代鵬飛, 楊 愷, 杜 艷, 劉淑敏

（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科 云南省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 云南省醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)臨床醫(yī)學(xué)研究中心, 云南 昆明 650032）

blaNDM-1 基因已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)存在于眾多動(dòng)物和周圍環(huán)境中, 其能進(jìn)行廣泛傳播的基礎(chǔ)是由于blaNDM-1 基因常位于可移動(dòng)遺傳元件上, 介導(dǎo)耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移, 在陰溝腸桿菌中, blaNDM-1基因常位于IncFⅡA 型質(zhì)粒中[1-2］。病原性細(xì)菌致病能力的強(qiáng)弱程度稱為毒力, 通常病原菌毒力越大, 其致病性就越強(qiáng), 若攜帶blaNDM-1 基因的可移動(dòng)遺傳元件轉(zhuǎn)移至毒力和適應(yīng)能力更強(qiáng)的菌株或存在固有耐藥性的菌株中, 將會(huì)對(duì)公共衛(wèi)生造成嚴(yán)重威脅, 這可能導(dǎo)致攜帶blaNDM-1 基因的細(xì)菌既具有高毒力, 又具有廣泛耐藥性。有研究[3］顯示：blaNDM-1 基因可能與細(xì)菌的毒力有關(guān)。然而關(guān)于blaNDM-1 基因?qū)﹃帨夏c桿菌毒力的影響目前尚不明確。本研究比較攜帶blaNDM-1 基因的陰溝腸桿菌T2 及其blaNDM-1 基因敲除菌株ΔT2 毒力的差異, 探討blaNDM-1 基因?qū)﹃帨夏c桿菌毒力的影響, 為進(jìn)一步論證blaNDM-1 基因是否有助于高毒力高耐藥菌株的形成提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、細(xì)胞、主要試劑和儀器

攜帶blaNDM-1 基因的陰溝腸桿菌T2 和blaNDM-1 基因敲除的陰溝腸桿菌ΔT2 均為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建和保存。小鼠巨噬細(xì)胞（RAW264.7 細(xì)胞）購自中國BNCC 公司。細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑購自以色列Biological Industries 公司, PCR 相關(guān)試劑購自北京博邁德生物科技有限公司。CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo Scientific 公司, IG603 二級(jí)生物安全柜購自美國Baker 公司, 恒溫?fù)u床和紫外分光光度計(jì)購自美國Thermo 公司, 麥康凱平板購自英國OXOID 公司, 細(xì)菌比濁儀購自法國梅里埃公司。

1.2 質(zhì)粒穩(wěn)定性檢測(cè)

將前期研究篩選得到的攜帶耐藥基因blaNDM-1 的陰溝腸桿菌T2（T2 組）、陰溝腸桿菌T2 blaNDM-1 基因敲除株（ΔT2 組） 和陰溝腸桿菌ATCC13047（ST 組）傳代200 次后, 首先進(jìn)行抗菌藥物敏感實(shí)驗(yàn), 并檢測(cè)是否攜帶blaNDM-1 基因, 據(jù)此判斷傳代過程中攜帶blaNDM-1 基因的質(zhì)粒是否丟失。

1.3 陰溝腸桿菌的生物學(xué)特性檢測(cè)

1.3.1 耐藥和毒力基因的擴(kuò)增 實(shí)驗(yàn)組為T2 和ΔT2 組, 對(duì)照組為ST 組。每組取1 株陰溝腸桿菌, PCR 法擴(kuò)增3 株陰溝腸桿菌攜帶的常見的碳青霉烯類耐藥基因和毒力基因, 引物序列參考文獻(xiàn)[4-7］, 并測(cè)序驗(yàn)證。

1.3.2 運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組菌落的運(yùn)動(dòng)直徑 3 株陰溝腸桿菌在LB 液體培養(yǎng)基中活化后, 吸取1 mL菌液于1 mL 無菌EP 管進(jìn)行離心, 棄上清, 加入無菌PBS 緩沖液重懸、離心, 之后采用無菌PBS 緩沖液調(diào)節(jié)濃度至0.5 麥?zhǔn)蠞岫?。制?.25% LB 半固體培養(yǎng)基（2.5 g·L-1）, 吸取2 μL 陰溝腸桿菌菌液接種于LB 半固體培養(yǎng)基上, 37 °C 培養(yǎng)過夜, 采用游標(biāo)卡尺測(cè)量菌落運(yùn)動(dòng)直徑, 重復(fù)4 次并記錄。

1.3.3 生物膜形成能力檢測(cè) 3 株陰溝腸桿菌在麥康凱平板復(fù)蘇后, 挑取單個(gè)菌落于LB 液體培養(yǎng)基中充分混勻作為陰性對(duì)照組（LB 組）, 待其生長至對(duì)數(shù)生長期, 將細(xì)菌濃度稀釋為1.5×108CFU·mL－1, 取100 μL 菌液加入至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中, 之后每孔加入150 μL LB 液體培養(yǎng)基, 將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 ℃培養(yǎng)箱靜置24 、48 和72 h。棄去上清液, 并采用無菌PBS 緩沖液清洗細(xì)胞培養(yǎng)板, 每孔加入0.2%結(jié)晶紫染色液250 μL, 染色30 min, 待完全干燥后每孔加入95%乙醇200 μL, 使其與生物膜結(jié)合的結(jié)晶紫完全溶解。參照COSMO ANDRADE 等[8］的方法采用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長600 nm 處的吸光度（A）值, 以生物膜A 值代表生物膜形成能力, 實(shí)驗(yàn)重復(fù)6 次并記錄。

1.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.4.1 黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組黏附細(xì)菌量 分別選取各組陰溝腸桿菌進(jìn)行復(fù)蘇和傳代培養(yǎng)后, 分別感染RAW264.7 細(xì) 胞, 感 染 復(fù) 數(shù) （multiplicity of infection , MOI） 為100, 置 于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3 和24 h, 加入胰酶和細(xì)胞裂解液充分裂解細(xì)胞和消化細(xì)胞。各取100 μL 稀釋液均勻涂布于哥倫比亞血平板上, 于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。計(jì)數(shù)細(xì)菌量作為黏附細(xì)菌量, 重復(fù)3 次并記錄。

1.4.2 侵襲實(shí)驗(yàn) 與上述“1.4.1”中“黏附實(shí)驗(yàn)”步驟相同, 分別感染RAW264.7 細(xì)胞（MOI=100）, 37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3 和24 h。3 h 后直接每孔加入100 mg·L－1慶大霉素溶液, 繼續(xù)培養(yǎng)2 h 后, 每孔加入200 μL 胰酶消化細(xì)胞3～10 min, 吸棄胰酶, 于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。計(jì)數(shù)細(xì)菌量作為侵入細(xì)胞的菌量, 重復(fù)3 次并記錄。計(jì)算3 和24 h 時(shí)黏附率和侵襲黏附比, 反映耐藥基因blaNDM-1 對(duì)陰溝腸桿菌黏附和侵襲能力的影響。細(xì)胞黏附率=（黏附細(xì)菌數(shù)/感染細(xì)菌數(shù)）×100%；侵襲黏附比=侵入細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)/黏附細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組菌落直徑、A 值、細(xì)胞黏附率和侵襲黏附比以±s表示, 細(xì)胞黏附率組間比較采用χ2檢驗(yàn), 其他指標(biāo)組間比較Kruskal-WallisU檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)粒穩(wěn)定性

傳代200 次后, T2 仍攜帶blaNDM-1 基因, ΔT2 和ATCC13047 不攜帶blaNDM-1 基因, 表明攜帶blaNDM-1 基因的質(zhì)粒未丟失, 穩(wěn)定存在。見圖1。

圖1 PCR 法鑒定各組陰溝腸桿菌中的耐藥基因blaNDM-1 表達(dá)Fig.1 Expressions of drug resistance gene blaNDM-1 in Enterobacter cloacae in various groups identified by PCR method

2.2 各組陰溝腸桿菌的生物學(xué)特性

2.2.1 各組陰溝腸桿菌的耐藥基因和毒力基因

T2 組陰溝腸桿菌僅攜帶碳青霉烯類耐藥基因blaNDM-1, 其他碳青霉烯類耐藥基因blaKPC-2、blaIMP-4、 blaVIM-1 和 blaOXA-48 均 為 陰 性, ΔT2 和ST 組所檢測(cè)的5 種碳青霉烯類耐藥基因均為陰性；T2 與ΔT2 組陰溝腸桿菌攜帶相同的毒力基因clpB、icmf 和acrA, 其他毒力基因VasD/Lip、wcam、fimH、mrkD、mrkB 和csgB 均為陰性, ST 組陰溝腸桿菌中毒力基因clpB、icmf、acrA、VasD/Lip 和wcam 為陽性, 未檢測(cè)出fimH、mrkD、mrkB 和csgB。

2.2.2 各組菌落的運(yùn)動(dòng)直徑 T2 組菌落的運(yùn)動(dòng)直徑為（0.785±0.127） cm, ΔT2 組菌落的運(yùn)動(dòng)直徑為（1.445±0.255） cm, ATCC13047 組菌落的運(yùn)動(dòng)直徑為（1.370±0.270） cm, T2 組菌落運(yùn)動(dòng)直徑小于ΔT2 和ST 組（P＜0.05）。

2.2.3 各組陰溝腸桿菌生物膜形成能力 在3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)（24、48 和72 h）, T2 與ΔT2 組陰溝腸桿菌生物膜A 值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）, 但T2、ΔT2 和ST 組陰溝腸桿菌生物膜A 值均高于LB 組（P＜0.05）。見表1。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組陰溝腸桿菌生物膜A 值Tab. 1 A values of biofilm of Enterobacter cloacae in various groups at different time points (n=6,±s)

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組陰溝腸桿菌生物膜A 值Tab. 1 A values of biofilm of Enterobacter cloacae in various groups at different time points (n=6,±s)

*P＜0.05 vs LB group.

Group A value 72 0.092±0.007 0.145±0.009*0.153±0.016*0.193±0.018*48 0.097±0.005 0.141±0.017*0.151±0.012*0.170±0.013*（t/h）24 0.091±0.003 0.117±0.005*0.118±0.007*0.148±0.016*LB T2 ΔT2 ST

2.3 各組黏附細(xì)菌量

在陰溝腸桿菌與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)3 h 后, ΔT2組 黏 附 細(xì) 菌 量 分 別 為21×104、34×104和26×104CFU, 黏附比平均值為0.003；T2 組黏附細(xì)菌量分別為37×104、25×104和32×104CFU, 黏附比平均值為0.003；ST 組黏附細(xì)菌量分別為46×104、38×104和41×104CFU, 黏 附 比 平 均 值 為0.004。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示：ΔT2 組與ST 組黏附細(xì)菌量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.019）, 但其他各組黏附細(xì)菌量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在陰溝腸桿菌與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)3 h后, ΔT2 組侵襲RAW264.7 細(xì)胞的細(xì)菌量分別為150、 250 和350 CFU, 侵 襲 黏 附 比 平 均 值 為0.001；T2 組侵襲RAW264.7 細(xì)胞的細(xì)菌量分別為300、350 和350 CFU, 侵襲黏附比平均值為0.001；ΔT2 組RAW264.7 細(xì)胞的侵襲黏附比高于ST 組（P＜0.05）；共培養(yǎng)24 h 后, T2 組和ΔT2 組RAW264.7 細(xì)胞的黏附率和侵襲黏附比低于ST 組（P＜0.05）。見表2。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)各組RAW264.7 細(xì)胞黏附率和侵襲黏附比Tab.2 Adhesion rates and invasion adhesion ratios of RAW264.7 cells in various groups at different time points(n=6,±s)

表2 不同時(shí)間點(diǎn)各組RAW264.7 細(xì)胞黏附率和侵襲黏附比Tab.2 Adhesion rates and invasion adhesion ratios of RAW264.7 cells in various groups at different time points(n=6,±s)

*P＜0.05 vs ST group.

Group Adhesion rate (η/%)（t/h）3 0.004 0±0.000 0 0.003 0±0.001 0 0.027 0±0.001 0*24 1.770 0±0.010 0 1.490 0±0.110 0*1.420 0±0.020 0*ST T2 ΔT2 Invasion adhesion ratio（t/h）3 0.000 9±0.005 0 0.001 1±0.003 0 0.000 9±0.004 0 24-2.900 0±0.170 0-2.350 0±0.330 0*-2.250 0±0.050 0*

3 討 論

陰溝腸桿菌是一種革蘭陰性桿菌, 廣泛存在于自然界中, 在人和動(dòng)物的糞便水、泥土和植物中可檢出, 是腸道正常菌種之一, 可引起多種感染, 并常導(dǎo)致新生兒院內(nèi)感染的暴發(fā)流行[9］。碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌逐漸增多[10］, 隨著頭孢菌素的廣泛使用, 陰溝腸桿菌已成為醫(yī)院感染越來越重要的病原菌, 其引起的細(xì)菌感染性疾病常累及多個(gè)器官, 包括皮膚軟組織感染、泌尿道感染、呼吸道感染和敗血癥等。由于陰溝腸桿菌的β-內(nèi)酰胺酶和頭孢菌素酶耐藥情況嚴(yán)重, 給臨床治療帶來了新的挑戰(zhàn)。有研究[11-12］顯示：在國內(nèi)碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌以產(chǎn)NDM-1 為主, 其載體質(zhì)粒一般為IncX3、 IncFⅡ和IncC 型, 因此迫切需要尋找除替加環(huán)素、多黏菌素和磷霉素以外的能治療產(chǎn)NDM-1 細(xì)菌引起感染的新型藥物。與碳青霉烯類敏感腸桿菌目細(xì)菌感染引起的低死亡率比較, 由產(chǎn)NDM-1 的腸桿菌目細(xì)菌引起感染的死亡率通常更高[13-15］。另外, 有研究[17］顯示：blaNDM-1 基因不僅會(huì)賦予細(xì)菌相應(yīng)的耐藥性, 還能增加細(xì)菌的毒力, 這可能其與六型分泌系統(tǒng)（type Ⅵsecretion system, T6SS）有關(guān)。這可能促使高毒力高耐藥菌株的形成, 因此本研究旨在細(xì)胞水平探討blaNDM-1 基因?qū)﹃帨夏c桿菌毒力的影響, 有望助力臨床感染防控。

碳青霉烯類耐藥基因檢測(cè)結(jié)果表明：T2 組陰溝腸桿菌僅攜帶blaNDM-1 基因, ΔT2 組和ST 組所檢測(cè)的5 種碳青霉烯類耐藥基因均為陰性, 說明blaNDM-1 基因敲除株構(gòu)建成功, 同時(shí)排除了其他耐藥基因?qū)Χ玖Ρ硇偷挠绊?。毒力基因檢測(cè)結(jié)果表明：T2 與ΔT2 組陰溝腸桿菌攜帶相同的毒力基因clpB、icmf 和acrA, 其他檢測(cè)的毒力基因均為陰性, 表明blaNDM-1 基因可能并不影響陰溝腸桿菌毒力基因的表達(dá)。

本研究中菌落運(yùn)動(dòng)直徑檢測(cè)結(jié)果顯示：攜帶blaNDM-1 基因會(huì)減弱陰溝腸桿菌的運(yùn)動(dòng)能力, 這與HUANG 等[18］的研究結(jié)果一致, 即blaNDM-1基因會(huì)影響細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力, 其作用機(jī)制可能是攜帶blaNDM-1 基因的質(zhì)粒IncX3 所攜帶的HNS 基因可以影響細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)[19］。生物膜形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：blaNDM-1 不影響陰溝腸桿菌生物膜的形成, 且T2 和ΔT2 的生物膜形成能力均弱于ST 組, 這與LEE 等[20］和CUSUMANO 等[21］的 結(jié) 論 一 致, 可能是由于生物膜形成和抗菌藥物耐藥性之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。余艷[22］研究顯示：blaNDM-1 對(duì)生物的形成無影響。因此blaNDM-1 基因?qū)ι飳W(xué)特性的影響為減弱陰溝腸桿菌的運(yùn)動(dòng)直徑, 但不影響生物膜的形成。

本研究結(jié)果表明：blaNDM-1 基因不影響陰溝腸桿菌對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7 的毒力作用, ΔT2與ST 組檢出毒力基因差異可能是由于ST 株攜帶的其他毒力基因（clpB、icmf、acrA、VasD/Lip 和wcam） 引起的, 表明blaNDM-1 基因不影響其在巨噬細(xì)胞中的生存。這與G?TTIG 等[23］的研究結(jié)果一致, 表明耐藥基因blaNDM-1 并不影響陰溝腸桿菌的毒力。

綜上所述, blaNDM-1 基因可減弱陰溝腸桿菌的運(yùn)動(dòng)能力, 但對(duì)其生物膜形成能力及小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 的黏附和侵襲能力無影響, 表明blaNDM-1 基因?qū)﹃帨夏c桿菌的毒力無影響, 為blaNDM-1 基因是否增加或減弱細(xì)菌毒力的研究提供了依據(jù)。