馬子健 馬明領(lǐng) 董輝 楊斌 王永祥

1.揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院(蘇北人民醫(yī)院)骨科，江蘇 揚(yáng)州 225001

2.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009

3.大連醫(yī)科大學(xué)研究生院，遼寧 大連 116044

骨質(zhì)疏松癥是常見(jiàn)的骨代謝性疾病，依賴于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞作用的平衡，一旦失衡就會(huì)導(dǎo)致骨量流失、骨密度下降、骨脆性增加等問(wèn)題，其后果便是骨折及其并發(fā)癥。常見(jiàn)的原發(fā)性骨質(zhì)疏松見(jiàn)于老年性骨質(zhì)疏松和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松，繼發(fā)性骨質(zhì)疏松常見(jiàn)于糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松。骨質(zhì)疏松是多因素造成的結(jié)果，結(jié)合早期對(duì)雌激素方面的研究，逐漸意識(shí)到炎癥與骨質(zhì)疏松密切相關(guān)，雌激素與人體的免疫系統(tǒng)有多種聯(lián)系，并且雌激素可以減輕人體炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的骨流失[1-2]，氧化應(yīng)激也可以從炎癥途徑影響骨代謝平衡[3]。細(xì)胞焦亡是一種炎癥相關(guān)的程序性細(xì)胞壞死，是人體的天然免疫屏障，當(dāng)感染或者異常損傷時(shí)被激活，但目前還沒(méi)有研究報(bào)道細(xì)胞焦亡在骨代謝中的作用機(jī)制。本綜述主要結(jié)合最新研究進(jìn)展，總結(jié)細(xì)胞焦亡的調(diào)控機(jī)制及其在骨質(zhì)疏松方面的未來(lái)展望。

1 細(xì)胞焦亡

細(xì)胞焦亡是一種不同于凋亡和自噬的程序性死亡。早在2001年Boise等[4]總結(jié)前人經(jīng)驗(yàn)將這種炎性細(xì)胞死亡稱為“pyroptosis”—焦亡。其形態(tài)學(xué)特征是細(xì)胞發(fā)生腫脹，形成焦亡小體，細(xì)胞膜破裂，釋放炎癥因子。焦亡有經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑。在經(jīng)典途徑中，細(xì)胞通過(guò)模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRRs)可以識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(pattern recognition receptors，PAMPs)或損傷相關(guān)分子模式(danger-associated molecular patterns，DAMPs)，常見(jiàn)的PAMPs有細(xì)菌脂多糖、病毒RNA[5]等，而DAMPs包括受損的蛋白質(zhì)、植入物碎片[6]等。Nod樣受體(nod-like receptors，NLRs)作為焦亡途徑中的經(jīng)典受體，含有NLRP家族蛋白，并參加炎癥小體的組裝，當(dāng)其受到響應(yīng)時(shí)，又將信號(hào)傳遞給下游的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein contain a CARD，ASC)，并且通過(guò)募集pro-caspase-1從而組裝成炎癥小體。最常研究的有NLRP3、AIM2等炎癥小體。募集的pro-caspase-1被剪切成有活性的caspase-1蛋白酶，也被稱為含有半胱氨酸的天冬氨酸水解酶，caspase家族蛋白在細(xì)胞凋亡途徑中尤為重要[7]，而在焦亡的經(jīng)典途徑中最為重要的是caspase-1。激活的caspase-1不僅可以切割炎癥因子IL-1b和IL-18的前體促進(jìn)其成熟，而且可以剪切效應(yīng)蛋白gasdermin D(GSDMD)以暴露N-末端效應(yīng)結(jié)構(gòu)域。后者與細(xì)胞膜結(jié)合形成孔道，使細(xì)胞內(nèi)的IL-1b和IL-18釋放，并募集周圍的炎癥因子，同時(shí)水及鈉離子進(jìn)入細(xì)胞破壞正常的內(nèi)外滲透壓平衡，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹破裂，內(nèi)容物釋放[8]。非經(jīng)典途徑主要是細(xì)菌脂多糖(LPS)直接與caspase-4/11/15結(jié)合并激活炎癥小體及GSDMD誘導(dǎo)焦亡，與感染性疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9]。在經(jīng)典途徑中最為主要的調(diào)控因子是NLRP炎癥小體及下游的炎癥因子，但有研究證明焦亡在骨關(guān)節(jié)炎起到重要作用，而且NLRP3也與骨代謝的通路密切相關(guān)[10]。

2 細(xì)胞焦亡在骨穩(wěn)態(tài)中的探索

2.1 焦亡與破骨細(xì)胞

炎癥小體是是由受體蛋白NLR或ALR、接頭蛋白ACS及效應(yīng)蛋白caspase組成的復(fù)合體。NLRP3炎癥小體的上調(diào)需要NF-kB通路來(lái)實(shí)現(xiàn)[11]，而NF-kB通路在破骨細(xì)胞活化中是最為經(jīng)典的通路之一[12]。研究發(fā)現(xiàn)[13]，在破骨細(xì)胞中特異性表達(dá)Nlrp3D301 N的中，Nlrp3D301 N的高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致骨量丟失，主要是由于NLRP3促成的IL-1b等炎癥因子發(fā)揮作用，進(jìn)一步活化破骨細(xì)胞引起骨吸收作用。

引起骨質(zhì)疏松的外界因素有空氣中的鎘等重金屬[14]，但Chen等[15]發(fā)現(xiàn)鋁誘導(dǎo)的骨丟失可以引起人體氧化應(yīng)激和炎癥因子增加，并導(dǎo)致NLRP3的上調(diào)，但經(jīng)煙酰胺單核苷酸處理后的小鼠血清中IL-1b、IL-18等炎癥因子顯著下降，ASC、caspase-1炎癥蛋白表達(dá)下降，從而減緩鋁誘導(dǎo)的骨損傷。在牙周炎這種感染性炎癥性疾病引起的骨吸收中，NLRP3能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，并且通過(guò)敲除NLRP3基因，發(fā)現(xiàn)NLRP3缺失可使IL-1β釋放受阻并抑制破骨細(xì)胞分化[16]。但有研究發(fā)現(xiàn)[17]，通過(guò)細(xì)菌誘導(dǎo)炎癥的中，敲除NLRP3基因骨吸收程度并沒(méi)有降低，反而在caspase-1 KO的小鼠中骨吸收減弱，但是破骨細(xì)胞數(shù)量反而增加，提示caspase-1可能參與炎癥性骨吸收作用。

2.2 焦亡與成骨細(xì)胞

細(xì)胞焦亡與代謝性疾病如糖尿病密切相關(guān)[18]，而糖尿病引起的骨質(zhì)疏松也被廣泛研究，胰島素缺乏及高血糖引起氧化應(yīng)激可導(dǎo)致成骨細(xì)胞功能障礙[19]。Yang等[20]通過(guò)建立體內(nèi)和體外糖尿病模型，通過(guò)檢測(cè)高糖環(huán)境中焦亡相關(guān)蛋白caspase-1、GSDMD的表達(dá)水平上升，證明了高糖可以激活牙槽骨成骨細(xì)胞的焦亡；并且使用capsase-1抑制劑可以使高糖對(duì)成骨細(xì)胞的增殖分化的抑制作用下降，從而證明了高糖可以通過(guò)焦亡途徑抑制牙槽骨成骨細(xì)胞的增值和分化。另外，研究發(fā)現(xiàn)[21]，通過(guò)糞腸桿菌感染成骨細(xì)胞MG63細(xì)胞，上調(diào)了caspase-1和NLRP3炎癥小體的表達(dá)，并使用caspase-1抑制劑處理和siRNA沉默NLRP3后，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞LDH釋放減少以此來(lái)說(shuō)明以上處理導(dǎo)致焦亡減弱，說(shuō)明NLRP3參與了糞腸桿菌誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的焦亡途徑。而且Liu等[22]從LPS誘導(dǎo)成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激的角度證明了焦亡的存在，抑制焦亡可以增強(qiáng)成骨細(xì)胞的分化和活性。

3 NLRP3在骨穩(wěn)態(tài)中的研究

作為經(jīng)典的炎癥小體，NLRP3在炎癥性骨病中已被廣泛研究，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[23]、強(qiáng)直性脊柱炎[24]、骨髓炎[25]等。但是炎癥小體在焦亡通路中的作用機(jī)制尚未完善。炎癥小體的激活需要NF-kB通路以及有效激動(dòng)劑如離子轉(zhuǎn)移、ROS等[18]。研究發(fā)現(xiàn)[26]，鳶尾素作為一種與運(yùn)動(dòng)相關(guān)的骨骼肌分泌物，與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松密切相關(guān)。經(jīng)鳶尾素治療的OVX大鼠，通過(guò)檢測(cè)出抗氧化因子Nrf2蛋白高于骨質(zhì)疏松組，而NLRP3表達(dá)相反；并且治療組中與凋亡相關(guān)的caspase-3和NLRP3表達(dá)下降及Runx2 成骨基因的mRNA水平顯著上調(diào)，成骨細(xì)胞凋亡減少，說(shuō)明了鳶尾素能夠誘導(dǎo)Nrf2的上調(diào)，減少了成骨細(xì)胞的凋亡并且抑制NLRP3的表達(dá)?？梢?jiàn)炎癥小體并不是細(xì)胞焦亡的專屬，其實(shí)細(xì)胞凋亡和焦亡之間存在交互關(guān)系。與凋亡相關(guān)的caspase-8能夠激活caspase-3切割Pannexin-1通道蛋白[27]，Pannexin-1促進(jìn)鉀離子外排并開(kāi)啟NLRP3的組裝[28]，caspase-8是調(diào)控細(xì)胞死亡方式的中間點(diǎn)，NLRP3·ASC炎癥小體可以募集caspase-8，若caspase-8有活性則激活下游的caspase-3引發(fā)凋亡，否則激活caspase-1引發(fā)焦亡[29-30]。與凋亡相關(guān)的caspase-3/8甚至可以直接作用于GSDMD家族蛋白引發(fā)焦亡，而GSDMD成孔效應(yīng)的延遲則可能使焦亡轉(zhuǎn)化為凋亡。有研究表明[31]，通過(guò)脂多糖或軟脂酸激活間充質(zhì)干細(xì)胞中的NLRP3炎性小體發(fā)現(xiàn)成骨分化減弱，脂肪分化加強(qiáng)，并且通過(guò)抑制下游效應(yīng)蛋白caspase-1，可以抑制這種成脂分化和輕度改善成骨效應(yīng)。Xu等[32]通過(guò)建立OVX，發(fā)現(xiàn)褪黑素能夠抑制NLRP3在成骨細(xì)胞中的表達(dá)，并且改善了NLRP3對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞胞向成骨分化的抑制作用。還有研究表明骨基質(zhì)成分可以作為DAMPS激活NLRP3的表達(dá)來(lái)刺激破骨細(xì)胞的分化，從而維持骨吸收過(guò)程[33]?？偨Y(jié)多項(xiàng)研究可以看出炎癥小體在骨穩(wěn)態(tài)中的作用正在不斷被挖掘，但是很多研究未能真正將細(xì)胞焦亡與骨穩(wěn)態(tài)和骨質(zhì)疏松疾病聯(lián)系起來(lái)，而只是停留在炎癥小體的研究上，很大程度上是細(xì)胞焦亡的機(jī)制還沒(méi)有被完全解釋清楚，以及細(xì)胞焦亡與凋亡等其他細(xì)胞死亡方式是否存在密切關(guān)系，這些都有待進(jìn)一步研究。

4 IL-1b、IL-18相關(guān)作用

作為焦亡途徑的下游信號(hào)，IL-1b和IL-18是關(guān)鍵的炎癥因子，也是焦亡發(fā)生的效應(yīng)物質(zhì)。IL-1b和IL-18同屬于IL-1家族成員，具有相似的信號(hào)傳導(dǎo)通路[34]，兩者經(jīng)caspase-1切割后暴露活性，引起級(jí)聯(lián)炎癥反應(yīng)。早已被證明骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等炎癥性骨病與IL-1b、IL-18等炎癥因子密切相關(guān)，如IL-1b、IL-18骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)液中表達(dá)過(guò)高[35-36]，而這些炎癥性骨病甚至?xí)?dǎo)致骨密度降低、骨穩(wěn)態(tài)紊亂，繼而引發(fā)骨質(zhì)疏松[37]。IL-1b和IL18也有相互促進(jìn)分泌的作用[38]。

IL-1b骨折愈合的重要因素之一[39]?？傮w來(lái)說(shuō)IL-1b在骨穩(wěn)態(tài)的作用是促進(jìn)骨吸收，IL-1b通過(guò)上調(diào)RANKL及招募巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)來(lái)促進(jìn)破骨細(xì)胞前體的分化和成熟[40-41]，并且增強(qiáng)破骨細(xì)胞的活性。Zhuang等[42]在構(gòu)建小鼠牙周炎模型中通過(guò)誘導(dǎo)M2型抗炎巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)IL-1RA(白細(xì)胞介素1受體拮抗劑)mRNA表達(dá)升高，RANKL表達(dá)下降，并降低了破骨細(xì)胞的活性。并且另一研究證明IL-1RA缺陷會(huì)增加破骨細(xì)胞的形成[43]。當(dāng)IL-1b與相應(yīng)受體結(jié)合后，引起下游NF-kB、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、活化蛋白-1(AP-1)等多種因子上調(diào)，啟動(dòng)c-Fos信號(hào)，從而導(dǎo)致破骨細(xì)胞相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[44-45]，阿托伐他汀則可以抑制IL-1b引起的NF-kB和MAPK信號(hào)，從而抑制破骨細(xì)胞分化[46]。另外，IL-1b似乎與腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)密切相關(guān)，早在許多年前就有這方面的研究，極低濃度的IL-1b和TNF-α可以協(xié)同刺激破骨細(xì)胞生成[47]，TNF-α是公認(rèn)的破骨細(xì)胞相關(guān)因子，降鈣素基因相關(guān)肽可以抑制IL-1b和脂多糖刺激成骨細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，并間接降低破骨活性[48]。而且IL-1可以抑制成骨細(xì)胞產(chǎn)生的骨保護(hù)素(OPG)，間接增強(qiáng)了破骨活性[49]，但García-Lpez等[50]從機(jī)械應(yīng)力的角度發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞上清液中IL-1b、TNF-α等破骨相關(guān)因子上調(diào)的同時(shí)，OPG也隨之上調(diào)，說(shuō)明細(xì)胞因子對(duì)成骨細(xì)胞具有多通路影響。

而IL-18對(duì)骨穩(wěn)態(tài)的作用相對(duì)復(fù)雜。早期研究證明，IL-12和IL-18可以協(xié)同抑制破骨細(xì)胞活性，但二者均不能直接作用于破骨前體細(xì)胞[51]。而IL-18可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[52]。IL-18可由T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等分泌，也有研究證明成骨細(xì)胞也具備分泌IL-18的能力[53]。有研究表明[54]，IL-18 可以調(diào)節(jié)體內(nèi)成骨細(xì)胞的骨合成代謝，并且受甲狀旁腺素的調(diào)控。IL-18可以從以下幾個(gè)方面來(lái)影響人體的骨代謝平衡：(1)IL-18通過(guò)作用于T細(xì)胞釋放粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，從而抑制破骨細(xì)胞活性[55]；(2)IL-18通過(guò)作用于T細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，從而間接刺激破骨細(xì)胞活性[56]；(3)IL-18和IL-12協(xié)同通過(guò)作用于輔助性T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ(interferon-γ)，一方面可以下調(diào)RANKL，抑制RANK信號(hào)傳導(dǎo)，并且抑制TNF-α誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化；但另一方面，IFN-γ通過(guò)作用于T細(xì)胞分泌破骨因子RANKL和TNF-α，并且在病理?xiàng)l件下又可以激活破骨細(xì)胞[57-59]。

5 總結(jié)與展望

細(xì)胞焦亡作為一種新型的炎癥性程序性死亡，與傳統(tǒng)的凋亡和壞死既有區(qū)別又有共性，焦亡相關(guān)蛋白的研究正在廣泛地進(jìn)行，關(guān)于焦亡還有很多需要探索，比如細(xì)胞焦亡是否具有自我調(diào)節(jié)機(jī)制，從而避免焦亡過(guò)度激活造成組織損傷，以及GSDMD成孔效應(yīng)是否受到細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的調(diào)控。而目前研究細(xì)胞焦亡在骨穩(wěn)態(tài)中的影響，無(wú)論是對(duì)成骨細(xì)胞還是破骨細(xì)胞，往往研究的是焦亡引起的炎癥因子IL-1b和IL-18對(duì)二者的影響，NLRP3炎癥小體、caspase蛋白家族以及IL-1b和IL-18可以作為治療骨質(zhì)疏松的靶點(diǎn)，但仍要思考的是一方面能否給出成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞焦亡的形態(tài)學(xué)證據(jù)，以及要證明在發(fā)生骨質(zhì)疏松常見(jiàn)的部位如股骨、腰椎等是否有焦亡的存在；另一方面，焦亡相關(guān)蛋白是否可以參與已研究的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞通路，如OPG/RANKL/RANK、Wnt/β-catenin等，這些都有待進(jìn)一步研究。