郭田甜,房兆營,劉震遠,張微,畢艷艷,孫艷,關永霞*
(1.魯南厚普制藥有限公司,山東 臨沂 276006;2.魯南制藥集團股份有限公司 中藥制藥共性技術國家重點實驗室,山東 臨沂 276006;3.魯南貝特制藥有限公司,山東 臨沂 276006)
當歸屬于傘形科植物,入肝、心、脾經(jīng),有補血活血、潤腸通便等功效[1]。當歸化學成分主要含有揮發(fā)油、有機酸類、多糖類、黃酮類等多種物質,而揮發(fā)油是當歸主要功效成分之一,含量約為1%[2-3]。揮發(fā)油大多由小分子物質組成,容易被機體快速吸收,大部分揮發(fā)油類具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌驅蟲及鎮(zhèn)痛等方面的藥理作用[4-5]。當前包含揮發(fā)油的中藥材廣泛,尤以傘形科[6]、唇形科[7]、菊科[8]、姜科[9]、蕓香科[10]等科含量較為豐富。近年來,含揮發(fā)油類的中藥材在保健、醫(yī)療、日用產(chǎn)品等方面的研究日益增多,展現(xiàn)出廣闊的應用前景。
揮發(fā)油提取方法一般分為有機溶劑萃取法[11]、超臨界萃取法[12]與水蒸氣蒸餾法[13]等,前兩種提取方法具有操作繁瑣、成本高、環(huán)境污染嚴重等缺點,而水蒸氣蒸餾法克服了以上問題,成為了提取方法研究熱點。齊巧明等[14]用水蒸氣蒸餾法提取艾葉揮發(fā)油并優(yōu)化了提取工藝,結果表明該法揮發(fā)油提取率高,操作方法可行,工藝參數(shù)穩(wěn)定。除此之外,大部分揮發(fā)油都具有抗氧化的藥理作用,當機體內自由基含量過高時,對機體內的核酸、蛋白質等產(chǎn)生破壞,加速機體代謝、衰老,而揮發(fā)油能夠有效清除體內自由基類物質,有益于維持身體健康[15]。目前,當歸藥材的研究主要集中在栽培種植和藥理作用方面,但對當歸揮發(fā)油的抗氧化性報道相對較少,所以此方面的研究與應用非常必要。
本文以水蒸氣蒸餾法提取當歸揮發(fā)油,以當歸粒徑、加水倍數(shù)、提取時間作為考察因素。在單因素試驗的基礎上,利用響應面法對提取工藝進行了優(yōu)化,篩選出最佳工藝條件參數(shù),并對所提取的揮發(fā)油進行了抗氧化研究,為日后當歸揮發(fā)油大規(guī)模提取生產(chǎn)及中藥材資源的綜合開發(fā)利用提供了一定的理論依據(jù)。
當歸藥材來源于魯南厚普制藥有限公司,經(jīng)魯南厚普制藥有限公司質檢中心高級工程師范建偉鑒定為正品,符合2020年版《中國藥典(一部)》[16]來源規(guī)定;無水乙醇(分析純),天津天力化學試劑有限公司;抗壞血酸(純度99%),天津市科密歐化學試劑有限公司;無水硫酸鈉(分析純),重慶茂業(yè)化學試劑有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH),分析純,美國Sigma-Aldrich生物技術公司。
S-10揮發(fā)油提取器,天津歐普化學儀器有限公司; MS1003TS02型電子天平,梅特勒-托利多有限公司;KM-1型可調控溫電熱套,鄄城華魯電熱儀器有限公司;Ultimate 3000型高效液相色譜儀,北京賽默飛科技有限公司;GZX-9240MBE型電熱鼓風干燥箱,上海博迅實業(yè)有限公司;SPECORD 210 PLUS紫外分光光度計,江蘇精誠儀器設備有限公司。
1.3.1 當歸揮發(fā)油提取工藝
使用水蒸氣蒸餾法,取當歸粉碎后過篩,將400 g當歸顆粒置于圓底燒瓶中,加自來水3~7倍加熱回流,提取4~8 h后停止蒸餾,將藥液靜置冷卻,待油水分離后收集揮發(fā)油。
1.3.2 單因素試驗設計
經(jīng)預試驗確定將當歸粒徑、加水倍數(shù)、提取時間3個因素作為當歸揮發(fā)油提取工藝的考察對象,結果表明當歸粒徑可取值范圍為10~80 目,加水倍數(shù)可取值范圍為當歸質量的3~7倍,煎煮時間可取值范圍為4~8 h,由此設計單因素試驗:各組平行均稱取400 g陰干后的當歸,固定加水倍數(shù)5倍,煎煮時間6 h,分別考察10、24、50、65、80 目篩粉碎粒徑對揮發(fā)油提取率的影響;固定當歸粒徑50 目,煎煮時間6 h,分別考察3、4、5、6、7倍加水量對揮發(fā)油提取率的影響;固定當歸粒徑50 目,加水倍數(shù)5倍,分別考察4、5、6、7、8 h煎煮時間對揮發(fā)油提取率的影響。
按2020年版《中國藥典(四部)》[17]中揮發(fā)油測定甲法測定當歸揮發(fā)油提取率,具體計算方法見式(1)。
(1)
式中,V為當歸揮發(fā)油出油量,mL;M為當歸藥材顆粒質量,g。
1.3.3 響應面優(yōu)化試驗設計
根據(jù)響應面試驗設計原理和單因素試驗結果以及生產(chǎn)實際需要,選取當歸粒徑(A)、加水倍數(shù)(B)、提取時間(C)等3個影響因素,以揮發(fā)油提取率作為響應值,各取3個水平,進行三因素三水平響應面優(yōu)化試驗,試驗因素與水平見表1。
表1 試驗因素水平與編碼
參考羅秋水等的測定方法[18],并作出略微修改。
1.4.1 DPPH自由基溶液的配制
精確稱取6 mg DPPH標準品,置于100 mL棕色容量瓶中,加無水乙醇至刻度,搖勻,配成0.06 mg/mL的DPPH標準品溶液,冷藏待用[19]。
1.4.2 當歸揮發(fā)油樣品溶液的配制
取適量的揮發(fā)油置于100 mL的容量瓶中,用無水乙醇將樣品配制成質量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的樣品溶液。分別取2 mL以上樣品溶液,置于離心管中,分別加入2 mL 0.06 mg/mL的DPPH標準品溶液,混勻后避光靜置30 min,再用分光光度計分別測定混合溶液在517 nm處的吸光度,記為a1,用無水乙醇代替DPPH標準品溶液,517 nm處測定吸光度,記為a2,用無水乙醇代替樣品溶液,相同條件下測定吸光度,記為a0,見式(2)。陽性對照采用與樣品質量濃度相同的抗壞血酸(維生素C)對照品溶液。
DPPH自由基清除率=[1-(a1-a2)/a0]×100%。
(2)
利用Design-Expert 10.0以及Excel 8.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析處理,每個樣品3次重復,取平均值。
由圖1可知,當歸粒徑24 目、加水倍數(shù)6倍、提取時間7 h時揮發(fā)油提取率均最高。當歸粒徑大于24目時,當歸顆粒與水的接觸面積較小,顆粒內部揮發(fā)油難以蒸出;而粒徑小于24 目時,粒徑較小,接觸面積過大,藥材顆粒與水充分接觸后內部含有的多糖、內酯類等小分子物質經(jīng)水煎煮后極易被提取出來,導致水中的黏性物質增多,造成當歸藥材顆粒發(fā)生黏結、成團現(xiàn)象,不利于揮發(fā)油的蒸出,同時燒瓶底部還會有少量顆粒粘在瓶壁,出現(xiàn)焦糊現(xiàn)象,這也可能是揮發(fā)油量損失的原因之一。加水過多會使揮發(fā)油在水中部分溶解,而加水過少無法充分浸潤當歸藥材;提取時間縮短,顆粒內部的有效成分不能完全溶出,而時間過長提取率變化不大且會提高生產(chǎn)成本,耗時、費力。綜上所述,各個因素的改變均會造成揮發(fā)油提取率的下降。因此,為了綜合考量揮發(fā)油提取工藝參數(shù),本試驗結合單因素結果進行后續(xù)響應面分析。
圖1 當歸粒徑、加水倍數(shù)、提取時間對揮發(fā)油提取率的影響Fig.1 Effects of the particle size of angelica granules, water addition factor,and extraction time on the extraction rate of volatile oil
根據(jù)單因素試驗結果,并考慮實際生產(chǎn)需要的條件。以當歸粒徑(A)、加水倍數(shù)(B)、提取時間(C)為自變量,以揮發(fā)油提取率為響應值設計試驗,試驗方案及結果見表2。采用Design Expert 10.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行二次響應面回歸分析,得出當歸揮發(fā)油提取率與各因變量的模擬方程為:
Y=0.55-0.006 625A+0.007 875B+0.015C-0.001 500AB-0.002 250AC+0.002 250BC-0.029A2-0.020B2-0.013C2。
表2 響應面試驗方案及結果
表2(續(xù))
根據(jù)表3可知,回歸模型P值<0.001,處在極顯著水平,表明該模型顯著回歸,方程可以確切表明揮發(fā)油提取率與各因素之間的關系。表中多元相關系數(shù)R2=0.989 2,表明該回歸方程具有極高的可信度;失擬項P=0.061 9>0.05,表示極不顯著,證明了該回歸模型與試驗擬合度極高。表中A2、B2、C2各項的P值都小于0.05,均對響應值結果影響顯著。根據(jù)F值可以看出影響揮發(fā)油提取率的因素由大到小順序為提取時間、加水倍數(shù)、當歸粒徑。
表3 回歸模型顯著性檢驗及方差分析
等高線圖和響應面圖可以直觀地反應出各因素交互作用對揮發(fā)油提取率的影響,等高線中的圓形表示兩因素交互作用不太明顯,而橢圓形則表示兩因素的交互作用比較明顯[20-21]。如圖2所示,提取時間與粒徑兩者的等高線圖呈橢圓形,交互作用較為顯著,而當歸粒徑與加水倍數(shù)、提取時間與加水倍數(shù)的等高線圖均呈現(xiàn)出圓形,表明兩者交互作用不顯著。
圖2 因素交互作用的響應面圖和等高線圖Fig.2 Contour diagram and response surface diagram of factor interaction
響應面法得出該模型最優(yōu)解:當歸粒徑20.248目、加水倍數(shù)6.246 倍、提取時間7.757 h。根據(jù)藥典規(guī)定并結合實際生產(chǎn)條件,將工藝條件修正為:當歸粒徑24目、加水倍數(shù)6 倍、提取時間7 h,在此條件下提取3批當歸揮發(fā)油,見表4。結果表明了上述工藝參數(shù)條件準確可靠,具有實際生產(chǎn)價值。
表4 工藝驗證實驗結果
由圖3可知,當歸揮發(fā)油從0.2 mg/mL增加到1.2 mg/mL時,DPPH自由基清除率從12.7%增加到51.9%,即揮發(fā)油抗氧化性對樣品質量濃度有一定依賴性。圖中可以發(fā)現(xiàn),使用相同質量濃度的維生素C代替樣品質量濃度時,DPPH自由基清除率高于當歸揮發(fā)油,維生素C對DPPH自由基的清除率一直處于較高水平。結果表明了當歸揮發(fā)油抗氧化能力比對照品維生素C差,當歸揮發(fā)油的IC50為0.953 mg/mL。
圖3 當歸揮發(fā)油對DPPH自由基的清除作用Fig.3 DPPH free radical scavenging effect of A. sinensis volatile oil
為了有效提高當歸藥材的使用價值,本試驗以當歸藥材為研究對象,利用響應面法對當歸揮發(fā)油提取工藝進行優(yōu)化。優(yōu)選出的工藝參數(shù)如下:當歸粉碎粒徑24目,加水倍數(shù)6倍,提取時間7 h,在此條件下?lián)]發(fā)油提取率可達到0.538%。然后,對該當歸揮發(fā)油進行DPPH自由基的清除率研究,結果表明當歸揮發(fā)油具有一定的抗氧化性,樣品質量濃度在0.2 mg/mL~1.2 mg/mL范圍內時,DPPH自由基清除率與當歸揮發(fā)油的質量濃度呈顯著的正比量效關系,當歸揮發(fā)油質量濃度為1.2 mg/mL時,DPPH自由基清除率最高。此研究為當歸藥材的提取工藝摸索出最優(yōu)條件,結果參數(shù)穩(wěn)定、可行。本試驗使用響應面法優(yōu)化了當歸揮發(fā)油的提取工藝并測定了其抗氧化活性,旨在為揮發(fā)油的進一步開發(fā)利用提供理論指導,為當歸臨床應用范圍的擴展提供新的思路。