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      中醫(yī)藥治療便秘的用藥規(guī)律及網(wǎng)絡(luò)藥理學探析

      2022-12-19 10:44:46劉雙董紅敬張艷艷王曉劉紋紋
      山東科學 2022年6期
      關(guān)鍵詞:藥理學白術(shù)靶點

      劉雙,董紅敬*,張艷艷,王曉,劉紋紋

      (1.齊魯工業(yè)大學(山東省科學院) a. 山東省分析測試中心;b.藥學院,山東 濟南 250014;2. 山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,山東 濟南 250014)

      便秘是指由于大腸傳導功能異常引起的一種腸道疾病,主要表現(xiàn)為排便次數(shù)減少、排便困難、糞便干硬等,嚴重影響生活質(zhì)量[1-3]。當前,治療便秘的藥物還是以化學藥物為主,比如溶劑性瀉藥,然而,化學藥物在治療便秘的同時會伴隨著一定程度的副作用,并且停藥后存在病情復發(fā)的情況[4-6]。中醫(yī)在便秘的治療方面具有豐富的臨床經(jīng)驗,注重辨證施治,中藥復方紛繁多變[7]。早在《傷寒雜病論》中記載胃熱過盛、脾陰不足可導致便秘,提出了“脾約”“陽結(jié)”“陰結(jié)”等病名[1]。

      網(wǎng)絡(luò)藥理學是闡明藥物-成分-靶點-疾病之間的內(nèi)在聯(lián)系,揭示藥物的作用途徑、藥物與疾病之間的關(guān)聯(lián)性的一門前沿學科[8],基于系統(tǒng)生物學和多向藥理學研究理論、高通量篩選和網(wǎng)絡(luò)分析及可視化技術(shù)等[9],系統(tǒng)地、整體地分析中藥復方,有利于從分子機制方面闡明成分在預防或治療疾病方面發(fā)揮作用的途徑,揭示中藥多成分-多靶點-多途徑的效用特點[10];分子對接是在網(wǎng)絡(luò)藥理學挖掘出化學成分和靶點的基礎(chǔ)上,運用計算機軟件模擬藥物分子與大分子靶標的結(jié)合區(qū)域,通過計算物理和化學鍵值來預測結(jié)合能及結(jié)合方式的技術(shù)[11],對于揭示藥物分子與靶點在體內(nèi)的結(jié)合情況具有一定程度的輔助作用。

      近年來,中醫(yī)藥治療便秘的數(shù)據(jù)挖掘研究集中于用藥規(guī)律分析,而挖掘出眾多復方中的核心中藥并闡明其作用機制的研究較少。本文采用數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學方法,探究治療便秘的中藥復方的用藥規(guī)律,并闡明核心中藥的作用機制,借助分子對接進一步進行核心成分和核心靶點的結(jié)合驗證,為治療便秘新復方的開發(fā)提供依據(jù),也為傳統(tǒng)中藥科學性的現(xiàn)代闡釋提供參考。

      1 材料與方法

      1.1 數(shù)據(jù)來源

      通過中國知網(wǎng)(https://www.cnki.net/)數(shù)據(jù)庫、維普中文期刊服務(wù)平臺(http://qikan.cqvip.com/)及萬方數(shù)據(jù)知識服務(wù)平臺(https://www.wanfangdata.com.cn/index.html),以“便秘”為關(guān)鍵詞,檢索相關(guān)文獻,查找治療便秘的中藥處方,檢索時間為建庫至2021年9月28日。

      1.2 數(shù)據(jù)篩選及規(guī)范化處理

      數(shù)據(jù)錄入由兩位研究員獨立完成并交叉核對,當出現(xiàn)分歧時通過討論決定,確保錄入信息準確無誤。

      納入標準:①文獻中復方數(shù)據(jù)來源于治療便秘的臨床實驗研究;②給藥方式為口服;③處方明確的中藥復方;④療效明確且顯著。

      排除標準:①綜述類及動物實驗類文獻;②中藥復方組成不全的文獻。

      數(shù)據(jù)規(guī)范:根據(jù)《中國藥典》2020版[12]以及《中華本草》[13]來規(guī)范各處方的中藥名稱,如熟地規(guī)范為熟地黃,首烏規(guī)范為何首烏,浙貝規(guī)范為貝母。

      1.3 用藥規(guī)律分析

      將篩選并規(guī)范好的中藥復方錄入Excel表格中,使用數(shù)據(jù)透視表統(tǒng)計藥物的使用頻率,采用SPSS Modeler 18.0及SPSS Statistics 26.0軟件進行復雜網(wǎng)絡(luò)、關(guān)聯(lián)規(guī)則以及聚類分析,并利用Cytoscape軟件進行網(wǎng)絡(luò)可視化分析。

      1.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學分析

      綜合分析用藥頻次、復雜網(wǎng)絡(luò)、關(guān)聯(lián)規(guī)則以及聚類分析結(jié)果,篩選出核心藥物。通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform, TCMSP)獲取核心藥物的化學成分及靶點,采用STRING數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/)查詢靶點蛋白對應(yīng)的基因名稱;基于GeneCards(https://www.genecards.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)、TCMIP(http://www.tcmip.cn/TCMIP)、OMIM(https://omim.org/)、DrugBank(https://go.drugbank.com/)等數(shù)據(jù)庫,以“constipation”為關(guān)鍵詞查詢并收集疾病靶點,采用Venny平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)獲取藥物靶點與疾病靶點的共有靶點,作為治療便秘的潛在靶點;利用Excel使?jié)撛诎悬c與化學成分相互映射,利用Cytoscape軟件構(gòu)建藥物-化學成分-潛在靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)并分析拓撲網(wǎng)絡(luò),根據(jù)度值(degree)得到關(guān)鍵靶點;采用STRING數(shù)據(jù)庫獲取關(guān)鍵靶點的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò),基于DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)對關(guān)鍵靶點進行基因本體(Gene ontology, GO)富集分析及京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析。

      2 結(jié)果

      2.1 復方數(shù)據(jù)統(tǒng)計及用藥頻次分析

      共獲得中藥治療便秘的復方85個,涉及141味中藥。通過分析,發(fā)現(xiàn)使用頻率≥10的藥物有25味(詳見OSID科學數(shù)據(jù)與內(nèi)容),累計頻次455次,占總頻次的66.52%,屬于高頻藥物。其中,出現(xiàn)頻次前10的中藥依次為白術(shù)、當歸、枳實、火麻仁、地黃、肉蓯蓉、黃芪、厚樸、杏仁和枳殼。

      2.2 關(guān)聯(lián)規(guī)則分析

      對數(shù)據(jù)進行整理,將含有這味藥物標記為Y,不含這味藥物標記為N。運用SPSS Modeler 18.0軟件進行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析,通過源節(jié)點導入Excel格式數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)類型設(shè)置為標記,角色設(shè)置為任意,將數(shù)據(jù)節(jié)點與數(shù)據(jù)類型節(jié)點進行連接,僅顯示true值標志,顯示的最大鏈接數(shù)設(shè)置為40,設(shè)置“弱鏈接上限”為5,“強鏈接下限”為15,按照鏈接大小連續(xù)變化進行繪圖,分析藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則(圖1);其中,連線的粗細表示兩種藥物在同一復方中出現(xiàn)的頻率。圖中顯示,白術(shù)、當歸、枳實、火麻仁的相關(guān)性較強,在治療便秘的中藥復方中一起使用頻次較高。在建模選項板下,選擇關(guān)聯(lián)中的Apriori算法,將Apriori 節(jié)點與類型節(jié)點相連接,使用預定義角色,選擇最低條件支持度10%,最小規(guī)則置信度80%,最大前項數(shù)為2,對藥物進行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析。根據(jù)Apriori 算法,一共產(chǎn)生1 464 條規(guī)則,主要的關(guān)聯(lián)規(guī)則見表1、表2。

      圖1 治療便秘的中藥復方藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則Fig.1 Association rules of traditional Chinese medicine for treating constipation

      表1 常用2味藥物組合關(guān)聯(lián)規(guī)則

      表2 常用3味藥物組合關(guān)聯(lián)規(guī)則

      2.3 聚類分析

      結(jié)合高頻藥物使用統(tǒng)計表,選取頻次≥10的藥物,采用SPSS Statistics 20.0 軟件平均聯(lián)接(組間)、皮爾遜相關(guān)系數(shù)的方法進行系統(tǒng)聚類分析,生成樹狀聚類圖(見OSID科學數(shù)據(jù)與內(nèi)容)。自聚類分析譜系圖上的聚類距離選擇為20,可將藥物分為5類。Ⅰ類:地黃、玄參、麥冬、火麻仁、郁李仁;Ⅱ類:黃芪、黨參、陳皮、白術(shù)、炙甘草、當歸、肉蓯蓉、何首烏、杏仁;Ⅲ類:甘草、柴胡、白芍、枳殼、牛膝、厚樸、桃仁;Ⅳ類:檳榔、木香、枳實;Ⅴ類:大黃。

      2.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學分析

      綜合分析數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果,白術(shù)、當歸、枳實、火麻仁的使用頻率最高,為進一步探究4味藥物的具體作用機制,采用網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接技術(shù)進行深層次分析。

      基于TCMSP數(shù)據(jù)庫,建立4味藥物的化學成分及靶點庫,數(shù)據(jù)庫獲取核心藥物的化學成分及靶點,共得到370個藥物靶點;采用GeneCards、TTD、TCMIP、OMIM、DrugBank等數(shù)據(jù)庫獲取疾病靶點,整合去重,共得到便秘相關(guān)靶點5 533個;采用Venny平臺相互映射藥物靶點與疾病靶點后共得到246個潛在靶點(圖2)。

      圖2 Venn圖Fig.2 Venn diagram

      潛在靶點與化學成分相互映射分析,共得到白術(shù)中化學成分48個、當歸中化學成分67個、枳實中化學成分50個、火麻仁中化學成分37個;采用Cytoscape軟件構(gòu)建藥物-化學成分-潛在靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)(見OSID科學數(shù)據(jù)與內(nèi)容),網(wǎng)絡(luò)共包含439個節(jié)點、2 025條網(wǎng)線;運用Network Analysis工具分析拓撲網(wǎng)絡(luò)并篩選出度值≥5的關(guān)鍵靶點90個。

      借助STRING數(shù)據(jù)庫建立關(guān)鍵靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)并利用Cytoscape實現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)可視化(圖3),分析拓撲網(wǎng)絡(luò),節(jié)點的大小和顏色的深淺表示其度值的高低,節(jié)點越大表示度值越高,顏色由黃色漸變成橙色表示度值逐漸提高,度值排名前10的靶點見表3,篩選度值最高的AKT1(度值≥57)作為核心靶點。

      表3 度值排名前10的靶點(度值≥41)

      圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network

      基于DAVID數(shù)據(jù)庫對關(guān)鍵靶點進行GO富集分析(圖4)和KEGG通路富集分析(圖5)。GO富集分析包括生物過程、細胞組分和分子功能三個部分。其中,關(guān)鍵靶點富集的生物過程條目有對藥物的反應(yīng)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、凋亡過程的負調(diào)控等;細胞組分條目有細胞核、胞質(zhì)溶膠、細胞質(zhì)等;分子功能條目有蛋白質(zhì)結(jié)合、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚化活性等。

      圖4 Go富集分析Fig.4 Go enrichment analysis

      圖5 KEGG富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis

      選擇藥物-化學成分-潛在靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)中每種藥物度值最高的化學成分作為核心成分,通過Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)下載核心成分的sdf格式文件,并借助OpenBabel軟件轉(zhuǎn)換成mol2格式;通過RCSB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)下載核心靶點AKT1的結(jié)構(gòu)式,并借助Pymol軟件進行去水、去小配體操作。運用AutoDock進行分子對接;在分子對接中,結(jié)合能為負數(shù),說明化學成分和靶點蛋白之間結(jié)合會放出能量,可以自發(fā)地穩(wěn)定結(jié)合。4個化學成分芹菜素、甘氨酸、β-豆甾醇、植物甾醇與核心靶點AKT1的結(jié)合能均為負值(表4)?;瘜W成分之間均可通過氫鍵產(chǎn)生相互作用,結(jié)合后的構(gòu)象穩(wěn)定(圖6)。

      表4 核心化學成分與核心靶點AKT1的結(jié)合能

      圖6 分子對接結(jié)果Fig.6 Molecular docking results

      3 討論

      Apriori算法是一種挖掘關(guān)聯(lián)規(guī)則的頻繁項集算法,支持度和置信度可以表示關(guān)聯(lián)規(guī)則的強度[14]。關(guān)聯(lián)規(guī)則結(jié)果顯示,白術(shù)-黃芪,白術(shù)-黃芪-當歸分別是同一個組里支持度最高的組合。有研究表明,白術(shù)丙酮提取物經(jīng)灌胃給藥,可抑制大鼠胃排空,能夠促進小腸的輸送功能[15]。通過研究白術(shù)揮發(fā)油影響正常小鼠及用阿托品處理后小鼠的腸推進及胃排空實驗,發(fā)現(xiàn)白術(shù)揮發(fā)油能促進胃腸運動,進而實現(xiàn)促消化作用[16]。黃芪能增加部分消化道長度、降低吸收部位的空腸單位質(zhì)量,有利于物質(zhì)吸收[17]。黃芪多糖可通過改善消化系統(tǒng)的形態(tài)結(jié)構(gòu),進而提高機體的消化能力,加強小腸對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收作用,促進動物的生長發(fā)育完全[18]。當歸揮發(fā)油具有解痙、抗炎、鎮(zhèn)痛等廣泛的藥理作用,特別是對平滑肌有明顯的藥理活性[19]。當歸揮發(fā)油能抑制正常小鼠的胃排空, 也能明顯解除乙酰膽堿誘發(fā)的小鼠胃腸平滑肌痙攣, 減慢胃排空和腸推進[7]。

      聚類分析能在多維空間或模式空間發(fā)現(xiàn)隱藏的結(jié)構(gòu),利用確定的標準計算出所有樣品之間的相關(guān)性,根據(jù)相關(guān)程度將其簡化合并,從而可以直觀地進行相似品種及組分信息的綜合比較[20],對頻次≥10的藥物進行聚類分析。聚類Ⅰ為養(yǎng)陰潤腸方中的藥物,地黃、玄參、麥冬三者合用,養(yǎng)陰生津,專治溫病津傷,腸燥便秘;火麻仁、郁李仁均為潤腸通便之良藥[21]。聚類Ⅱ為益氣健脾通便方,方中白術(shù)為君,重在調(diào)運脾氣,杏仁,斂降肺氣,助胃腸氣降,同時佐以當歸、肉蓯蓉溫陽補血、潤腸通便,陳皮理氣化滯,共為佐藥; 炙甘草協(xié)君藥健脾,助臣藥補氣,共佐藥滋潤,調(diào)和諸藥,諸藥合用,共奏益氣健脾、潤腸通便之功。黃芪益氣升清,黨參健脾養(yǎng)陰,共為臣藥,助君藥健脾[22]。聚類Ⅲ為甘草、柴胡、白芍、枳殼、牛膝、厚樸、桃仁,其中,甘草、柴胡、白芍、枳殼、厚樸能疏肝健脾、行氣止痛,桃仁可潤腸通便,牛膝具有逐瘀通經(jīng),引血下行之功效。聚類Ⅳ為疏肝理脾潤腸湯中的藥物,枳實具有破氣消積之功效,木香能行氣止痛、健脾消食,檳榔可積行氣。聚類Ⅴ為大黃,利濕退黃,瀉熱通便[23]。

      網(wǎng)絡(luò)藥理學分析發(fā)現(xiàn),4種核心藥物主要是通過調(diào)節(jié)癌癥通路、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B信號通路、p53信號通路等信號通路,達到治療便秘的目的。磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B信號通路調(diào)節(jié)細胞的存活、生長、分化、細胞代謝和細胞骨架的重組等[24],研究表明,該信號通路是胰島素調(diào)控血糖平衡的重要通路,通路中主要因子的穩(wěn)定表達能夠保證標準的 PI3K/Akt 途徑傳導,是實現(xiàn)骨骼肌細胞對葡萄糖攝取、維持糖代謝穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵[25]。歐宏宇等[26]發(fā)現(xiàn)胃癌細胞AGS細胞的凋亡與p53信號通路的激活有關(guān),通過上調(diào)p53 mRNA和蛋白表達水平并促進p53蛋白核轉(zhuǎn)位,同時促進凋亡蛋白Cleaved-caspase-3、PUMA和Bax表達,抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達,進而誘導細胞調(diào)亡,發(fā)揮抗腫瘤作用。通過PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出核心靶點AKT1,AKT1是PI3K/Akt信號通路下游的靶點,與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)密切相關(guān),而促炎因子IL-6的過度表達會引起腸道炎,進而影響胃腸道運動及分泌功能的正常運行,其作用機制可能是激活胃腸道黏膜下層的神經(jīng)元進而影響胃腸蠕動。分子對接結(jié)果顯示,4種藥物的核心成分均能與核心靶點AKT1進行自發(fā)地結(jié)合,釋放出能量,主要的結(jié)合方式為氫鍵,其中,AKT1與植物甾醇的結(jié)合能最低,為-19.72 kJ/mol,表明其結(jié)合后的親和作用較強和構(gòu)象穩(wěn)定。此外,芹菜素與AKT1的殘基TYR299之間以氫鍵相連;甘氨酸通過氫鍵與AKT1的殘基LEU155發(fā)生相互作用;植物甾醇與AKT1的殘基TYR299之間以氫鍵相連;β-谷甾醇通過氫鍵與AKT1的殘基TYR299發(fā)生相互作用。

      綜上所述,中藥復方治療便秘以健脾益氣、潤腸通便為主,白術(shù)、當歸、枳實、火麻仁是使用頻次較高的核心藥物。同時,采用網(wǎng)絡(luò)藥理學及分子對接技術(shù)分析了4種核心中藥的分子作用機制,表明核心中藥中化學成分所作用的關(guān)鍵靶點,主要參與癌癥通路、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B信號通路、p53信號通路等信號通路,發(fā)揮治療便秘的作用,該研究為治療便秘的中藥復方的研發(fā)提供了思路,為臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

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