石麗麗， 李 婷， 李昊澤， 曹學麗

(北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心/北京工商大學 輕工科學技術學院， 北京 100048)

調(diào)制乳是以不低于80%的生牛(羊)乳或復原乳為主要原料，添加其他原料或食品添加劑或營養(yǎng)強化劑，采用適當?shù)臍⒕驕缇裙に囍瞥傻囊后w產(chǎn)品[1]。調(diào)制乳中含有脂肪、蛋白質(zhì)、乳糖、灰分，還有一些礦物質(zhì)、維生素、天然的酶類等，還可以強化部分營養(yǎng)物質(zhì)，例如鈣、鐵、鋅和維生素D等，使其含量高于純牛奶產(chǎn)品，滿足不同人群的多樣化需求。同時香精的加入也為產(chǎn)品賦予了不同風味，市面上比較常見的是香蕉風味、巧克力風味和草莓風味的調(diào)制乳。

食品用香精是指由食品用香料與食品用香精輔料組成的用來起香味作用的濃縮調(diào)配混合物[2]。香料，是一種能被嗅感嗅出氣味或味感品出香味的物質(zhì)，是用以調(diào)制香精的原料，分為天然香料和人造香料。香精在調(diào)制乳中使用普遍，可起到提供、補充、穩(wěn)定風味的作用[3]，我國乳制品中香精的使用依據(jù)GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》進行，可按生產(chǎn)需要適量添加，并無限量規(guī)定。由于其使用具有“自我限量”的特性，用量較低[4]，其安全性經(jīng)常被人們忽視。但是也有大量研究表明，一些香精成分如果大量使用或接觸是存在安全風險的[5-11]。

香精在調(diào)制乳中的添加情況十分普遍，除了奶味香精外，各種果味香精及其他多種香精的使用構成眾多風味的調(diào)制乳。但是目前關于調(diào)制乳中香精成分的含量及其安全性關注較少。前期本實驗室通過對我國乳制品中常用香精的組成成分進行分析，依據(jù)毒理學數(shù)據(jù)、檢出率及相對含量，共篩選出19種香精關注成分[12]。本研究首先采用SPME- GC- MS/MS(MRM)法對市售調(diào)制乳樣品中的19種香精關注成分的含量進行了大樣本量分析，然后基于對于不同人群調(diào)制乳日攝入量的調(diào)查結果，對其暴露水平和安全風險進行了評估。希望該研究對于了解我國調(diào)制乳中香精的使用現(xiàn)狀具有一定參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

調(diào)制乳中19種香精關注成分：反-2-已烯醛、己酸烯丙酯、芳樟醇、4-萜烯醇和菠蘿酯的質(zhì)量分數(shù)大于98.0%，2,3-丁二酮、乳酸乙酯、麥芽酚、乙基麥芽酚、鄰氨基苯甲酸甲酯、香蘭素和苯甲酸芐酯的質(zhì)量分數(shù)大于99.0%，正己醇、苯甲醛、苯甲酸乙酯、乙酸芐酯、苯甲醇、苯乙醇和丁香酚的質(zhì)量分數(shù)大于99.5%，阿拉丁試劑(上海)有限公司。

乙醇(質(zhì)量分數(shù)大于等于99.8%)，阿拉丁試劑(上海)有限公司。

通過市場和網(wǎng)購的方式采購了25種乳制品品牌的共100個調(diào)制乳樣品。

1.2 儀器與設備

PC- 420D型固相微萃取平臺，美國Corning公司；7890B- 7000C型氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國Agilent科技有限公司；50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)型萃取纖維頭，美國Supelco公司；電子分析天平，DENVER公司。

1.3 實驗方法

1.3.1調(diào)制乳中香精關注成分的定量分析方法

1.3.1.1 標準溶液和基質(zhì)標準樣品的配制

取19種香精關注成分標準樣品分別用乙醇配制成一定濃度的單體標準溶液，然后再配制成混合標準溶液，逐級稀釋后，置于冰箱4 ℃貯存?zhèn)溆?。分析前，取一定體積的不同濃度的混合標準溶液，以一個本底干凈的不添加任何其他物質(zhì)的生牛乳樣品作為空白基質(zhì)，制備系列含基質(zhì)標準樣品。該生牛乳樣品經(jīng)SPME- GC- MS/MS(MRM)檢測，除含有少量的2,3-丁二酮和苯甲醛外，不含有其他目標成分。少量的兩種成分在做標準曲線和加標回收率計算時進行了折算。

1.3.1.2 樣品前處理方法

取1 g乳樣品，加4 g純凈水于15 mL頂空瓶內(nèi)，加入磁力攪拌轉子，旋緊裝有聚四氟乙烯/聚硅氧烷(PTFE/Silicone)蓋墊的螺紋蓋，置于固相微萃取平臺上。設置萃取溫度為60 ℃，轉速為400 r/min，預熱攪拌平衡10 min；插入老化好的萃取頭，并保證纖維頭萃取部分距離液面1.5 cm；萃取50 min后取出，立即插入GC進樣口(溫度250 ℃)，解析時間5 min。

1.3.1.3 GC- MS/MS分析條件

GC檢測方法。HP- INNOWAX型色譜柱(30 m×0.25 mm×0.5 μm)；載氣為高純氦氣(99.999%)；恒流模式，流速為1.0 mL/min；進樣口溫度為250 ℃；不分流進樣。升溫程序：初始溫度為50 ℃，保持5 min，以3 ℃/min 升至95 ℃，保持3 min，再以3 ℃/min升至150 ℃，最后以6 ℃/min升溫到230 ℃，保持10 min。

MS/MS檢測方法。電子轟擊離子源(EI源)；離子源溫度250 ℃；四極桿溫度150 ℃；輔助加熱區(qū)溫度250 ℃；電子能量70 eV；溶劑延遲5 min；質(zhì)譜掃描范圍(m/z)29～300 u；多反應監(jiān)測(MRM)模式下，19種香精關注成分的母、子離子對及碰撞電壓設置見表1。

表1 MRM模式下調(diào)制乳中19種香精關注成分質(zhì)譜分析參數(shù)設置

1.3.1.4 定量分析方法

采用外標法進行定量分析。不同濃度的生牛乳基質(zhì)標準樣品，采用SPME- GC- MS/MS(MRM)法進行分析，以平均峰面積為縱坐標，以樣品中香精關注成分的濃度為橫坐標，繪制19種成分的標準曲線。其中19種成分的濃度以實際樣品中的含量為參照而定。

1.3.2調(diào)制乳中香精關注成分的暴露水平評估方法

首先采用中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所通過問卷所得不同人群調(diào)制乳日攝入量的調(diào)查結果，調(diào)查人數(shù)2 121人，分兒童、女性組和男性組3組人群進行統(tǒng)計，分別得到全人群人均日調(diào)制乳攝入量和3個不同人群人均日調(diào)制乳攝入量。

按式(1)計算香精關注成分的人均日攝入量(per capita daily intake，PCI)。

PCI=F×w。

(1)

式(1)中，PCI為香精成分人均日攝入量，μg/(人·d)；F為人均調(diào)制乳日攝入量，kg/(人·d)；w為香精成分測得的質(zhì)量分數(shù)，μg/kg。

1.3.3調(diào)制乳中香精關注成分的安全風險評估方法

在暴露水平評估基礎上，依據(jù)毒理學關注閾值(threshold of toxicological concern，TTC)進行安全風險評價。TTC是將各物質(zhì)通過化學結構等進行評估和分類，共分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級，其對應3種不同的人體暴露閾值，分別為1 800、540、90 μg/(人·d)，當某個物質(zhì)的人體暴露量低于該物質(zhì)的閾值時，認為其可能產(chǎn)生的安全風險很低，無須對其進行安全性評價。該方法是FAO/WHO食品添加劑聯(lián)合專家委員會(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives，JECFA)、歐洲食品安全局(European Food Safety Authority，EFSA)、食品香料萃取物制造者協(xié)會(Flavour Extract Manufacturers’Association，F(xiàn)EMA)等機構均采用的安全性評估方法[13-15]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

調(diào)制乳樣品的分析中，每個樣品重復分析3次，采用Microsoft Excel進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。

2 結果與分析

2.1 方法學評價結果

表2給出了調(diào)制乳中19種香精關注成分的線性方程、線性范圍、相關系數(shù)(R2)、定性檢測限(LOD，3倍信噪比)、定量檢測限(LOQ，10倍信噪比)、日內(nèi)精密度(1 d之內(nèi)連續(xù)3次進樣的相對標準偏差)和日間精密度(連續(xù)3 d測定的相對標準偏差)。結果表明：19種關注成分在相應質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系(R2≥0.990 1)，日內(nèi)精密度小于等于9.03%，日間精密度小于等于9.90%。

表2 SPME- GC- MS/MS(MRM)法分析調(diào)制乳中19種香精關注成分的線性范圍、檢測限和精密度

以生牛乳樣品為基質(zhì)進行加標回收實驗，向樣品中分別添加3個不同濃度梯度的混合標準溶液(低、中、高濃度范圍)，進行加標回收率測定，結果見表3。方法平均回收率在86.48%～109.74%，平均相對標準偏差(RSD)在4.41%～8.55%。方法學驗證結果基本滿足定量分析要求，說明利用SPME- GC- MS/MS(MRM)法對調(diào)制乳中香精關注成分進行定量分析是可靠的。

表3 SPME- GC- MS/MS(MRM)法分析調(diào)制乳中19種香精關注成分的加標回收率

續(xù)表3

2.2 調(diào)制乳中香精關注成分的定量分析結果

圖1展示了SPME- GC- MS/MS(MRM)法分析調(diào)制乳中19種香精關注成分混合標準樣品和某調(diào)制乳樣品的總離子流色譜圖。對25個品牌100個調(diào)制乳樣品中的19種香精關注成分的定量分析統(tǒng)計結果見表4。

表4 100個市售調(diào)制乳樣品中19種香精關注成分的含量

圖中峰編號同表1。

通過對定量分析結果的統(tǒng)計分析可知：

1)19種關注成分中，檢出率最高的是苯甲醛和2,3-丁二酮，分別為100%和96%。苯甲醛和2,3-丁二酮是牛(羊)乳本身就含有的成分，在本研究中雖然無法分辨是本身含有還是后期添加或產(chǎn)生的，但與一些不加食用香精的純牛奶樣品相比，調(diào)制乳中這兩個物質(zhì)的含量要遠高于純牛奶。其次，檢出率大于80%的有2個：芳樟醇(88%)和正己醇(86%)。

2)19種關注成分中，平均含量大于1 000 μg/kg的關注成分有4個：香蘭素(18 886.03 μg/kg)、乙基麥芽酚(6 271.15 μg/kg)、麥芽酚(2 522.64 μg/kg)和苯甲醇(1 937.60 μg/kg)。其檢出率分別是47%、71%、40%和30%。

3)從定量分析結果的數(shù)值上能夠看出香精成分在不同的樣品中的含量差異很大，即使相同口味的樣品，不同品牌之間也存在很大的差異。同時發(fā)現(xiàn)，一些具有特征香氣的關注成分，在某些口味樣品中含量比較大，如苯甲醛在核桃口味的樣品中、己酸烯丙酯和菠蘿酯在香蕉和芒果口味的樣品中、苯乙醇在巧克力味的樣品中、丁香酚和乙酸芐酯在香蕉味樣品中、香蘭素在香草味和巧克力味樣品中含量較多。

2.3 調(diào)制乳中香精關注成分的暴露水平評估結果

表5為不同人群調(diào)制乳日攝入量問卷調(diào)查的統(tǒng)計結果，將其分為兒童、女性組和男性組3組人群進行統(tǒng)計。計算全人群人均每日調(diào)制乳攝入量為46.253 g，人均體重為60.233 kg。據(jù)此計算香精關注成分的全人群人均攝入量(PCI)見表6。同理，可以依據(jù)不同人群的人均調(diào)制乳攝入量，計算不同人群的PCI，表7列出了不同人群的最大PCI值。

表5 不同人群調(diào)制乳日消費量

表6 調(diào)制乳中19種香精關注成分全人群PCI及其與TTC的比較

2.4 調(diào)制乳中香精關注成分的安全風險評估結果

將全人群的人均日攝入量PCI與TTC作對比，見表6，其中超出數(shù)為超出TTC的個數(shù)，超出率為超出數(shù)除以檢出數(shù)，表6中加粗部分數(shù)據(jù)表示暴露量超出TTC。由表6可知，基于全人群人均每日調(diào)制乳攝入量為46.253 g進行評估，本研究中的100個調(diào)制乳樣品中的香精關注成分，按平均PCI計算均小于對應的毒理學關注閾值TTC，顯示無風險；按最大PCI計算，超出TTC的有4個，按超出率從高到低分別是乙基麥芽酚(16.90%)、香蘭素(12.77%)、麥芽酚(2.50%)和芳樟醇(1.44%)。

將不同人群的最大PCI[μg/(人·d)]與對應的TTC[μg/(人·d)]比較，見表7。表8統(tǒng)計出了幾種超出TTC的香精關注成分在各人群中的情況。苯甲醇僅在男性60歲以上的人群分組中有3.3%的超出率；芳樟醇和麥芽酚分別在一些人群中有超出，超出率低于10.0%；乙基麥芽酚和香蘭素在所有消費人群分組中均有超出情況，而且在男性60歲以上的消費人群中的超出率最高(39.4%和31.9%)。提示以各人群的平均調(diào)制乳攝入量計算，某些人群存在一定的風險，但是總體風險較低。

表7 調(diào)制乳中19種香精關注成分不同人群PCI及其與TTC的比較

表8 基于TTC的不同消費人群的安全性評價

3 結 論

本研究采用SPME- GC- MS/MS(MRM)法對25種品牌共100個調(diào)制乳樣品中的19種香精關注成分進行了定量分析，并依據(jù)毒理學關注閾值進行了安全風險評價。結果表明：19種關注成分中，檢出率最高的是苯甲醛和2,3-丁二酮，分別為100%和96%，其次是芳樟醇(88%)和正己醇(86%)。19種關注成分中，平均含量較高的有4種，分別是香蘭素(18 886.03 μg/kg)、乙基麥芽酚(6 271.15 μg/kg)、麥芽酚(2 522.64 μg/kg)、苯甲醇(1 937.60 μg/kg)，其檢出率分別是47%、71%、40%和30%。不同的樣品中的含量差異很大，相同口味不同品牌之間也存在很大的差異。基于毒理學關注閾值TTC的風險評估提示，按全人群的調(diào)制乳人均日攝入量計算PCI，香精關注成分的平均暴露水平PCI均小于對應的毒理學關注閾值TTC，最大PCI超出TTC情況的有4個，超出率從高到低分別是乙基麥芽酚(16.90%)、香蘭素(12.77%)、麥芽酚(2.50%)、芳樟醇(1.44%)。按不同人群的調(diào)制乳人均日攝入量，計算各人群的最大PCI，乙基麥芽酚和香蘭素在所有消費人群分組中均有超出情況，而且在男性60歲以上的消費人群中的超出率最高(39.4%和31.9%)，此外，麥芽酚、芳樟醇和苯甲醇在一定人群中也有超出TTC的情況。全人群和不同人群的暴露分析均顯示，存在一定的乙基麥芽酚和香蘭素暴露風險，不同人群的風險不同，但總體安全風險較低。此外，本文的研究是基于一定數(shù)量的市售產(chǎn)品和一定范圍的消費人群攝入量調(diào)查進行的，評價結果具有一定參考價值。