殖、肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化、膠原分泌增多及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的過度沉積為特征,影響組織器官的結(jié)構(gòu)及功能重構(gòu),最終導(dǎo)致器官衰竭的發(fā)生［1］。進(jìn)行性纖維化是心力衰竭中病理重構(gòu)的重要基礎(chǔ),最終不可逆性進(jìn)展為心力衰竭［2］。表觀遺傳學(xué)通過染色質(zhì)的不同共價(jià)修飾,包括DNA 甲基化和組蛋白修飾以及與非編碼RNA的相互作用影響染色質(zhì)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),調(diào)控DNA 的轉(zhuǎn)錄起始、延伸、復(fù)制與修復(fù)［3］。近年來,表觀遺傳作為基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的重要方式,在心臟纖維化進(jìn)展中發(fā)揮重要功能,可能為心血管疾病提供的新的診療見解及防治策略,本文簡要綜述靶向表觀遺傳機(jī)制在心臟纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)理。

1 DNA 甲基化與心臟纖維化

DNA 甲基化是在DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyl-transferase,DNMT)催化下,以S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosyl methionine,SAM)為甲基供體,將甲基轉(zhuǎn)移至CpG 島的胞嘧啶磷酸鳥嘌呤二核苷酸共價(jià)結(jié)合形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-mC)［4］。異常DNA甲基化可沉默或激活纖維化過程的基因表達(dá)模式,例如基因PPARa、PPARg 及RASAL1 的啟動(dòng)子高甲基化和轉(zhuǎn)錄失活與纖維發(fā)生密切相關(guān)［5］。

心肌成纖維細(xì)胞(CFs)活化是導(dǎo)致心臟纖維化的關(guān)鍵,DNMT1 介導(dǎo)細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3(suppressors of cytokine signaling 3,SOCS3)啟動(dòng)子超甲基化導(dǎo)致其在糖尿病心臟纖維化過程中表達(dá)下調(diào),促進(jìn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3(Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)激活,以促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞的激活和膠原沉積［6］。Watson 等［7］發(fā)現(xiàn)在缺氧導(dǎo)致心臟成纖維細(xì)胞中DNA 高甲基化并DNMT1和DNMT3b 高表達(dá),并受到缺氧誘導(dǎo)因子-1α (hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α) 的調(diào)節(jié)。使用小干擾RNA(siRNA) 或5-氮雜胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine)下調(diào)DNMT3b 表達(dá)可顯著降低膠原蛋白1 和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表達(dá),抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β) 的促纖維化作 用［8］。TGF-β1 通過經(jīng)典TGF-β/Smad 信號傳導(dǎo)途徑或絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞分化,并抑制DNMT1表達(dá),從而抑制α-SMA 啟動(dòng)子區(qū)域甲基化［9］。

2 組蛋白乙?；揎椗c心臟纖維化

在真核細(xì)胞中,DNA 被濃縮在染色質(zhì)內(nèi),與組蛋白共同組成核小體,每個(gè)核小體由核心組蛋白H2A、H2B、H3 和 H4 各兩個(gè)分子組成。組蛋白的N 端“尾部”區(qū)域,可進(jìn)行多種翻譯后修飾,包括乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化等,這些修飾以不同的方式影響染色質(zhì)的緊實(shí)度和可及性［10］。乙酰化是最常見的組蛋白修飾,由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase,HATs) 與組蛋白脫乙?；?histone deacetylases,HDACs)共同調(diào)控［11］。乙?；芍泻徒M蛋白中的堿性電荷,減弱與DNA 的相互作用,調(diào)節(jié)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和基因活性［11］。

目前證據(jù)表明,HDAC 抑制劑(histone deacetylase inhibitor)在預(yù)防或逆轉(zhuǎn)纖維發(fā)生中具有有益作用［12］。通過比較不同HDAC 抑制劑在心臟成纖維細(xì)胞中的作用機(jī)制,發(fā)現(xiàn) 曲古抑菌素A(TSA)、MGCD0103 和環(huán)肽Ⅰ類HDAC 抑制劑制蚜菌素均表現(xiàn)出促進(jìn)組蛋白乙?；哪芰?并有效地阻止了心臟成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程［13］。其中MGCD0103 增加了纖維化相關(guān)基因的表達(dá)［13］。肽酶抑制因子16(peptidase inhibitor 16,PI16)是心臟成纖維細(xì)胞中特有的HDAC1 調(diào)節(jié)因子,過表達(dá)的PI16 降低了HDAC1 的核水平,導(dǎo)致K18 和K27 賴氨酸中組蛋白3 乙酰化水平增加,減少了心肌間膠原沉積,顯著抑制成纖維細(xì)胞的增殖和纖維化相關(guān)蛋白的水平［14］。

除組蛋白外,HDAC 還可以使非組蛋白脫乙酰基化,從而控制多種細(xì)胞過程。Tao 等［15］研究發(fā)現(xiàn)在心臟成纖維細(xì)胞增殖和纖維化過程中,甲基-CpG 結(jié)合蛋白2(Methyl-CpG-binding protein 2,MeCP2) 可能通過HDAC6 負(fù)性調(diào)控α-微管蛋白乙?；?從而影響心臟成纖維細(xì)胞的增殖。用乙?；D(zhuǎn)移酶p300 特異性小分子抑制劑L002 或C646 逆轉(zhuǎn)高血壓誘導(dǎo)的組蛋白乙酰化,改善左心室肥厚、心臟纖維化和舒張功能障礙［16］。

溴結(jié)構(gòu)域和額外終端域家族蛋白(bromodomain and extra-terminal domain,BET)的家族可特異性識別組蛋白中乙?；嚢彼幔?7］,是一種重要的表觀遺傳學(xué)閱讀器,它與乙酰組蛋白和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,以控制基因表達(dá),其家族成員溴結(jié)構(gòu)域蛋白4 (bromodomaincontaining protein 4,BRD4) 作為TGF-β 信號傳導(dǎo)效應(yīng)子,活化RNA 聚合酶Ⅱ并驅(qū)動(dòng)促纖維化基因表達(dá),刺激心臟成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化［18］。此外,BRD4 還參與EndMT 過程,均可促進(jìn)心臟纖維化發(fā)展［19］。

3 非編碼RNAs 與心臟纖維化

大約99%人類基因組編碼的RNA 不編碼蛋白質(zhì),但是這些非編碼RNA(Non-coding RNA,ncRNA)在細(xì)胞活動(dòng)的形成中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。長度大于200 個(gè)核苷酸的非編碼RNA 分子稱為長鏈非編碼RNA(LncRNA)［20］。LncRNA 的表達(dá)譜可區(qū)分不同病理類型的心力衰竭,如缺血性和非缺血性心肌?。?1］。LncRNA MEG3 在心臟成纖維細(xì)胞中與P53 相互作用以抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)的表達(dá),可減輕心臟纖維化并改善舒張功能［22］。LncRNA Ang362 通過直接抑制Smad7 促進(jìn)心肌梗死后的心臟纖維化［23］。Dusp5 作為MAPK/ERK1/2途徑的重要調(diào)節(jié)因子［24］,Tao 等［25］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)LncRNA H19 部分抑制DUSP5/ERK1/2 軸促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞增殖。

MicroRNA (miRNA) 是一類長度約為22 個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA 分子,通過結(jié)合靶mRNA 的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)作為基因表達(dá)后的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。現(xiàn)有證據(jù)表明多種MicroRNA 參與成纖維細(xì)胞活化和增殖相關(guān)的纖維化調(diào)節(jié)［26］。在心肌梗死后心臟纖維化進(jìn)程中,miR-29 家族靶向編碼纖維化相關(guān)蛋白mRNA,包括多種膠原、纖維蛋白和彈性蛋白,此外,有人提出miR-29a 可能是肥厚型心肌病中纖維化的潛在生物標(biāo)志物［27］。miR-125b 抑制纖維形成的關(guān)鍵脂肪細(xì)胞因子 (Apelin),誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)變并改變了關(guān)鍵纖維化相關(guān)基因的基因表達(dá)譜,并誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖,促進(jìn)心臟纖維化［28］。miR-21 調(diào)控PTEN/Smad7 途徑,促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積［29］。在豬缺血/再灌注后第5 天和第19 天時(shí)冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射抗miR-21,RNA-seq 顯示抗miR-21 治療的心肌中miR-21靶基因組顯著抑制,減輕炎癥反應(yīng),抑制MAPK 信號通路,減少巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞數(shù)量,減輕了心臟纖維化和心肌細(xì)胞肥大［30］。

CircularRNA(CircRNA)是一類單鏈環(huán)狀RNA 分子,是基因表達(dá)的新型調(diào)節(jié)因子,其機(jī)制主要為miRNA 海綿效應(yīng),轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)［31］。通過CircRNA 測序,發(fā)現(xiàn)在TGF-β1 處理的心臟成纖維細(xì)胞中283 個(gè)與心臟纖維化相關(guān)的途徑相關(guān)的差異表達(dá)基因,包括TGF-β 信號通路、PⅠ3Kakt 信號通路、AMPK 信號通路和MAPK 信號通路［32］。CircRNA 可作為miRNA海綿或競爭性內(nèi)源性RNA 分子,調(diào)節(jié)靶mRNA 表達(dá)。在心臟成纖維細(xì)胞中,MiR-26b-5p 與Ⅰ型膠原α2(Recombinant Collagen TypeⅠAlpha 2,Col1α2)和結(jié)締組織生長因子(Connective tissue growth factor,CTGF)的3' UTR 相互作用,抑制其轉(zhuǎn)錄,從而發(fā)揮抗纖維化作用,CircRNA-000203 可特異“海綿”miR-26b-5p,促 進(jìn)Col1α2 與CTGF 表 達(dá)［33］。circHIPK3 充 當(dāng)miR-29b-3p “海綿”,改變了針對a-SMA、Col1α1、Col3α1 的 miR-29b-3p 的表達(dá)水平,逆轉(zhuǎn) miR-29b-3p對 CFs 增殖和遷移的抑制作用［34］。

4 RNAm6A 甲基化與心臟纖維化

RNA 甲基化可在mRNA 中形成N-6 甲基腺苷(N6-Methyladenosine,m6A),是最豐富的mRNA 內(nèi)部修飾,m6A 修飾可影響mRNA 剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)、儲存、翻譯或衰變,可調(diào)控各種生理過程中基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制。m6A 修飾心室重構(gòu)中具有重要作用,m6A 甲基化轉(zhuǎn)移酶3(methyltransferase like 3,METTL3) 及去甲基化酶肥胖相關(guān)蛋白(fat mass and obesity-associated protein,FTO) 與病理性心肌肥大、纖維化密切相關(guān)［35,36］。Berulava 等［37］在終末期心臟病中,檢測到2164 個(gè)轉(zhuǎn)錄本中發(fā)生了3208 個(gè)m6A 修飾峰,這些修飾基因功能主要與結(jié)構(gòu)可塑性的過程有關(guān),例如“調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞增殖”、“細(xì)胞外基質(zhì)”以及“代謝功能”等。Li 等［38］證實(shí)m6A 甲基化酶METTL3 至少部分通過Smad 介導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)心臟纖維化。與正常成纖維細(xì)胞相比,抑制METTL3 表達(dá)后,膠原編碼基因和TGF-β/Smad 途徑基因表達(dá)下調(diào),GO 分析顯示,m6A-甲基化的mRNA 與膠原相關(guān)因子和促纖維化因子如P4ha3、Tgfbi、Fgf2、Furin、Col5α1、Col6α1、Col6α2和Col6α3 表達(dá)水平降低相關(guān)［38］。METTL3 與α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶同系物5(α-Ketoglutaratedependent dioxygenase alkB homolog 5,ALKBH5)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子TFEB 表達(dá),抑制METTL3 表達(dá)后,增強(qiáng)缺血后心肌細(xì)胞自噬通量,抑制細(xì)胞凋亡,減輕了心臟纖維化的發(fā)生［39］。

5 蛋白的翻譯后修飾與心臟纖維化

蛋白質(zhì)翻譯后修飾(protein post-translating modification,PTM)是一種可逆過程,其可逆性以及對靶蛋白的穩(wěn)定性、活性和亞細(xì)胞定位的影響,在心臟重構(gòu)領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注［40］,主要修飾類型包括泛素化、類泛素蛋白修飾(SUMO)化、甲基化、糖基化、磷酸化、乙?；龋?1］。因此,研究PTM 作為逆轉(zhuǎn)異常表觀遺傳修飾可能為心臟重構(gòu)治療開辟新的治療途徑。

在SUMO 修飾靶蛋白過程中,泛素綴合酶類E2I(ubiquitin-conjugating enzyme E2I,UBC9) 是目前發(fā)現(xiàn)的唯一E2 結(jié)合酶,UBC9 過表達(dá)可介導(dǎo)SUMO 化水平升高,增加心肌自噬通量,減少纖維化［42］。而沉默UBC9 可抑制早幼粒細(xì)胞白血病蛋白(promyelocytic leukemia protein,PML) SUMO 修 飾［43］,從而抑制TGF-β/Smad 信號通路,促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞分化［43］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),PML 蛋白SUMO修飾既是TGF-β1 調(diào)節(jié)的下游靶點(diǎn),同時(shí)可激活TGF-β1 表達(dá),形成正反饋調(diào)節(jié)［44］。

泛素化調(diào)節(jié)真核生物的許多基本細(xì)胞過程,這種翻譯后修飾通常由 E1、E2 和 E3 酶實(shí)現(xiàn),它們分別催化激活、接合和連接反應(yīng),導(dǎo)致泛素的共價(jià)連接,通常連接到底物蛋白的賴氨酸殘基上［45］。多項(xiàng)證據(jù)表明泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin proteasome system,UPS)參與了心臟纖維化。Daniels 等［46］發(fā)現(xiàn)β 腎上腺素能(β-Adrenergic receptor,β-AR)受體刺激可增加細(xì)胞外泛素(ubiquitin,UB)水平,外源性UB 通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和組織金屬蛋白酶抑制因子2(TIMP2)表達(dá)降低β-AR 刺激的心肌纖維化。近來研究發(fā)現(xiàn)外源性UB 與其受體CXC 趨化因子受體4(CXC chemokine receptor type 4,CXCR4)相互作用激活ERK1/2信號通路,調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞內(nèi)信號、表型和功能［47］。

泛素C-末端水解酶 L1(ubiquitin C-terminal hydrolase L1,UCHL1)與葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 kDa 相互作用,通過泛素化促進(jìn)其降解,促進(jìn)心肌纖維化［48］,其抑制劑LDN57444 可調(diào)節(jié)核因子κB(NF-κB) 信號通路,抑制成纖維細(xì)胞增殖,減弱Ⅰ型膠原和CTGF 基因的表達(dá)［49］。泛素特異性蛋白酶2(ubiquitin-specific protease 2,USP2)過表達(dá)減輕心肌肥大、炎癥反應(yīng)和纖維化以及減少氧化應(yīng)激［50］,并與β-catenin 相互作用,調(diào)節(jié)其在CFs 中的去泛素化及穩(wěn)定性,并上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1),促進(jìn)CFs 活化［51］。

6 小結(jié)

心臟纖維化導(dǎo)致心臟異常僵硬,最終發(fā)生心臟衰竭。表觀遺傳學(xué)將環(huán)境因素與基因表達(dá)聯(lián)系起來,靶向纖維化相關(guān)基因調(diào)控成纖維細(xì)胞增殖、凋亡,誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化,促進(jìn)纖維化的發(fā)生發(fā)展。然而目前表觀遺傳對心臟纖維化進(jìn)程的影響程度尚不十分明確,主要研究停留于基礎(chǔ)科研階段,需要進(jìn)一步觀察心臟纖維化過程中的表觀遺傳學(xué)變化,探索心臟纖維化機(jī)制,以延緩心臟重構(gòu)進(jìn)展,有望為心力衰竭提供全新的治療方法。