王秀龍郭朝江劉志鈺朱兵峰張貴民

(1.魯南制藥集團股份有限公司,山東 臨沂 276000;2.魯南新時代生物技術(shù)有限公司,山東 費縣 273400)

醋酸卡泊芬凈是一種棘白菌素類抗真菌藥物,通過非競爭性抑制(1,3)-β-D葡聚糖的合成,引起細胞壁結(jié)構(gòu)破壞,最終致使菌體死亡[1]。在臨床上可用于治療念珠菌感染和念珠菌血癥,以及對其他治療無效或不能耐受的侵襲性曲霉菌病[2-3],醋酸卡泊芬凈對耐氟康唑和兩性霉素B的念珠菌屬均具有體外抗菌活性[4-5]。

在生產(chǎn)醋酸卡泊芬凈原料藥過程中可能會用到甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、二氯甲烷、四氫呋喃和乙酸乙酯等有機溶劑,根據(jù)《中國藥典》2020年版四部通則0861殘留溶劑測定法的規(guī)定,這7種有機溶劑的殘留量均有一定的限度。有文獻[6-7]報道二類溶劑甲醇、乙腈、二氯甲烷和四氫呋喃,三類溶劑乙醇、異丙醇和乙酸乙酯等溶劑的氣相測定方法,其中二氯甲烷由于限度低,常采用ECD檢測器檢測;在普通毛細管柱上,溶劑異丙醇、乙腈和丙酮等峰常在同一位置出峰,對檢測造成干擾。筆者采用Inert Cap 624毛細管色譜柱,研發(fā)了頂空分析方法，并使用該法對醋酸卡泊芬凈原料藥中可能殘留的7種溶劑進行研究,通過準確定量以更好地控制殘留溶劑,保證產(chǎn)品質(zhì)量可靠及人體用藥安全。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Nexis GC-2030氣相色譜儀、HS-20頂空進樣器,島津公司;XS105DR型電子天平,梅特勒-托利多儀器有限公司。

醋酸卡泊芬凈,魯南新時代生物技術(shù)有限公司,批號200201;甲醇、乙醇和乙腈,德國默克有限公司,色譜純;異丙醇,上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?色譜純;二氯甲烷,西格瑪奧德里奇有限公司,色譜純;乙酸乙酯和二甲基亞砜,德國默克有限公司,色譜純;四氫呋喃,南京化學(xué)試劑股份有限公司,分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件

采取程序升溫,初始溫度40 ℃,維持5 min,以20 ℃/min的升溫速率升至100 ℃,維持2 min;以80 ℃/min的升溫速率升至180 ℃,維持2 min;進樣口溫度為200 ℃;檢測器溫度為250 ℃;頂空瓶平衡溫度為80 ℃,平衡時間為30 min;載氣為高純氮氣,進樣量為1 mL。

1.2.2 對照品標準液配制

精密稱定甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯和四氫呋喃,置于10 mL容量瓶中,用二甲基亞砜溶解并稀釋,制成每1 mL中約含甲醇150 mg、乙醇250 mg、異丙醇250 mg、乙腈20.5 mg、二氯甲烷30 mg、乙酸乙酯250 mg、四氫呋喃36 mg的混合溶液,作為對照品標準液。

1.2.3 線性標準液配制

精密量取1.2.2節(jié)對照品標準液1 mL,置于50 mL容量瓶中,用二甲基亞砜稀釋至容量瓶刻度,搖勻,作為線性標準液。

1.2.4 待測樣品溶液配制

精密稱定醋酸卡泊芬凈200 mg,置于20 mL頂空瓶中,加入二甲基亞砜2 mL使之溶解,密封,作為待測樣品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 專 屬 性

2.1.1 空白溶劑

精密量取二甲基亞砜2 mL,置于20 mL頂空瓶中,密封,作為空白溶劑,按氣相色譜法測定。色譜圖如圖1所示。由圖1可知:空白溶劑色譜圖中7種殘留溶劑對應(yīng)的位置無干擾峰檢出,故不會干擾對本品中7種殘留溶劑的檢查。

圖1 空白溶劑色譜圖

2.1.2 殘留溶劑峰定位

精密量取1.2.2節(jié)對照品標準液1 mL,置于50 mL容量瓶中,用二甲基亞砜稀釋至容量瓶刻度,搖勻,作為殘留溶劑峰定位溶液。精密量取該溶液2 mL,置于20 mL頂空瓶中,密封,按氣相色譜法進行測定,色譜圖如圖2所示。由圖2可知:7種溶劑的峰形良好,各色譜峰之間的分離度均不小于1.5。

1—甲醇;2—乙醇;3—異丙醇;4—乙腈;5—二氯甲烷; 6—乙酸乙酯;7—四氫呋喃。

2.2 系統(tǒng)適用性實驗

精密量取1.2.2節(jié)對照品標準液1 mL,置于50 mL容量瓶中,用二甲基亞砜稀釋至容量瓶刻度,搖勻,作為系統(tǒng)適用性溶液。精密量取該溶液2 mL,置于20 mL頂空瓶中,密封,按氣相色譜法進行測定,結(jié)果見表1,其中理論板數(shù)、對稱因子和分離度的數(shù)據(jù)均來源于譜圖。由表1可知:7種溶劑色譜峰之間的分離度均大于1.5,峰面積的相對標準偏差RSD均小于1%,系統(tǒng)適用性良好。

表1 系統(tǒng)適用性實驗結(jié)果

2.3 檢測限與定量限

各取適量甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯和四氫呋喃,分別置于7個50 mL容量瓶中,分別加二甲基亞砜稀釋至容量瓶刻度。采用逐級稀釋法,取信噪比的10倍值和3倍值[8],按氣相色譜法進行測定,結(jié)果見表2。由表2可知:7種溶劑的檢測限為0.041～0.654 μg,定量限為0.182～1.744 μg。

表2 檢測限與定量限實驗結(jié)果

2.4 線性與范圍實驗

精密量取1.2.3節(jié)線性標準液0.5,1,2,4,5 mL,分別置于10 mL容量瓶中,用二甲基亞砜稀釋至容量瓶刻度,搖勻,作為線性濃度溶液。精密量取該溶液2 mL,置于20 mL頂空瓶中,密封,配制6份,按氣相色譜法進行測定。以峰面積y對濃度x建立線性回歸方程,結(jié)果見表3。由表3可知7種溶劑的線性關(guān)系均良好。

表3 線性與范圍實驗結(jié)果

2.5 精密度實驗

考察重復(fù)性和中間精密度:1) 精密量取2.2節(jié)系統(tǒng)適用性溶液2 mL,置于20 mL頂空瓶中,密封,配制6份,按氣相色譜法測定重復(fù)性并分別計算各色譜圖中7種溶劑峰的峰面積的RSD,結(jié)果見表4。2) 第1天分析員A分別精密量取2.2節(jié)系統(tǒng)適用性溶液2 mL,置于20 mL頂空瓶中,密封,配制6份,按氣相色譜法測定中間精密度。3) 第2天分析員B精密量取同一系統(tǒng)適用性溶液2 mL,置于20 mL頂空瓶中,密封,配制6份,按氣相色譜法測定中間精密度,分別計算各色譜圖中7種溶劑峰的峰面積的RSD,結(jié)果見表4。由表4可知:7種溶劑的重復(fù)性和中間精密度均良好。

表4 精密度實驗結(jié)果

2.6 回收率實驗

精密量取二甲基亞砜2 mL,置于20 mL頂空瓶中,作為空白溶液。分別精密量取1.2.2節(jié)對照品標準液0.8,1,1.2 mL,置于3個50 mL容量瓶中,加二甲基亞砜稀釋至容量瓶刻度,搖勻,作為回收率實驗溶液。分別精密量取2 mL實驗溶液,置于20 mL頂空瓶中,每個回收率實驗溶液各配制3份,密封,作為80%,100%和120%的供試品溶液。以100%的溶液作為對照品溶液,按氣相色譜法測定。按外標法分別計算7個溶劑的測得量并計算每個回收率的RSD,結(jié)果見表5。由表5可知筆者方法對7種溶劑均具有良好的回收率。

表5 回收率實驗結(jié)果

2.7 耐用性實驗

分別改變進樣口溫度±20 ℃、載氣流量±20%、頂空加熱平衡時間±5 min,采用同種方法進行測定。結(jié)果表明:測定結(jié)果沒有明顯差異,峰形和分離度均符合要求,表明筆者方法的耐用性良好。

2.8 樣品測定

精密量取系統(tǒng)適用性實驗項下的對照品溶液2 mL,置于20 mL頂空瓶中,密封,配制2份,按氣相色譜法測定。取本品約200 mg,精密稱定,置于20 mL頂空瓶中,加入二甲基亞砜2 mL,完全溶解后密封,配制2份,按氣相色譜法進行測定。按外標法分別計算7種溶劑的質(zhì)量分數(shù)[9-10],每個樣品測定2次并取平均值,結(jié)果見表6。由表6可知:筆者方法能準確地測定醋酸卡泊芬凈中的7種殘留溶劑,使其符合產(chǎn)品質(zhì)量標準以及藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范的要求[11]。

表6 樣品測定結(jié)果

2.9 討 論

2.9.1 色譜條件的選擇

筆者先后考察了Inert Cap WAX(30 m×0.32 mm×0.50 μm)柱和Inert Cap 624(30 m×0.32 mm×1.80 μm)柱,對比分析后筆者采用Inert Cap 624毛細管色譜柱。溶劑均不干擾各主成分峰的測定,7種殘留溶劑峰的保留時間均小于8 min,且各個溶劑峰之間的分離度良好。測試方案:起始溫度為40 ℃,保持5 min;以20 ℃/min升至100 ℃,保持2 min;以80 ℃/min升至180 ℃,保持2 min。筆者方案可滿足各主成分峰的測定要求。

2.9.2 頂空平衡溫度及時間的選擇

根據(jù)供試品中殘留溶劑的沸點選擇頂空平衡溫度,結(jié)果表明:當(dāng)平衡溫度為80 ℃,平衡時間為30 min時,各主成分峰的峰面積達到最大值。因此,選擇平衡溫度為80 ℃,平衡時間為30 min。

2.9.3 溶劑的選擇

以水、二甲基亞砜和N,N-二甲基甲酰胺作為溶劑進行考察,其中水與乙酸乙酯不互溶,N,N-二甲基甲酰胺溶解后的干擾峰較多,二甲基亞砜效果較好,因此確定以二甲基亞砜作為溶劑。

2.9.4 方法的確定

參考其他廠家和文獻[12]報道,醋酸卡泊芬凈原料藥中控制了甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯和四氫呋喃等5種溶劑,筆者結(jié)合所在廠家的工藝,增加了對二類溶劑二氯甲烷及三類溶劑異丙醇的控制,采用該法控制醋酸卡泊芬凈原料藥中的7種殘留溶劑,使筆者廠家的產(chǎn)品更加安全有效。

3 結(jié) 論

方法學(xué)驗證和樣品測定結(jié)果表明:筆者建立的頂空氣相色譜法測醋酸卡泊芬凈原料藥中7種殘留溶劑的方法,分離度良好,靈敏度高,操作簡便,能夠?qū)Υ姿峥ú捶覂粼纤幹械臍埩羧軇┻M行準確定量,可以更好地控制醋酸卡泊芬凈原料藥的產(chǎn)品質(zhì)量。