中醫(yī)藥治療便秘的用藥規(guī)律及網(wǎng)絡(luò)藥理學探析

劉雙，董紅敬*，張艷艷，王曉，劉紋紋

(1.齊魯工業(yè)大學(山東省科學院) a. 山東省分析測試中心；b.藥學院，山東 濟南 250014；2. 山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250014)

便秘是指由于大腸傳導功能異常引起的一種腸道疾病，主要表現(xiàn)為排便次數(shù)減少、排便困難、糞便干硬等，嚴重影響生活質(zhì)量[1-3]。當前，治療便秘的藥物還是以化學藥物為主，比如溶劑性瀉藥，然而，化學藥物在治療便秘的同時會伴隨著一定程度的副作用，并且停藥后存在病情復發(fā)的情況[4-6]。中醫(yī)在便秘的治療方面具有豐富的臨床經(jīng)驗，注重辨證施治，中藥復方紛繁多變[7]。早在《傷寒雜病論》中記載胃熱過盛、脾陰不足可導致便秘，提出了“脾約”“陽結(jié)”“陰結(jié)”等病名[1]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學是闡明藥物-成分-靶點-疾病之間的內(nèi)在聯(lián)系，揭示藥物的作用途徑、藥物與疾病之間的關(guān)聯(lián)性的一門前沿學科[8]，基于系統(tǒng)生物學和多向藥理學研究理論、高通量篩選和網(wǎng)絡(luò)分析及可視化技術(shù)等[9]，系統(tǒng)地、整體地分析中藥復方，有利于從分子機制方面闡明成分在預防或治療疾病方面發(fā)揮作用的途徑，揭示中藥多成分-多靶點-多途徑的效用特點[10]；分子對接是在網(wǎng)絡(luò)藥理學挖掘出化學成分和靶點的基礎(chǔ)上，運用計算機軟件模擬藥物分子與大分子靶標的結(jié)合區(qū)域，通過計算物理和化學鍵值來預測結(jié)合能及結(jié)合方式的技術(shù)[11]，對于揭示藥物分子與靶點在體內(nèi)的結(jié)合情況具有一定程度的輔助作用。

近年來，中醫(yī)藥治療便秘的數(shù)據(jù)挖掘研究集中于用藥規(guī)律分析，而挖掘出眾多復方中的核心中藥并闡明其作用機制的研究較少。本文采用數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，探究治療便秘的中藥復方的用藥規(guī)律，并闡明核心中藥的作用機制，借助分子對接進一步進行核心成分和核心靶點的結(jié)合驗證，為治療便秘新復方的開發(fā)提供依據(jù)，也為傳統(tǒng)中藥科學性的現(xiàn)代闡釋提供參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

通過中國知網(wǎng)(https://www.cnki.net/)數(shù)據(jù)庫、維普中文期刊服務(wù)平臺(http://qikan.cqvip.com/)及萬方數(shù)據(jù)知識服務(wù)平臺(https://www.wanfangdata.com.cn/index.html)，以“便秘”為關(guān)鍵詞，檢索相關(guān)文獻，查找治療便秘的中藥處方，檢索時間為建庫至2021年9月28日。

1.2 數(shù)據(jù)篩選及規(guī)范化處理

數(shù)據(jù)錄入由兩位研究員獨立完成并交叉核對，當出現(xiàn)分歧時通過討論決定，確保錄入信息準確無誤。

納入標準：①文獻中復方數(shù)據(jù)來源于治療便秘的臨床實驗研究；②給藥方式為口服；③處方明確的中藥復方；④療效明確且顯著。

排除標準：①綜述類及動物實驗類文獻；②中藥復方組成不全的文獻。

數(shù)據(jù)規(guī)范：根據(jù)《中國藥典》2020版[12]以及《中華本草》[13]來規(guī)范各處方的中藥名稱，如熟地規(guī)范為熟地黃，首烏規(guī)范為何首烏，浙貝規(guī)范為貝母。

1.3 用藥規(guī)律分析

將篩選并規(guī)范好的中藥復方錄入Excel表格中，使用數(shù)據(jù)透視表統(tǒng)計藥物的使用頻率，采用SPSS Modeler 18.0及SPSS Statistics 26.0軟件進行復雜網(wǎng)絡(luò)、關(guān)聯(lián)規(guī)則以及聚類分析，并利用Cytoscape軟件進行網(wǎng)絡(luò)可視化分析。

1.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學分析

綜合分析用藥頻次、復雜網(wǎng)絡(luò)、關(guān)聯(lián)規(guī)則以及聚類分析結(jié)果，篩選出核心藥物。通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform， TCMSP)獲取核心藥物的化學成分及靶點，采用STRING數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/)查詢靶點蛋白對應(yīng)的基因名稱；基于GeneCards(https://www.genecards.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)、TCMIP(http://www.tcmip.cn/TCMIP)、OMIM(https://omim.org/)、DrugBank(https://go.drugbank.com/)等數(shù)據(jù)庫，以“constipation”為關(guān)鍵詞查詢并收集疾病靶點，采用Venny平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)獲取藥物靶點與疾病靶點的共有靶點，作為治療便秘的潛在靶點；利用Excel使?jié)撛诎悬c與化學成分相互映射，利用Cytoscape軟件構(gòu)建藥物-化學成分-潛在靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)并分析拓撲網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)度值(degree)得到關(guān)鍵靶點；采用STRING數(shù)據(jù)庫獲取關(guān)鍵靶點的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，基于DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)對關(guān)鍵靶點進行基因本體(Gene ontology， GO)富集分析及京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG)通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 復方數(shù)據(jù)統(tǒng)計及用藥頻次分析

共獲得中藥治療便秘的復方85個，涉及141味中藥。通過分析，發(fā)現(xiàn)使用頻率≥10的藥物有25味(詳見OSID科學數(shù)據(jù)與內(nèi)容)，累計頻次455次，占總頻次的66.52%，屬于高頻藥物。其中，出現(xiàn)頻次前10的中藥依次為白術(shù)、當歸、枳實、火麻仁、地黃、肉蓯蓉、黃芪、厚樸、杏仁和枳殼。

2.2 關(guān)聯(lián)規(guī)則分析

對數(shù)據(jù)進行整理，將含有這味藥物標記為Y，不含這味藥物標記為N。運用SPSS Modeler 18.0軟件進行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，通過源節(jié)點導入Excel格式數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)類型設(shè)置為標記，角色設(shè)置為任意，將數(shù)據(jù)節(jié)點與數(shù)據(jù)類型節(jié)點進行連接，僅顯示true值標志，顯示的最大鏈接數(shù)設(shè)置為40，設(shè)置“弱鏈接上限”為5，“強鏈接下限”為15，按照鏈接大小連續(xù)變化進行繪圖，分析藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則(圖1)；其中，連線的粗細表示兩種藥物在同一復方中出現(xiàn)的頻率。圖中顯示，白術(shù)、當歸、枳實、火麻仁的相關(guān)性較強，在治療便秘的中藥復方中一起使用頻次較高。在建模選項板下，選擇關(guān)聯(lián)中的Apriori算法，將Apriori 節(jié)點與類型節(jié)點相連接，使用預定義角色，選擇最低條件支持度10%，最小規(guī)則置信度80%，最大前項數(shù)為2，對藥物進行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析。根據(jù)Apriori 算法，一共產(chǎn)生1 464 條規(guī)則，主要的關(guān)聯(lián)規(guī)則見表1、表2。

圖1 治療便秘的中藥復方藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則Fig.1 Association rules of traditional Chinese medicine for treating constipation

表1 常用2味藥物組合關(guān)聯(lián)規(guī)則

表2 常用3味藥物組合關(guān)聯(lián)規(guī)則

2.3 聚類分析

結(jié)合高頻藥物使用統(tǒng)計表，選取頻次≥10的藥物，采用SPSS Statistics 20.0 軟件平均聯(lián)接(組間)、皮爾遜相關(guān)系數(shù)的方法進行系統(tǒng)聚類分析，生成樹狀聚類圖(見OSID科學數(shù)據(jù)與內(nèi)容)。自聚類分析譜系圖上的聚類距離選擇為20，可將藥物分為5類。Ⅰ類：地黃、玄參、麥冬、火麻仁、郁李仁；Ⅱ類：黃芪、黨參、陳皮、白術(shù)、炙甘草、當歸、肉蓯蓉、何首烏、杏仁；Ⅲ類：甘草、柴胡、白芍、枳殼、牛膝、厚樸、桃仁；Ⅳ類：檳榔、木香、枳實；Ⅴ類：大黃。

2.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學分析

綜合分析數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果，白術(shù)、當歸、枳實、火麻仁的使用頻率最高，為進一步探究4味藥物的具體作用機制，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接技術(shù)進行深層次分析。

基于TCMSP數(shù)據(jù)庫，建立4味藥物的化學成分及靶點庫，數(shù)據(jù)庫獲取核心藥物的化學成分及靶點，共得到370個藥物靶點；采用GeneCards、TTD、TCMIP、OMIM、DrugBank等數(shù)據(jù)庫獲取疾病靶點，整合去重，共得到便秘相關(guān)靶點5 533個；采用Venny平臺相互映射藥物靶點與疾病靶點后共得到246個潛在靶點(圖2)。

圖2 Venn圖Fig.2 Venn diagram

潛在靶點與化學成分相互映射分析，共得到白術(shù)中化學成分48個、當歸中化學成分67個、枳實中化學成分50個、火麻仁中化學成分37個；采用Cytoscape軟件構(gòu)建藥物-化學成分-潛在靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)(見OSID科學數(shù)據(jù)與內(nèi)容)，網(wǎng)絡(luò)共包含439個節(jié)點、2 025條網(wǎng)線；運用Network Analysis工具分析拓撲網(wǎng)絡(luò)并篩選出度值≥5的關(guān)鍵靶點90個。

借助STRING數(shù)據(jù)庫建立關(guān)鍵靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)并利用Cytoscape實現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)可視化(圖3)，分析拓撲網(wǎng)絡(luò)，節(jié)點的大小和顏色的深淺表示其度值的高低，節(jié)點越大表示度值越高，顏色由黃色漸變成橙色表示度值逐漸提高，度值排名前10的靶點見表3，篩選度值最高的AKT1(度值≥57)作為核心靶點。

表3 度值排名前10的靶點(度值≥41)

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network

基于DAVID數(shù)據(jù)庫對關(guān)鍵靶點進行GO富集分析(圖4)和KEGG通路富集分析(圖5)。GO富集分析包括生物過程、細胞組分和分子功能三個部分。其中，關(guān)鍵靶點富集的生物過程條目有對藥物的反應(yīng)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、凋亡過程的負調(diào)控等；細胞組分條目有細胞核、胞質(zhì)溶膠、細胞質(zhì)等；分子功能條目有蛋白質(zhì)結(jié)合、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚化活性等。

圖4 Go富集分析Fig.4 Go enrichment analysis

圖5 KEGG富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis

選擇藥物-化學成分-潛在靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)中每種藥物度值最高的化學成分作為核心成分，通過Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)下載核心成分的sdf格式文件，并借助OpenBabel軟件轉(zhuǎn)換成mol2格式；通過RCSB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)下載核心靶點AKT1的結(jié)構(gòu)式，并借助Pymol軟件進行去水、去小配體操作。運用AutoDock進行分子對接；在分子對接中，結(jié)合能為負數(shù)，說明化學成分和靶點蛋白之間結(jié)合會放出能量，可以自發(fā)地穩(wěn)定結(jié)合。4個化學成分芹菜素、甘氨酸、β-豆甾醇、植物甾醇與核心靶點AKT1的結(jié)合能均為負值(表4)?；瘜W成分之間均可通過氫鍵產(chǎn)生相互作用，結(jié)合后的構(gòu)象穩(wěn)定(圖6)。

表4 核心化學成分與核心靶點AKT1的結(jié)合能

圖6 分子對接結(jié)果Fig.6 Molecular docking results

3 討論

Apriori算法是一種挖掘關(guān)聯(lián)規(guī)則的頻繁項集算法，支持度和置信度可以表示關(guān)聯(lián)規(guī)則的強度[14]。關(guān)聯(lián)規(guī)則結(jié)果顯示，白術(shù)-黃芪，白術(shù)-黃芪-當歸分別是同一個組里支持度最高的組合。有研究表明，白術(shù)丙酮提取物經(jīng)灌胃給藥，可抑制大鼠胃排空，能夠促進小腸的輸送功能[15]。通過研究白術(shù)揮發(fā)油影響正常小鼠及用阿托品處理后小鼠的腸推進及胃排空實驗，發(fā)現(xiàn)白術(shù)揮發(fā)油能促進胃腸運動，進而實現(xiàn)促消化作用[16]。黃芪能增加部分消化道長度、降低吸收部位的空腸單位質(zhì)量，有利于物質(zhì)吸收[17]。黃芪多糖可通過改善消化系統(tǒng)的形態(tài)結(jié)構(gòu)，進而提高機體的消化能力，加強小腸對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收作用，促進動物的生長發(fā)育完全[18]。當歸揮發(fā)油具有解痙、抗炎、鎮(zhèn)痛等廣泛的藥理作用，特別是對平滑肌有明顯的藥理活性[19]。當歸揮發(fā)油能抑制正常小鼠的胃排空, 也能明顯解除乙酰膽堿誘發(fā)的小鼠胃腸平滑肌痙攣, 減慢胃排空和腸推進[7]。

聚類分析能在多維空間或模式空間發(fā)現(xiàn)隱藏的結(jié)構(gòu)，利用確定的標準計算出所有樣品之間的相關(guān)性，根據(jù)相關(guān)程度將其簡化合并，從而可以直觀地進行相似品種及組分信息的綜合比較[20]，對頻次≥10的藥物進行聚類分析。聚類Ⅰ為養(yǎng)陰潤腸方中的藥物，地黃、玄參、麥冬三者合用，養(yǎng)陰生津，專治溫病津傷，腸燥便秘；火麻仁、郁李仁均為潤腸通便之良藥[21]。聚類Ⅱ為益氣健脾通便方，方中白術(shù)為君，重在調(diào)運脾氣，杏仁，斂降肺氣，助胃腸氣降，同時佐以當歸、肉蓯蓉溫陽補血、潤腸通便，陳皮理氣化滯，共為佐藥; 炙甘草協(xié)君藥健脾，助臣藥補氣，共佐藥滋潤，調(diào)和諸藥，諸藥合用，共奏益氣健脾、潤腸通便之功。黃芪益氣升清，黨參健脾養(yǎng)陰，共為臣藥，助君藥健脾[22]。聚類Ⅲ為甘草、柴胡、白芍、枳殼、牛膝、厚樸、桃仁，其中，甘草、柴胡、白芍、枳殼、厚樸能疏肝健脾、行氣止痛，桃仁可潤腸通便，牛膝具有逐瘀通經(jīng)，引血下行之功效。聚類Ⅳ為疏肝理脾潤腸湯中的藥物，枳實具有破氣消積之功效，木香能行氣止痛、健脾消食，檳榔可積行氣。聚類Ⅴ為大黃，利濕退黃，瀉熱通便[23]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學分析發(fā)現(xiàn)，4種核心藥物主要是通過調(diào)節(jié)癌癥通路、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B信號通路、p53信號通路等信號通路，達到治療便秘的目的。磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B信號通路調(diào)節(jié)細胞的存活、生長、分化、細胞代謝和細胞骨架的重組等[24]，研究表明，該信號通路是胰島素調(diào)控血糖平衡的重要通路，通路中主要因子的穩(wěn)定表達能夠保證標準的 PI3K/Akt 途徑傳導，是實現(xiàn)骨骼肌細胞對葡萄糖攝取、維持糖代謝穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵[25]。歐宏宇等[26]發(fā)現(xiàn)胃癌細胞AGS細胞的凋亡與p53信號通路的激活有關(guān)，通過上調(diào)p53 mRNA和蛋白表達水平并促進p53蛋白核轉(zhuǎn)位，同時促進凋亡蛋白Cleaved-caspase-3、PUMA和Bax表達，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達，進而誘導細胞調(diào)亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。通過PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出核心靶點AKT1，AKT1是PI3K/Akt信號通路下游的靶點，與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，而促炎因子IL-6的過度表達會引起腸道炎，進而影響胃腸道運動及分泌功能的正常運行，其作用機制可能是激活胃腸道黏膜下層的神經(jīng)元進而影響胃腸蠕動。分子對接結(jié)果顯示，4種藥物的核心成分均能與核心靶點AKT1進行自發(fā)地結(jié)合，釋放出能量，主要的結(jié)合方式為氫鍵，其中，AKT1與植物甾醇的結(jié)合能最低，為-19.72 kJ/mol，表明其結(jié)合后的親和作用較強和構(gòu)象穩(wěn)定。此外，芹菜素與AKT1的殘基TYR299之間以氫鍵相連；甘氨酸通過氫鍵與AKT1的殘基LEU155發(fā)生相互作用；植物甾醇與AKT1的殘基TYR299之間以氫鍵相連；β-谷甾醇通過氫鍵與AKT1的殘基TYR299發(fā)生相互作用。

綜上所述，中藥復方治療便秘以健脾益氣、潤腸通便為主，白術(shù)、當歸、枳實、火麻仁是使用頻次較高的核心藥物。同時，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學及分子對接技術(shù)分析了4種核心中藥的分子作用機制，表明核心中藥中化學成分所作用的關(guān)鍵靶點，主要參與癌癥通路、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B信號通路、p53信號通路等信號通路，發(fā)揮治療便秘的作用，該研究為治療便秘的中藥復方的研發(fā)提供了思路，為臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。