蘭可心 ，張學(xué)煒 ，鄭璐璐 ，王 敏 ，崔茂盛

（1.天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300380；2.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381）

近年來，隨著胚胎工程相關(guān)技術(shù)研究和應(yīng)用的不斷發(fā)展，研究者越來越需要數(shù)量更多的高質(zhì)量卵母細(xì)胞以滿足試驗(yàn)和科研需求。早期研究已表明，卵巢在其保存運(yùn)輸過程中的質(zhì)量對卵母細(xì)胞成熟和后期發(fā)育潛力具有重要影響。目前獲取卵巢的方式主要有體內(nèi)和體外兩種，體內(nèi)獲取操作復(fù)雜、成本高、耗時長、成功率低，而體外獲取主要是從屠宰場收集卵巢，該方法操作簡單、成本低、速度快、數(shù)量足。因此，體外卵巢已經(jīng)成為科研人員開展胚胎工程相關(guān)研究的主要獲取方式?，F(xiàn)實(shí)情況下，運(yùn)輸距離遠(yuǎn)、生豬養(yǎng)殖和屠宰區(qū)域限制等等原因往往導(dǎo)致卵巢從離體到送達(dá)實(shí)驗(yàn)室時間較長，這對卵巢保存技術(shù)提出了更高要求。Matías Nicolás Tellado、Pim Pra Par等報(bào)道，豬卵巢35℃保存條件下，隨著保存時間延長，卵泡液會因微環(huán)境酸化引起卵母細(xì)胞中毒，對體外成熟卵母細(xì)胞的氧化狀態(tài)和體外受精胚胎發(fā)育能力造成負(fù)面影響。Kamoshita K等將小鼠卵巢在不同溫度下保存24 h發(fā)現(xiàn)，保存在4℃條件下的卵巢組織結(jié)構(gòu)異常變化率顯著低于保存在14℃和37℃條件下的卵巢。上述前人實(shí)驗(yàn)表明，卵巢在體外保存過程中，不同溫度對卵巢保存效果具有較大影響，并進(jìn)一步影響著卵泡質(zhì)量和卵母細(xì)胞成熟及發(fā)育潛力。

然而，目前有關(guān)卵巢保存技術(shù)的研究報(bào)道不多，特別是不同溫度下對豬卵巢保存效果的探討。本研究綜合運(yùn)用免疫熒光染色、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和基因表達(dá)技術(shù)，深入探討了4℃下不同保存時間對豬卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量及發(fā)育潛力的影響。本研究結(jié)果對卵巢體外保存相關(guān)技術(shù)的理論研究和實(shí)踐操作均具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)所用卵巢從屠宰場獲取，設(shè)計(jì)了卵巢在4℃條件下保存6 h、18 h和24 h對卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量、氧化凋亡水平及相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的影響。本實(shí)驗(yàn)以0 h為對照組，每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2 試劑和藥品

M199（美國Gibco公司）；1×PBS（SolarBio）；DNA/RNA提取試劑盒（TACO）；mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒（TAKARA)；無特殊說明的情況下，細(xì)胞培養(yǎng)所需其他試劑均購自Sigma公司。

1.3 卵母細(xì)胞收集、體外成熟和孤雌培養(yǎng)

卵巢取自天津市某屠宰場，置于37℃裝有0.9%NaCl溶液（含青鏈霉素）的保溫瓶中，并于2 h內(nèi)運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室。用含0.1%青鏈霉素的PBS溶液清洗3～5次后放置到4℃恒溫箱中避光保存。每組15個卵巢，分別在保存0 h（對照組）、6 h、18 h和24 h后各取出3個卵巢用于以下實(shí)驗(yàn)研究。使用10 mL注射器，從卵巢表面抽取卵泡直徑大小為3.0～8.0 mm的透明卵泡。在體視顯微鏡下，使用口吸管挑出包裹3層以上卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞，放置于四孔板中，在39℃、5%CO2、完全濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行成熟培養(yǎng)44 h。44 h后使用透明質(zhì)酸酶脫掉透明帶外的卵母細(xì)胞，放入1 mm寬的激活儀融合槽，使用激活參數(shù)105V-30us-1次脈沖進(jìn)行激活。激活完成后移入PZM-3發(fā)育液進(jìn)行后續(xù)孤雌發(fā)育。

1.4 豬卵母細(xì)胞卵丘擴(kuò)展

體外培養(yǎng)44 h成熟后，使用倒置熒光顯微鏡（日本，Nikon）觀察并拍照COCs，檢測分析卵丘擴(kuò)展指數(shù)。卵丘擴(kuò)展指數(shù)（Cumulus Expansion Index，CEI）標(biāo)準(zhǔn)如下：0級：擴(kuò)展不連續(xù)；1級：擴(kuò)展1-2層；2級：呈放射狀，外層約一半擴(kuò)展；3級：除放射冠外全部擴(kuò)展；4級：全部擴(kuò)展；CEI=（0級COCs個數(shù)×0＋1級COCs個數(shù)×1＋2級COCs個數(shù)×2＋3級COCs個數(shù)×3＋4級COCs個數(shù)×4）總COCs個數(shù)。

1.5 卵母細(xì)胞ROS及DNA片段化水平檢測

將脫去卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞在0.1%PVA-PBS液中清洗3次后，進(jìn)行如下染色試驗(yàn)。 1）活性氧染色：卵母細(xì)胞在含有2′7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯熒光探針（碧云天，S0033S，1∶1 000）的0.1%PVA-PBS中于37℃條件下避光孵育15 min。然后在倒置熒光顯微鏡下選擇激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm的濾光片定性觀察胞質(zhì)內(nèi)活性氧含量。2）DNA片段化檢測：采用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行檢測（碧云天，C1086）；操作步驟：a.4%多聚甲醛室溫固定30 min，b.0.3%Triton X-100室溫通透5 min，c.熒光染液（熒光標(biāo)記液∶TdT酶=9∶1）37℃孵育60 min。孵育結(jié)束后用0.1%PVA-PBS充分去除多余染液，壓片。在倒置熒光顯微鏡下拍照，激發(fā)波長范圍為450～500 nm，發(fā)射波長范圍為515～565 nm（綠色熒光），實(shí)驗(yàn)全程避光。

1.6 卵丘細(xì)胞總抗氧化能力及脂質(zhì)氧化水平檢測

將挑出卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞離心后，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)?？偪寡趸芰z測：將卵丘細(xì)胞在冰浴充分震蕩裂解，通過測定Fe3+還原能力來測定（Solarbio，BC1315）。按照試劑盒說明配置標(biāo)準(zhǔn)溶液。樣品測定管：混合液180 μL、蒸餾水18 μL、細(xì)胞上清液6 μL。設(shè)置空白孔，室溫反應(yīng)10 min，放置酶標(biāo)儀內(nèi)，測定593 nm時的吸光值。脂質(zhì)氧化水平檢測：通過丙二醛（MDA）含量來反應(yīng)脂質(zhì)氧化水平（Solarbio，BC0025）。樣品檢測工作液配制：依次加入300 μL檢測工作液、100 μL樣本和100 μL試劑三。100℃水浴鍋孵育60 min后，立即放置冰盒上降至常溫。10 000 g，離心10 min。取上清200 μL放置96孔板中，測定在532 nm和600 nm的吸光度。每組樣本重復(fù)3次。

1.7 卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）基因mRNA表達(dá)水平

采用RT-qPCR技術(shù)，分析各組抗氧化基因（NRF-2、CAT、SOD）、凋亡基因（BAX）、抗凋亡基因（Bcl-2）、縫隙連接蛋白基因（CX37、CX 43、CX 45）的mRNA表達(dá)水平。引物序列見表1。使用全自動核酸提取試劑盒（TACO）提取COCs內(nèi)總RNA，將1 000 ng總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。RT-qPCR反應(yīng)設(shè)置95℃預(yù)變性3 min，95℃變性15 s；60℃退火30 s；72℃延伸30 s（39個循環(huán)），最后72℃延伸5 min，每個樣品每次設(shè)3個復(fù)孔。內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。

表1 引物序列

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

ROS水平及DNA片段化水平用熒光顯微鏡拍照片后使用Image J 180分析熒光強(qiáng)度。目的基因相對表達(dá)水平采用2-ΔΔct法計(jì)算。所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素ANOVA 分析，所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。P＜0.05 表示差異顯著。使用Graphpad Prism 9軟件繪圖。

2 結(jié)果分析

2.1 豬卵巢于4℃保存后對卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響

4℃保存豬卵巢對卵母細(xì)胞成熟及發(fā)育潛力如表2所示。

表2 4℃保存豬卵巢對卵母細(xì)胞成熟及發(fā)育潛力

表2總結(jié)了在4℃保存豬卵巢0 h、6 h、18 h及24 h后，體外成熟44 h對卵母細(xì)胞存活率及成熟率的影響。與對照組（0 h）相比，當(dāng)保存時間延長到6 h、18 h及24 h后其存活率及成熟率均顯著降低。隨著時間增加，未經(jīng)過保存0 h組的存活率及成熟率均顯著高于6 h組（96.51±0.07vs38.44±4.54；68.78±3.15vs6.00±1.76；P＜0.05），且前兩組也均高于18 h組和24 h組（26.89±2.78vs14.67±1.33；0.00±0.00vs0.00±0.00；P＜0.05）。各組之間存活率差異性顯著，而18 h組和24 h組成熟率無顯著差異（0.00±0.00vs0.00±0.00）。

由表3可知，將成熟卵母細(xì)胞孤雌激活后記錄孤雌卵裂率及囊胚率。對照組孤雌卵裂率及囊胚率顯著高于實(shí)驗(yàn)組（76.67±3.33），且隨著保存時間延長，各組卵裂率及囊胚率顯著降低。18 h組相對于6 h組卵裂率顯著降低（0.00±0.00vs3.33±3.33；P＜0.05），且與24 h組無顯著差異。6 h組囊胚率相對于對照組顯著降低（0.00±0.00vs26.67±3.33；P＜ 0.05），而與18 h和24 h組無顯著差異（0.00±0.00vs 0.00±0.00）。

表3 4℃保存豬卵巢對卵母細(xì)胞孤雌卵裂及囊胚數(shù)

2.2 豬卵巢于4℃保存對卵母細(xì)胞ROS含量及DNA片段化水平的影響

4℃保存對卵母細(xì)胞活性氧含量以及DNA片段化影響如圖1所示。

圖1 4℃保存對卵母細(xì)胞活性氧含量以及DNA片段化影響

使用免疫熒光染色來檢測卵母細(xì)胞內(nèi)活性氧及DNA片段化水平，以此反應(yīng)卵母細(xì)胞氧化和凋亡的程度?；钚匝鹾恳约癉NA片段化水平均隨著保存時間的延長逐漸升高。如圖2 A所示，0 h組、6 h組、18 h組及24 h組的活性氧含量均顯著升高（3.17±0.04vs9.06±0.41vs 11.99±0.36vs14.97±0.26；P＜0.05）。DNA片段化水平在0 h組、6 h組、18 h組顯著升高（0.09±0.07vs3.43±0.34vs 7.69±0.44；P＜0.05）。18 h組和24 h組之間無顯著差異（8.86±0.06，圖2B）。

2.3 豬卵巢于4℃對卵丘細(xì)胞擴(kuò)展指數(shù)、總抗氧化能力和丙二醛含量的影響

豬卵巢于4℃對卵丘細(xì)胞擴(kuò)展指數(shù)、總抗氧化能力和丙二醛含量的影響如圖2所示。

使用酶聯(lián)免疫檢測儀來檢測卵丘細(xì)胞內(nèi)T-AOC及MDA含量，以此反應(yīng)卵丘細(xì)胞總抗氧化能力和脂質(zhì)氧化（MDA）的程度。如圖2A所示，活性氧含量以及DNA片段化水平均隨著保存時間的延長逐漸升高。0 h組、6 h組、18 h組及24 h組的脂質(zhì)氧化含量均顯著升高（1.26±0.04 vs 1.26±0.04 vs 2.07±0.04vs2.20 ±0.01；P＜0.05）。相對于對照組，總抗氧化能力水平在6 h組、18 h組顯著升高（3.65±0.05vs2.53±0.02vs1.62±0.01；P＜0.05）。而18 h組和24 h組之間無顯著差異（1.52±0.00）。

圖2 A: 卵丘擴(kuò)展指數(shù) B: 總抗氧化能力 C: 丙二醛（MDA）含量

2.4 豬卵巢于4℃對卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

豬卵巢于4℃對卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響如圖3所示。

使用RT-PCR測定相關(guān)基因表達(dá)量，如圖3所示，與對照組相比，抗氧化基因CAT、SOD、NRF-2（圖3，A）、抗凋亡基因Bcl-2（圖3，C）、縫隙鏈接蛋白CX37、CX45、CX43（圖3，B），隨著時間延長，表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。而凋亡基因Bax表達(dá)量顯著上升（P＜0.05）。從Bcl-2/Bax比值可看出，隨著保存時間的延長逐漸降低，對照組顯著高于試驗(yàn)組，而6 h組和18 h組相對24 h組顯著升高，而組間無顯著差異。

圖3 A:抗氧化基因CAT、SOD、NRF-2的基因表達(dá)。B: 縫隙鏈接蛋白CX37、CX45、CX43的基因表達(dá)。C: 抗凋亡基因Bcl-2和凋亡基因Bax的基因表達(dá)。D: Bcl-2/Bax比值

3 討論

隨著以胚胎工程為核心的現(xiàn)代生物技術(shù)研究與應(yīng)用的發(fā)展，對高質(zhì)量卵子的需求量越來越大。作為卵母細(xì)胞的儲備器官及生長發(fā)育的組織，卵巢的獲取與保存運(yùn)輸也愈發(fā)重要。目前，國內(nèi)外開展的胚胎生物工程相關(guān)研究所需的卵巢大多都從豬屠宰場獲得。理論上說，這些從屠宰場獲得的離體卵巢越早送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，從其中獲得的卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量和后期發(fā)育潛力也越高。開展離體卵巢長時間高質(zhì)量保存相關(guān)技術(shù)研究，不僅可以為遠(yuǎn)距離、長時間運(yùn)輸卵巢提供技術(shù)支撐，也對動物種質(zhì)資源保護(hù)具有重要意義。

大量文獻(xiàn)資料顯示，從屠宰場獲得卵巢最好在2～4 h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。然而，由于道路交通、屠宰場距離以及當(dāng)?shù)厣i養(yǎng)殖與屠宰政策等等因素，往往導(dǎo)致卵巢到達(dá)實(shí)驗(yàn)室的時間較長。如果卵巢在運(yùn)輸過程中保存不當(dāng)，比如溫度過高、過低以及保存液pH變化等等，均可能造成保存過程中卵巢的一些異常變化，從而影響卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞的體外成熟質(zhì)量和胚胎發(fā)育潛力。目前有關(guān)卵巢保存技術(shù)的研究不多，缺乏對豬卵巢保存過程中的影響因素及其作用機(jī)理的探討。

本研究較為系統(tǒng)地探討了將豬卵巢在4℃保存不同時間后對卵母細(xì)胞質(zhì)量及卵丘細(xì)胞的氧化凋亡水平的影響，并從發(fā)育潛力、生化水平和相關(guān)抗氧化基因表達(dá)層面對其影響機(jī)理做了初步探討。大量實(shí)驗(yàn)室使用4℃來用作器官低溫保存的選擇，低溫能有效地減少組織代謝以及缺血造成的損傷；卵巢在4℃下長期保存可能會改變體外成熟過程中參與調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)的其他酶的活性。需要進(jìn)一步評估以提高對從冷藏卵巢中回收的卵母細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)的認(rèn)識?；谏鲜隼碚摶A(chǔ)，本研究選擇了4℃保存條件下，探討保存6 h、18 h和24 h對卵母細(xì)胞體外成熟、成熟質(zhì)量以及胚胎發(fā)育潛力的影響。本研究結(jié)果顯示，隨著保存時間的不斷延長，本實(shí)驗(yàn)中在4℃條件下保存的卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力、卵丘擴(kuò)展、總抗氧化能力、抗氧化基因CAT、NRF-2、SOD、抗凋亡基因Bcl-2、和縫隙鏈接蛋白CX37、CX45、CX43的mRNA表達(dá)水平也隨之降低，凋亡基因Bax顯著升高，與保存時間成正相關(guān)。當(dāng)保存時間達(dá)到6 h時，卵母細(xì)胞的存活率僅達(dá)到38.44%，而囊胚率僅為0%。有報(bào)道稱，豬卵巢離體后組織液的酸化是導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量低和后期發(fā)育能力差的原因之一。Luu Vien Viet等比較豬、牛、貓卵巢在4℃下貯藏5 d后的細(xì)胞核以及卵母細(xì)胞損傷的動力學(xué)變化，指出低溫保存顯著降低了成熟前的豬和牛生發(fā)囊泡期的卵母細(xì)胞的比例。當(dāng)4℃下保存時間超過24 h后，沒有豬卵母細(xì)胞達(dá)到第一次減數(shù)分裂的中期，與本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為一致。而也有一些不同的報(bào)道，如Anna Rita Piras等報(bào)道，家貓卵巢在4℃條件下保存24 h時，僅會降低部分卵巢腔前卵泡數(shù)量，隨著保存時間延長，卵巢內(nèi)卵泡結(jié)構(gòu)受損程度加重，并影響卵母細(xì)胞的氧化狀態(tài)及體外受精能力。在4℃保存條件下，該研究在家貓上的保存效果優(yōu)于本研究在豬上的保存效果，這可能與不同物種細(xì)胞對溫度敏感性差異有關(guān)。有報(bào)道指出，豬卵母細(xì)胞，特別是種質(zhì)細(xì)胞對低溫較為敏感，低溫變化更容易對豬卵母細(xì)胞和精子造成不可逆損傷。在不同動物上的研究結(jié)果也不盡一致，LinY-A等人對豬卵巢體外保存的研究結(jié)果表明，當(dāng)保存時間為8 h，其最佳保存溫度約為25℃。而Alicia Martín-Maestro等認(rèn)為，當(dāng)綿羊卵巢在30℃保存超過7 h時，卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量及發(fā)育潛力均大幅度降低。但王鋒等報(bào)道卻指出，用接近牛體溫39℃溫度保存6 h可以維持正常代謝水平，對卵巢的保存更有利。

本實(shí)驗(yàn)探討了卵巢在4℃保存條件下，保存時間為6 h、18 h及24 h時對豬卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞發(fā)育潛力及質(zhì)量水平的影響。并從體外成熟能力、胚胎發(fā)育潛力、抗氧化水平以及相關(guān)基因表達(dá)水平等不同層面對影響機(jī)理做了初步探討。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，保存溫度對卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞質(zhì)量有直接影響。當(dāng)豬在4℃保存時間長于6 h時，卵母細(xì)胞質(zhì)量嚴(yán)重下降。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為后人開展卵巢保存相關(guān)研究提供了有益的理論和實(shí)踐指導(dǎo)。

4 結(jié)論

本文研究了解了卵巢儲存對未成熟卵母細(xì)胞生理特征的影響。結(jié)果已經(jīng)證明，隨著保存時間的延長，在4℃保存豬卵巢對體外成熟的卵母細(xì)胞的氧化狀態(tài)及其發(fā)育能力產(chǎn)生負(fù)面影響，當(dāng)保存時間達(dá)到6 h時成熟率及囊胚率顯著降低。這些結(jié)果為冷藏對腔前卵泡卵母細(xì)胞的影響提供了額外的信息。需要新的策略來評估保存或挽救儲存的卵母細(xì)胞發(fā)育潛力的可能性，以成功生產(chǎn)高質(zhì)量胚胎。