盧清俠， 李 偉， 金前躍， 郭振華， 馮麗麗， 邢云瑞， 柴書軍， 邢廣旭， 張改平

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室，河南鄭州 450002； 2.河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，河南鄭州 4500023；3.河南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)經(jīng)濟與信息研究所，河南鄭州 450002)

2016年以來，我國各地養(yǎng)鵝場相繼暴發(fā)了一種雛鵝全身性痛風疫病，經(jīng)病原分離鑒定，證實該疫病由鵝星狀病毒(goose astrovirus，GAstV)感染引起[1-2]。該病毒主要感染5～20日齡雛鵝，臨床癥狀表現(xiàn)為關節(jié)腫脹，解剖后可見腎臟與關節(jié)腔內有大量的白色尿酸鹽沉積[3]，發(fā)病率為70%～80%，死亡率最高可達50%，給我國養(yǎng)鵝業(yè)造成了重大經(jīng)濟損失[4-5]。目前市場上缺乏有效的疫苗與藥物，臨床上主要通過控制飼料中的蛋白含量進行預防控制?？焖贉蚀_診斷對于該病的臨床防控具有重要的指導作用，目前主要通過RT-PCR和ELISA等檢測方法來監(jiān)控病毒感染[6-8]，尚缺少適合現(xiàn)場操作的快速檢測技術。

GAstV是一種無囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組長度為6.8～7.9 kb，包括5′端非編碼區(qū)(5′-UTR)，3′端非編碼區(qū)(3′-UTR)，多聚腺苷酸(Poly A)尾巴和3個開放閱讀框(open reading frame，ORFs)，分別是：ORF1a、ORF1b、ORF2[9]。ORF1a編碼非結構蛋白，如核定位信號、絲氨酸蛋白酶等；ORF1b編碼RNA依賴性RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase，RdRp)；ORF2編碼的衣殼蛋白其中包含4個功能域：S、P1、P2和酸性C末端結構域( acidic C-terminal domain，ACTD)，其中P2結構域編碼的Spike蛋白，構成病毒表面的刺突結構，是GAstV的主要保護性抗原蛋白，可以誘導機體的免疫反應[10-11]。本研究通過原核表達系統(tǒng)獲得可溶性表達的截短Spike蛋白，制備出3株針對該蛋白的單克隆抗體，為建立有關GAstV 診斷方法提供了材料支持。

1 材料與方法

1.1 病毒、細胞和實驗動物

pET-28a-Spike重組質粒由河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室保存；GAstV XX株(GenBank登錄號：MN337323)由河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室分離、鑒定和保存；雞肝癌細胞系(LMH)由河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室保存；BALB/c雌鼠購自濟南朋悅實驗動物繁殖有限公司。

1.2 主要試劑

質粒小量提取試劑盒購自北京天根生物公司；Ex-Taq酶、 DL2000 marker購自北京寶日醫(yī)生物公司；Ni-NTA填料、His Trap excel預裝柱購自美國GE生物公司，HRP-His單克隆抗體、羊抗鼠 IgG-HRP、山羊抗鼠IgG Alexa Fluor 488、鼠源單克隆抗體亞型鑒定試劑盒購自武漢三鷹生物公司；ECL顯色液、胰蛋白酶、無血清細胞凍存液購自蘇州新賽美公司；1 mol/L的Tris-HCl(pH值7.5)、IPTG、彩虹180廣譜蛋白marker、AEC顯色液、單組分TMB顯色液、DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基購自北京索萊寶生物公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物公司；BL21(DE3)感受態(tài)細胞、澳洲胎牛血清購自北京全式金生物公司；HT、HAT、PEG-1500、弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑購自美國Sigma-Aldrich生物公司。

1.3 Spike蛋白的表達與純化

將構建好的pET-28a-Spike質粒轉化至BL21(DE3)感受態(tài)細胞，挑取單菌落轉至1 mL含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)。當D600 nm值為0.6～0.8時，分別加入終濃度為0.5 mmol/L、1 mmol/L IPTG，16 ℃誘導表達14～16 h 后，12 000 r/min 條件下離心10 min 棄去培養(yǎng)基，重懸菌體沉淀，冰上超聲破碎后再次離心，分別取上清與沉淀進行SDS-PAGE來檢測蛋白的表達情況。將超聲破碎后的菌液上清先用0.45 μm濾膜過濾，再用0.22 μm濾膜過濾，通過鎳柱系統(tǒng)進行蛋白純化，20 mmol/L咪唑緩沖液除去雜蛋白，100 mmol/L咪唑緩沖液洗脫并收集。將洗脫液轉入透析袋，置于10 mmol/L Tris-HCl緩沖液中，4 ℃ 條件下利用磁力攪拌器攪拌。每隔30 min換液，至少換5次后結束透析。

1.4 Spike蛋白的鑒定

利用SDS-PAGE、Western-blot鑒定純化后的蛋白，電泳結束后通過半干法轉膜，然后用5%脫脂奶37 ℃封閉1 h，1 ∶2 000稀釋的HRP-His單抗室溫孵育1 h，用PBST洗滌3次，每次5～8 min，最后滴加ECL超敏顯色液后凝膠成像儀顯色。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白濃度的測定，分裝后保存于-80 ℃冰箱。

1.5 Spike蛋白單克隆抗體的制備

1.5.1 小鼠免疫 按1 ∶1的比例將Spike蛋白與弗氏完全佐劑乳化后，以200 μL/只(蛋白含量 30 μg)劑量皮下多點注射BALB/c小鼠，同時對照組的小鼠注射等體積的無菌PBS。2周后，按相同的比例、劑量與弗氏不完全佐劑充分乳化后進行二次免疫，之后每隔2周免疫1次小鼠，共免4次。在四免2周后通過斷尾采血法收集10 μL血液加到 190 μL 的PBS中，5 000g離心8 min左右，吸取血清，利用ELISA方法檢測小鼠血清效價。在融合前3 d，以50 μg/只的蛋白劑量腹腔注射到小鼠體內。

1.5.2 間接ELISA方法 用CBS溶液將Spike蛋白稀釋為2.5 μg/mL轉入酶標板(100 μL/孔)后 37 ℃ 包被2 h，再用5%脫脂奶于37 ℃封閉1 h，小鼠的陰性、陽性血清倍比稀釋后作為一抗，二抗為 1 ∶2 000 稀釋的羊抗鼠IgG-HRP，PBST洗滌3～4次，經(jīng)TMB顯色后加入終止液，最后利用酶標儀讀取各稀釋度D450 nm值，當陽性血清D450 nm/陰性血清D450 nm>2.1所對應的最大稀釋倍數(shù)為小鼠的抗體效價。

1.5.3 細胞融合與篩選 用PEG-1500將對數(shù)生長期的骨髓瘤細胞與脾細胞按一定比例進行融合，待雜交瘤細胞密度達到孔底面積1/3左右時，吸取細胞上清通過ELISA進行初步篩選，并將相同載體的不同蛋白包板，利用ELISA進行反篩來排除針對His標簽的假陽性雜交瘤細胞株。借助有限稀釋法對陽性雜交瘤細胞進行2次亞克隆，通過ELISA、IPMA方法篩選出陽性單克隆細胞，置于液氮中凍存。

1.5.4 腹水制備 提前2周向BALB/c小鼠腹腔內注射500 μL滅菌石蠟致敏，將PBS重懸的4×106個陽性單克隆細胞注射到小鼠腹腔，7 d左右觀察到小鼠腹部明顯膨脹，采集腹水，5 000 r/min 離心10 min吸取上清，-40 ℃保存。

1.6 單克隆抗體的鑒定

1.6.1 Western-blot鑒定 Spike蛋白進行SDS-PAGE后轉膜進行分析，將按1 ∶500稀釋的小鼠腹水作為一抗，室溫孵育1 h，以1 ∶1 000稀釋的羊抗鼠IgG-HRP作為二抗，室溫孵育1 h，最后滴加ECL顯色液，并在凝膠成像儀中成像。

1.6.2 IFA鑒定 將LMH細胞經(jīng)胰酶消化后，以每孔100 μL細胞轉入96孔板，待細胞密度達到80%左右時，用無血清DMEM/F12(含1 μg/mL胰酶)將GAstV稀釋100倍后接種到LMH細胞上，37 ℃ 培養(yǎng)2 h后，更換2%FBS-DMEM/F12維持液(含1 μg/mL胰酶)繼續(xù)培養(yǎng)36 h。用預冷的甲醇固定20 min后，5%脫脂奶37 ℃溫箱封閉1 h，一抗為1 ∶300稀釋的腹水，二抗為1 ∶500稀釋的山羊抗鼠IgG Alexa Fluor 488，經(jīng)DAPI染核后，在熒光顯微鏡下觀察并拍照保存。

1.6.3 效價與亞類的測定 通過ELISA方法測定單克隆抗體的效價，CBS溶液包被Spike蛋白，分別以2倍倍比稀釋的腹水作為一抗，羊抗鼠IgG-HRP作為二抗，最后利用酶標儀讀取各稀釋度D450 nm值。按照亞型鑒定試劑盒說明書進行單抗的亞類測定。

1.6.4 表位鑒定 利用肽掃描方式篩選單克隆抗體的抗原表位，根據(jù)GAstV XX株的截短Spike蛋白序列合成了15個氨基酸的25條重疊肽，重疊長度為7個氨基酸，所合成多肽的純度均大于95%。通過間接 ELISA 方法進行表位篩選，用CBS溶液將合成多肽稀釋成為濃度2.5 μg/mL后轉入酶標板(100 μL/孔)，每條多肽重復3個孔，4 ℃包被過夜或37 ℃包被2 h，以Spike 蛋白作為陽性對照，PBS作為陰性對照，用5%脫脂奶37 ℃溫箱封閉1 h，一抗為1 ∶500稀釋的3株單克隆抗體，1 ∶2 000稀釋的羊抗鼠IgG-HRP為二抗，根據(jù)酶標儀讀取D450 nm值鑒定單抗的抗原表位。通過Dot-blot方法進行表位鑒定，將1 μg合成肽點至硝化纖維素膜上，Spike蛋白為陽性對照，PBS為陰性對照，室溫干燥后5%脫脂奶37 ℃封閉1 h，將1：500稀釋的陽性血清單克隆抗體作為一抗，1 ∶2 000稀釋的羊抗鼠IgG-HRP為二抗，PBST洗滌4次，最后用ECL試劑顯影。

2 結果與分析

2.1 Spike蛋白的表達、純化與鑒定

SDS-PAGE結果顯示：IPTG誘導后，Spike蛋白在菌液上清中大量表達，1 mmol/L IPTG誘導表達的蛋白量比0.5 mmol/L 誘導表達的蛋白量高，故選擇1 mmol/L IPTG進行Spike蛋白的誘導表達(圖1)。

通過鎳離子親和層析純化Spike蛋白，20 mmol/L 咪唑緩沖液洗雜，100 mmol/L咪唑緩沖液洗脫目的蛋白。對純化后的Spike蛋白進行 SDS-PAGE、Western-blot鑒定， SDS-PAGE結果顯示純化的Spike蛋白大小正確，約為23 ku，且純度較高，大約為95%(圖2-A)。針對His標簽的單克隆抗體免疫印跡分析顯示，在大小為23 ku處出現(xiàn)了特異性的條帶(圖2-B)。進一步通過BCA蛋白定量試劑盒檢測，確定了獲得的純化蛋白濃度為1.5 mg/mL。

2.2 單克隆抗體的篩選

2.2.1 小鼠免疫及血清效價的測定 Spike蛋白與弗氏佐劑充分乳化后皮下多點注射BALB/c小鼠，四免后利用斷尾采集小鼠血清，通過ELISA方法檢測血清效價。因小鼠個體的差異，血清效價不同，與其他3只小鼠相比，1號小鼠效價較高，達到 1 ∶512 000，故選擇1號小鼠進行超免與細胞融合(圖3)。

2.2.2 陽性單克隆雜交瘤細胞的篩選 先利用ELISA方法初步篩選融合后的細胞，得到17孔陽性雜交瘤細胞，再將它們轉到48孔板，待細胞密度達70%左右，通過ELISA、IPMA方法進行復篩，得到8株雜交瘤細胞，并對其進行亞克隆，最終利用ELISA方法篩選出3株陽性單克隆雜交瘤細胞，分別命名為1A5、2B4和12E6。利用IPMA對3株陽性單克隆雜交瘤細胞進行進一步鑒定，以3株陽性單克隆雜交瘤細胞的上清分別作為一抗，二抗為1 ∶500稀釋的羊抗鼠IgG-HRP，AEC顯色后在倒置顯微鏡下觀察顯色結果，顯示2B4和12E6單克隆雜交瘤細胞的上清可以與GAstV發(fā)生特異性反應(圖4)。

2.3 單克隆抗體的鑒定

2.3.1 Western-blot鑒定 Spike蛋白進行SDS-PAGE后轉膜、封閉，再用5%脫脂奶將3株單克隆抗體(1 ∶500)分別稀釋后作為一抗，通過Western-blot鑒定其與Spike蛋白的反應性。3株單克隆抗體均與Spike蛋白反應，且反應性較強(圖5)。

2.3.2 IFA鑒定 利用間接免疫熒光實驗(IFA)鑒定單克隆抗體與GAstV的反應性，預冷甲醇將接種GAstV的LMH細胞板固定，以1 ∶300倍稀釋的3株單抗分別作為一抗，以多少倍稀釋的山羊抗鼠IgG Alexa Fluor 488作為二抗。結果顯示，與陰性和陽性血清比較，2B4、12E6與GAstV發(fā)生特異性反應(圖6)。

2.3.3 效價與亞型的鑒定 利用ELISA方法檢測3株單克隆抗體的效價：CBS溶液包被Spike蛋白，以2倍倍比稀釋的腹水作為一抗，3株單克隆抗體均與Spike蛋白反應性良好，并且效價均在 1 ∶25 600 以上(圖7-A)。利用亞型鑒定試劑盒測定3株單克隆抗體，根據(jù)D450 nm值判定單抗亞型，結果顯示12E6 、 2B4單抗為IgG2b亞類，1A5單抗為 IgG2a亞類；3株單抗的輕鏈均為κ鏈(圖7-B)。

2.3.4 抗原表位的鑒定 利用多肽掃描方式篩選單克隆抗體的抗原表位，ELISA篩選的結果表明，單克隆抗體1A5識別的表位為：(EP16)ELRNRLNIADGDYVI；單克隆抗體2B4和12E6識別的表位為：(EP21)AGDSNPGETFQNFKM；它們均為Spike蛋白上的線性B細胞表位(圖8-A)。利用Dot-blot方法對單克隆抗體進行進一步的表位鑒定，結果表明，與陽性血清對比，單克隆抗體1A5和2B4分別識別(EP16)ELRNRLNIADGDYVI和(EP21)AGDSNPGETFQNFKM，與ELISA鑒定結果一致(圖8-B)。

2.3.5 抗原表位的空間分布 利用SWISS-MODEL軟件以TAstV-2 Spike蛋白(PDB：3TS3)的晶體結構為模板進行同源建模，獲得Spike蛋白的三維結構，其以同源二聚體形式存在(圖9-A)。

之后使用PYMOL軟件繪制B細胞表位EP16，EP21在Spike蛋白結構上的位置。由圖9-B可見，抗原表位(EP16)ELRNRLNIADGDYVI位于Spike蛋白結構的側面(紅色)，而抗原表位(EP21)AGDSNPGETFQNFKM位于 Spike蛋白單體的頂部(黃色)。

3 討論

鵝星狀病毒主要感染雛鵝，其特征為痛風、腎臟出血和腫脹，發(fā)病率較高。據(jù)統(tǒng)計，該病已經(jīng)造成12億～15億元的經(jīng)濟損失。常規(guī)的PCR檢測方法受環(huán)境、技術的限制，在養(yǎng)鵝企業(yè)很難得到應用，因此建立快速、簡便的GAstV抗原診斷技術對于該病的防控十分重要[12]。而基于單克隆抗體的膠體金免疫層析檢測技術具有快速、簡便、不依賴任何設備的特點，同時具有良好的特異性和敏感性，非常適合疫病的現(xiàn)場即時檢測[13，14]。在本研究中，我們制備了3株針對Spike蛋白的特異性單克隆抗體，為后期研發(fā)針對GAstV的膠體金試紙條等抗原檢測方法提供了材料。

線性B細胞表位可以為疫苗設計和診斷方法開發(fā)提供潛在候選位點[15]。Ren等制備了針對 His-P2-ACTD 蛋白的單克隆抗體，并鑒定出3個線性表位，首次開發(fā)了基于單抗的夾心ELISA方法用于檢測GAstV。Xu等利用水稻胚乳表達的豬瘟病毒(CSFV) E2蛋白免疫小鼠，獲得了相應的單克隆抗體，發(fā)現(xiàn)其中2株具有中和活性，鑒定出的表位P33能夠區(qū)分豬瘟病毒抗體與牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)抗體，并為新疫苗的設計和鑒別診斷提供了理想的候選肽[16]。本研究鑒定出2條線性抗原表位，為GAstV疫苗和診斷技術的開發(fā)奠定了基礎。

4 結論

本研究通過小鼠免疫、融合，ELISA篩選，亞克隆以及 IPMA驗證成功制備了3株單克隆抗體，其中2株可以與病毒發(fā)生反應；并通過多肽掃描技術，鑒定出2條分布于Spike蛋白的抗原表位；為建立快速、簡便的GAstV檢測方法奠定了基礎。