張惜燕 胡勇 邢玉瑞

陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712046

糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)作為抗炎和免疫抑制劑，在臨床上使用最為廣泛且有效。長期應(yīng)用GC對骨組織及肌肉組織產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的損傷，從而導致糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥(glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP)。GIOP是臨床最常見的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥[1]，其特征是骨重塑的持續(xù)變化，骨形成減少，骨吸收增加，同時骨質(zhì)量下降，導致骨折的發(fā)生率增加。研究證實，自噬作為維持惡劣微環(huán)境下細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要機制，在調(diào)控骨骼的動態(tài)平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。然而，針對由GC長期應(yīng)用所形成的GIOP，自噬在其中的作用機制值得進一步深入研究。

1 GIOP發(fā)病機制

骨穩(wěn)態(tài)失衡，即破骨-成骨的動態(tài)平衡被打破，是OP發(fā)生的核心機制。然而在GIOP的發(fā)生發(fā)展過程中，GC通過直接或間接作用影響骨組織微環(huán)境中多種參與骨形成相關(guān)細胞，同樣抑制了骨活動和骨形成，但其機制主要表現(xiàn)在：①骨丟失增加。GC抑制小腸的鈣、磷吸收，一方面腎臟尿鈣排泄增加，引起繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進；同時，減少雌激素及睪酮的合成，干擾細胞骨架，最終促使破骨細胞活化，骨丟失增加。②骨形成抑制。GC抑制Ⅰ型膠原和非膠原蛋白質(zhì)合成，成骨細胞增殖變?nèi)酰羌毎蛲鯷3]。③骨質(zhì)量、骨強度降低。GIOP導致椎體骨折風險明顯增高，GIOP患者發(fā)生骨折的骨密度閾值相較于絕經(jīng)后OP患者明顯增高，說明GC對骨小梁影響更大，對松質(zhì)骨的影響大于皮質(zhì)骨[4]。同時，老年性和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，其骨質(zhì)溶解主要是通過增加破骨細胞的數(shù)量和功能，而GIOP主要是由成骨功能受損引起的。另外，GIOP骨代謝與GC用藥時間具有相關(guān)性。研究表明，應(yīng)用GC 18個月以內(nèi)，患者骨代謝狀態(tài)處于高分解、低成骨狀態(tài)，超過 30個月以上，患者骨代謝狀態(tài)則處于低分解、低成骨、低轉(zhuǎn)換狀態(tài)[5]。可見，GIOP的發(fā)病機制在OP基礎(chǔ)上有其自身特點。

2 自噬與GIOP的相關(guān)性

自噬通過溶酶體降解、清除途徑來維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。近年來，自噬在骨骼系統(tǒng)的生長和穩(wěn)態(tài)維持方面的作用得到日益關(guān)注。在骨質(zhì)疏松癥的研究中發(fā)現(xiàn)，大鼠接受藥物干預后，自噬標志物Beclin-1、LC3、ATGS和成骨標志物Runx-2、BMP-2的表達呈正相關(guān)，均顯著增加；micro-CT檢測發(fā)現(xiàn)大鼠脊椎骨骨小梁的數(shù)量及厚度、骨密度、骨量均顯著增加，這表明自噬水平的增加與骨質(zhì)疏松的改善有關(guān)[2]。由于自噬在細胞應(yīng)激和環(huán)境適應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，作為應(yīng)激因素的糖皮質(zhì)激素可誘導細胞自噬反應(yīng)已得到證實。且大多數(shù)研究表明，通過激活、促進自噬，可以調(diào)控GIOP過程中骨形成相關(guān)細胞的功能狀態(tài)，提高成骨能力，保護骨骼。然而，針對骨質(zhì)疏松癥和糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥，自噬發(fā)生的靶細胞和表型存在差異。楊鈺粒等[6]認為，在OP中，自噬異常參與的靶細胞主要集中在破骨細胞和少量成骨細胞，其表型以骨密度減少，骨組織紊亂為主，臨床以骨脆性增強，易折斷為主要表現(xiàn)；而在GIOP中，自噬靶細胞主要為成骨細胞和少量破骨細胞，表現(xiàn)為成骨細胞數(shù)量減少，早熟成骨細胞凋亡，臨床以骨質(zhì)疏松、骨折、骨壞死為主要表現(xiàn)。

3 自噬在GIOP中的作用機制

3.1 GIOP與骨髓間充質(zhì)干細胞自噬

骨發(fā)育過程中的成骨前體細胞主要來源于骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)。BMSCs的異常主要表現(xiàn)為分化能力和數(shù)量的變化。正常范圍的GC可促進BMSCs增殖，并向成骨或成脂分化，而高濃度GC則促進BMSCs成脂分化，同時減少核轉(zhuǎn)錄因子的表達以及BMSCs的增殖從而抑制骨生成[7]。Komori[8]研究表明，自噬對糖皮質(zhì)激素誘導的骨細胞凋亡具有保護作用，但在過量的糖皮質(zhì)激素時，自噬過程導致BMSCs成骨分化能力受限，并誘導細胞凋亡、抑制Wnt信號通路和調(diào)節(jié)成骨細胞和骨細胞中microRNA的表達來抑制骨形成。王龍[9]研究發(fā)現(xiàn)，無論是GIOP大鼠的BMSCs還是體外地塞米松直接處理的BMSCs，在糖皮質(zhì)激素誘導下均發(fā)生自噬，自噬能夠維持BMSCs增殖活力并抑制高濃度GC造成的凋亡。萬永鮮[10]研究表明，骨質(zhì)疏松BMSCs表現(xiàn)出更明顯的衰老表型，且成骨分化能力和自噬水平較弱；促進自噬可增強骨質(zhì)疏松BMSCs的成骨分化，從而提高其成骨能力。因此，在糖皮質(zhì)激素刺激的應(yīng)激環(huán)境下，一定程度的自噬可從BMSCs增殖和分化能力方面扮演保護細胞的角色。

3.2 GIOP與成骨細胞、骨細胞自噬

成骨細胞(osteoblast，OB)由BMSCs分化而來。在骨形成過程中，OB陷于骨基質(zhì)則分化為骨細胞，OB和骨細胞在骨組織合成過程中起主要作用。研究表明，長期大劑量應(yīng)用GC能誘導自噬發(fā)生，此時體內(nèi)外自噬標志物表達增加，骨細胞內(nèi)自噬空泡積累及自體吞噬增加[11]。隨著研究逐漸深入，發(fā)現(xiàn)GC對骨細胞的影響多是在對成骨細胞或破骨細胞的影響基礎(chǔ)上。針對OB，發(fā)現(xiàn)臨床中應(yīng)用不同劑量的GC會有不同程度的療效及不良反應(yīng)，而 GC影響成骨細胞活力也呈時間和劑量依賴性。低劑量地塞米松(<10-8mol/L)可使成骨細胞自噬水平與細胞活力顯著增加，凋亡減少，高劑量(>10-6mol/L)可加速細胞凋亡[12]。小鼠成骨細胞系MC3T3在地塞米松誘導下發(fā)生的自噬活動，48 h達到高峰，隨后下降[13]。地塞米松干預大鼠4周，成骨細胞自噬活性增強，骨形成無降低，大鼠骨量也無明顯丟失；干預9～12周，不同劑量地塞米松組的成骨細胞自噬活性降低，骨形成及BMD也隨之下降[14]。由此可見，長時期、高劑量的GC應(yīng)用可通過降低成骨細胞自噬水平，導致GIOP的發(fā)生。對于自噬水平表現(xiàn)出和GC作用一致的時間和劑量依賴性，韓愚弟[13]、瞿功玲等[15]均認為其原因可能是，過高濃度和長時間的GC作用過度激活自噬，自噬相關(guān)蛋白質(zhì)和底物消耗過快，合成速度變低，自噬水平下降，細胞凋亡。這提示GC作用下自噬對成骨細胞增殖起保護作用，隨著GC濃度的增高自噬水平明顯增加但相對不足，不能抵抗高濃度GC對細胞增殖的抑制作用[16]。因此，一定水平上提高自噬水平有助于促進成骨細胞增殖，而只有適度的自噬下，才能使蛋白質(zhì)分解合成有序，延緩細胞凋亡。

3.3 GIOP與破骨細胞自噬

破骨細胞(osteoclast，OC)主要行使骨吸收的功能，和OB共同維持骨穩(wěn)態(tài)的平衡。Han等[17]研究表明，過量GC會減少破骨細胞凋亡，導致破骨細胞數(shù)量增加，壽命延長，破骨細胞生成增多，形成骨質(zhì)疏松癥。隨著糖皮質(zhì)激素劑量的增加，破骨細胞在0.1 μmol/L時生成增加，1 μmol/L時出現(xiàn)峰值，10 μmol/L時相應(yīng)減少，即糖皮質(zhì)激素對破骨細胞的形成和功能具有劑量依賴性的正效應(yīng)；其發(fā)生的主要機制是GC通過促進自噬誘導破骨細胞的產(chǎn)生[18]。Fu等[19]研究表明，Dex治療組小鼠骨小梁微結(jié)構(gòu)惡化，破骨細胞數(shù)量和分布面積增加(P<0.01)；同時，Dex給藥后小鼠破骨細胞中的自噬增加，表現(xiàn)為自噬體數(shù)量增加和自噬相關(guān)蛋白水平上調(diào)。在骨質(zhì)疏松癥的研究中，大多結(jié)論與在GIOP中一致，降低自噬能夠抑制破骨細胞分化和功能，保護骨骼。然而亦有不同結(jié)論，認為下調(diào)自噬可以抑制破骨細胞的分化[20]。其原因可能是，在破骨細胞的分化過程中，自噬起著正向調(diào)控作用，而在成熟的破骨細胞中，自噬則主要發(fā)揮維持穩(wěn)態(tài)的作用[6]。這種看似矛盾的結(jié)論，可能與OB和OC所處的狀態(tài)和階段有關(guān)。

4 GIOP中自噬發(fā)生的相關(guān)信號通路

mTOR信號通路是針對破骨細胞負性調(diào)控自噬水平的主要信號通路。其中，PI3K/Akt/mTOR信號通路介導了在糖皮質(zhì)激素誘導的骨丟失中破骨細胞自噬的增強[19]。GC可以通過MAPK/ERK信號通路激活自噬，MAPK/ERK是自噬的正性調(diào)節(jié)因子，抑制這一途徑可以在基礎(chǔ)條件下減少自噬。研究提示，地塞米松預處理降低骨細胞對氧化應(yīng)激誘導細胞死亡的敏感性，抑制MAPK/ERK可使自噬體的形成減弱，導致骨細胞死亡[21]。說明水平適中的糖皮質(zhì)激素引起骨細胞自噬是一種新的細胞保護功能，以防止氧化應(yīng)激和其他損傷引起的細胞死亡。同時提示在某些條件下氧化應(yīng)激可誘導細胞發(fā)生自噬。研究表明，在小鼠成骨細胞系MC3T3-E1細胞中，GC通過激活細胞自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)，促進大量活性氧物質(zhì)(ROS)產(chǎn)生，進而促進細胞凋亡[22]。

GC激活OPG/RANKL/RANK通路可促進骨的吸收導致骨量減少，骨強度降低[23]。研究發(fā)現(xiàn)敲除自噬相關(guān)蛋白Atg7，小鼠在發(fā)育期和成年期均表現(xiàn)出骨量減少，骨小梁體積降低。這種表型歸因于成骨細胞TNFSFII/RANKL增加，OPG減少，破骨細胞活化；而Atg7缺乏以依賴于DDIT3/CHOP和MAPK8/JNK1-SMAD1/5/8的方式阻礙成骨細胞礦化并促進部分細胞凋亡，重建Atg7可改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并恢復骨骼平衡[24]?？梢?，GIOP與成骨細胞自噬缺陷相關(guān)，是通過OPG/RANKL/RANK通路介導的，而成骨細胞中Atg7缺乏引發(fā)ERS應(yīng)激。有文獻報道，糖皮質(zhì)激素誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活了IRE1α/XBP-1 s信號轉(zhuǎn)導和誘導自噬，進而對內(nèi)皮細胞的存活和增殖起到保護作用，避免了糖皮質(zhì)激素對細胞的進一步損傷[25]；而在骨平衡中，激素誘導的細胞自噬和凋亡與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及股骨頭缺血有密切聯(lián)系[26]。

5 討論與展望

在GIOP的形成發(fā)展過程中，具有治療和致病雙重作用的糖皮質(zhì)激素，同時作為應(yīng)激因素，可調(diào)控細胞自噬。自噬在GIOP發(fā)生發(fā)展過程中所起到的作用至今仍未非常明確。其原因有三：①與GC的劑量相關(guān)。上述多項研究均表明，GC對細胞數(shù)量和功能的影響具有劑量依賴性。低劑量、短時期的GC應(yīng)用常使細胞自噬增強，促進細胞增殖及功能的發(fā)揮；反之，細胞自噬能力降低，細胞增殖及功能受到抑制?？梢?，自噬的發(fā)生對GC同樣具有劑量依賴性。②GIOP由多細胞參與，各細胞功能不同。在低劑量、短時期的GC應(yīng)用時，GC激活自噬，此時BMSCs的成骨分化能力增強，OB和骨細胞數(shù)量增多、功能增強，而同時，GC通過促進自噬誘導了OC的產(chǎn)生。OC與BMSCs、OB、骨細胞的功能產(chǎn)生拮抗，因此，自噬作用產(chǎn)生爭議，與OB和OC所處的狀態(tài)和階段有關(guān)。③自噬與凋亡的關(guān)系。很多自噬或凋亡相關(guān)蛋白起著雙開關(guān)的作用，使得自噬與凋亡高度關(guān)聯(lián)，共同決定細胞命運。因此二者關(guān)系主要表現(xiàn)為兩種，一是自噬與凋亡合作，都造成細胞死亡；二是自噬可通過更新細胞內(nèi)物質(zhì)抑制凋亡[27]。在研究自噬與GIOP中的作用機制，勢必應(yīng)同時考慮凋亡的作用。另外，有研究提出自噬的發(fā)生與年齡、性別因素相關(guān)[28]，此相關(guān)性同樣發(fā)生于GIOP中，這也是考慮自噬作用的重要影響因素。

綜上所述，基于自噬在GIOP中所發(fā)揮的積極作用，調(diào)控自噬可能是GIOP臨床治療的一個新靶點。然而自噬水平的調(diào)控仍需進一步探索研究。首先，自噬在調(diào)節(jié)骨細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)時，其有效性存在于一個狹窄而微妙的穩(wěn)態(tài)范圍內(nèi)。要利用自噬開展GIOP的治療研究，需要進一步精確調(diào)控在GC和治療藥物作用下，BMSCs、成骨細胞、骨細胞、破骨細胞的自噬水平，其中尤以成骨細胞和破骨細胞最為關(guān)鍵。其次，治療藥物的研究?？笹IOP一線藥物聯(lián)合自噬激活劑/抑制劑，或聯(lián)合基于自噬的調(diào)控劑，如Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w等抗凋亡蛋白，或caspase-3、caspase-9、Bax等凋亡相關(guān)蛋白的作用效果與時機需進一步明確。近年來，中醫(yī)藥防治GIOP取得了較大進展，明確自噬與中藥、方劑的關(guān)系及作用機制能夠為GIOP的治療提供新方向。