CLDN8在腎嫌色細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義*

李生華，張觀蘭，李建棣，楊藝洲,3，許靜婕,3，龐秋愉,4，陳思智,3，楊小萱,3，唐 鄧，李東明，唐玉露，黨裔武，陳 罡，黃志廣△

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，廣西 南寧 530021；3.廣西醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系，廣西 南寧 530021；4.廣西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)系，廣西 南寧 530021)

腎細(xì)胞癌是發(fā)生在腎小管上皮的惡性腫瘤，主要分為腎透明細(xì)胞癌和腎非透明細(xì)胞癌。腎非透明細(xì)胞癌中腎嫌色細(xì)胞癌(chRCC)在1985年由THOENES和COLLS等首先報道，約占腎臟腫瘤的5%[1]。chRCC好發(fā)于50～60歲中年人群，多為體檢偶然發(fā)現(xiàn)，病理活檢仍為目前臨床確診的“金標(biāo)準(zhǔn)”。隨著生活水平和醫(yī)療技術(shù)的提高，相較其他常見亞型的腎臟腫瘤，chRCC發(fā)病率并不高，但患者數(shù)量不少。有研究顯示，chRCC具有惡性潛能，約6.2%的腫瘤可發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[2]。因此，近年來chRCC逐漸受到關(guān)注和重視。CLDN8(Claudin8)基因位于人類染色體21q22.11上，是一種參與構(gòu)成緊密連接的跨膜蛋白，通過形成膜內(nèi)原纖維構(gòu)成緊密連接的骨架，其羧基末端的PDZ結(jié)構(gòu)能與其他緊密連接蛋白分子相互作用，從而固定在緊密連接復(fù)合體上[3]，在維持緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)黏附分子不僅對組織的完整性至關(guān)重要，而且參與多種細(xì)胞行為的信號傳導(dǎo)，細(xì)胞黏附分子和轉(zhuǎn)錄因子的不同組合可協(xié)調(diào)各種生理和病理過程，包括癌癥[4]。如，卵巢癌患者腹水中的腫瘤細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞黏附和細(xì)胞屏障完整性相關(guān)的基因上調(diào)[5]，CLDNs家族基因高表達(dá)于胃癌，有望作為胃癌治療的新靶標(biāo)[6]。目前研究發(fā)現(xiàn)，腎透明細(xì)胞癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、骨肉瘤中都檢測到CLDN8的異常表達(dá)，且與細(xì)胞癌變及緊密連接功能缺失密切相關(guān)[7]。如，CLDN8在腎透明細(xì)胞癌中顯著低表達(dá)，CLDN8被認(rèn)為可抑制腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系通過上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和蛋白激酶B途徑進(jìn)行增生、轉(zhuǎn)化和侵襲的過程[8]。另外，CLDN8通過雄激素受體信號通路促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增生和轉(zhuǎn)移[9]；通過絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(MAPK/ERK)信號通路促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增生、轉(zhuǎn)移和侵襲[10]。CLDN8被檢測到在乳腺癌中低表達(dá)且與雄激素受體呈正相關(guān)，具體機制未知[11]。體外實驗表明，CLDN8敲低可通過阻滯U2OS骨肉瘤細(xì)胞G1-S轉(zhuǎn)化，從而抑制骨肉瘤細(xì)胞系生長[12]。目前，關(guān)于CLDN8參與chRCC的發(fā)生發(fā)展的文獻(xiàn)較少見。本文擬通過收集全球范圍內(nèi)公共數(shù)據(jù)庫中chRCC組織相關(guān)數(shù)據(jù)集，分析CLDN8 mRNA在chRCC組織中的表達(dá)情況，并結(jié)合免疫組織化學(xué)染色(IHC)對臨床病理樣本進(jìn)行驗證，進(jìn)而探索CLDN8在chRCC中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 通過Gene Expression Omnibus(GEO)、Sequence Read Archive(SRA)、ArrayExpress數(shù)據(jù)庫獲取chRCC mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)集，檢索式為“Kidney chromophobe”O(jiān)R“KICH”O(jiān)R“chromophil renal cell carcinoma”O(jiān)R“chromophobe renal cell carcinoma”O(jiān)R“chRCC”。檢索時間為建庫至2021年6月1日。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)數(shù)據(jù)集來源是人類；(2)包含組織mRNA測序數(shù)據(jù)；(3)同時具有chRCC組和非chRCC組，非chRCC組為癌旁組織或正常腎組織，2組數(shù)目均大于或等于3。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)數(shù)據(jù)集來源是細(xì)胞；(2)經(jīng)過基因敲除或藥物處理。此外，通過R包TCGAbiolinks獲取癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫中chRCC經(jīng)RNA測序的計數(shù)數(shù)據(jù)集(建庫至2021年7月12日)，正常腎組織RNA測序基因讀取計數(shù)矩陣下載自Genotype-Tissue Expression(GTEx)數(shù)據(jù)庫。研究使用的組織芯片購買自桂林泛譜生物技術(shù)有限公司，包括11份chRCC組織標(biāo)本和16份非chRCC組織標(biāo)本(In-house TMA數(shù)據(jù)集)。本研究所用標(biāo)本、方法均獲得桂林泛譜生物技術(shù)有限公司和廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2方法 (1)技術(shù)路線：分析chRCC組織、非chRCC組織CLDN8 mRNA及蛋白表達(dá)差異，并通過繪制受試者工作特征(ROC)曲線、匯總ROC(sROC)曲線及計算靈敏度、特異度、陽性似然比等指標(biāo)，分析CLDN8對chRCC的診斷效能。(2)mRNA數(shù)據(jù)集處理：TCGA數(shù)據(jù)集與GTEx數(shù)據(jù)庫下載的正常腎組織RNA測序基因讀取計數(shù)矩陣經(jīng)過合并、批次處理、TPM(transcript per kilobase of exon model per million mapped reads)標(biāo)準(zhǔn)化形成一個獨立的TCGA-GTEx數(shù)據(jù)集。最終，對沒有標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)集進(jìn)行l(wèi)og2(x+1)歸一化處理用于后續(xù)分析。(3)CLDN8蛋白表達(dá)檢測：通過IHC來檢測CLDN8蛋白在chRCC中的表達(dá)情況，各步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。IHC結(jié)果將由2位病理專家分別按照免疫組化染色評分(IRS)系統(tǒng)(0～12分)進(jìn)行閱片評分[13]。染色強度分為0、1、2、3，分別表示陰性、弱、中、強。陽性染色比例分類如下：0為無細(xì)胞染色，1為小于10%，2為11%～50%，3為51%～80%，4為81%～100%。陽性染色比例與染色強度分?jǐn)?shù)的乘積即為對應(yīng)視野的最終得分。每個樣本取5個不同視野依照IRS評分系統(tǒng)進(jìn)行評分，最后取5個視野評分的算術(shù)平均數(shù)作為該樣本的最終得分。所有樣本的評分匯總作為一個數(shù)據(jù)集用于后續(xù)分析。兔抗人CLDN8多克隆抗體購自英國Abcam公司，第二抗體品名為中杉金橋(貨號：PV-6000)，DAB顯色試劑盒(20×)購自福州邁新生物公司(貨號：DAB-0031)。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 通過GraphPad Prism8.0.2軟件進(jìn)行非配對兩獨立樣本t檢驗分析CLDN8在chRCC組織與非chRCC組織中表達(dá)差異，繪制散點圖對結(jié)果進(jìn)行可視化分析。分析ROC曲線獲得真陽性數(shù)、真陰性數(shù)、假陽性數(shù)、假陰性數(shù)。通過Stata12.0軟件合并標(biāo)準(zhǔn)化均數(shù)差(SMD)效應(yīng)量，計算靈敏度、特異度、似然比，繪制sROC曲線及發(fā)表偏倚檢驗漏斗圖。采用sROC曲線下面積(AUC)用于評估CLDN8潛在診斷效能,其中>0.5～0.7為診斷效能較低，>0.7～0.8為診斷效能一般，>0.8～0.9為診斷效能較高，>0.9為診斷效能很高。采用Deeks′漏斗圖和Egger′s檢驗評估發(fā)表偏倚檢驗。Q檢驗和I2可分別定性、定量進(jìn)行異質(zhì)性檢驗，若Q檢驗有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.10)，表明研究存在異質(zhì)性,其中I2≤40%時異質(zhì)性可忽略不計；I2為30%～60%時存在一定程度異質(zhì)性；I2≥50%異質(zhì)性較明顯。當(dāng)Q檢驗P<0.10且I2>50%時，合并效應(yīng)量SMD選用隨機效應(yīng)模型，否則采用固定效應(yīng)模型。

2 結(jié) 果

2.1數(shù)據(jù)收集情況 從公共數(shù)據(jù)庫獲得4個數(shù)據(jù)集，分別是GSE11151、GSE15641、GSE26574、TCGA-GTEx，其中GSE11151數(shù)據(jù)集中chRCC組織標(biāo)本4份，非chRCC組織標(biāo)本5份；GSE15641數(shù)據(jù)集中chRCC組織標(biāo)本6份，非chRCC組織標(biāo)本23份；GSE26574數(shù)據(jù)集中chRCC組織標(biāo)本10份，非chRCC組織標(biāo)本8份；TCGA-GTEx數(shù)據(jù)集中chRCC組織標(biāo)本65份，非chRCC組織標(biāo)本113份。相關(guān)數(shù)據(jù)集獲取流程圖見圖1。

圖1 數(shù)據(jù)集獲取流程圖

2.2chRCC組織與非chRCC組織中CLDN8表達(dá)水平比較 chRCC組織CLDN8 mRNA表達(dá)水平高于非chRCC組織，但僅在TCGA-GTEx數(shù)據(jù)集中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2A～D。免疫組化結(jié)果顯示，與非chRCC組織比較，chRCC組織細(xì)胞成片排列，無明顯結(jié)構(gòu)，細(xì)胞體積增大，核大深染，CLDN8蛋白定位于細(xì)胞漿，在chRCC組織中呈強陽性表達(dá)。見圖3～4。chRCC組織CLDN8蛋白表達(dá)水平與非chRCC組織比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000 1)。見圖5。

A～D.基于公共數(shù)據(jù)集的CLDN8 mRNA表達(dá)水平比較。

A.腎小管；B.腎小球。

A.腎小管；B.腎小球。

圖5 基于In-house TMA數(shù)據(jù)集的CLDN8蛋白表達(dá)水平比較

2.3數(shù)據(jù)集分析結(jié)果 各數(shù)據(jù)集存在顯著異質(zhì)性(I2=82.4%，P<0.000 1),采用隨機效應(yīng)模型分析。GSE11151、GSE15641、GSE26574、TCGA-GTEx、In-house TMA數(shù)據(jù)集SMD分別為1.27(95%CI：-0.21～2.74)、0.41(95%CI：-0.50～1.31)、0.46(95%CI：-0.48～1.40)、1.01(95%CI：0.69～1.33)、4.12(95%CI：2.74～5.49)。5個數(shù)據(jù)集合并SMD為1.33(95%CI：0.39～2.27)。Deeks′漏斗圖和Egger′s檢驗顯示，各數(shù)據(jù)集不存在發(fā)表偏倚(P>0.05)。見圖6。CLDN8診斷chRCC的sROC曲線AUC為0.93(95%CI：0.90～0.95)，靈敏度為0.86(95%CI：0.70～0.94)，特異度為0.87(95%CI：0.71～0.95)，陽性似然比為6.78(95%CI：2.53～18.15)，陰性似然比為0.17(95%CI：0.07～0.39)。見圖7、表1。

表1 各數(shù)據(jù)集靈敏度、特異度、陽性和陰性似然比

續(xù)表1 各數(shù)據(jù)集靈敏度、特異度、陽性和陰性似然比

A.Deeks′漏斗圖；B.Egger′s漏斗圖。

A～E.不同數(shù)據(jù)集的ROC曲線；F.sROC曲線(①為GSE11151，②為GSE15641，③為GSE26574，④為TCGA-GTEx，⑤為In-house TMA)。

3 討 論

chRCC是常見的腎腫瘤亞型，約占腎腫瘤患者的5%[14]，目前臨床仍以病理學(xué)診斷方法確診。隨著測序技術(shù)及分子靶向治療的發(fā)展，生物學(xué)標(biāo)記物成為當(dāng)前臨床診斷的發(fā)展方向。CLDN8在構(gòu)建細(xì)胞緊密連接、維持細(xì)胞屏障功能、細(xì)胞間分子傳遞過程中發(fā)揮重要作用，近年來被認(rèn)為與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[15]。本研究不僅從mRNA水平分析了CLDN8在chRCC中的表達(dá)水平，而且驗證了CLDN8蛋白的異常表達(dá)。

共85例chRCC樣本和149例對照樣本的mRNA測序數(shù)據(jù)用于檢測CLDN8在轉(zhuǎn)錄組水平的表達(dá)差異，11例chRCC樣本與16例對照樣本用于CLDN8蛋白驗證。本研究結(jié)果顯示，TCGA-GTEx、In-house TMA數(shù)據(jù)集中CLDN8在chRCC組織中具有顯著上調(diào)趨勢(P<0.000 1)，GSE11151、GSE15641、GSE26574 3個數(shù)據(jù)集中CLDN8表達(dá)上調(diào)差異不顯著，其原因可能是樣本量不足所致。本研究結(jié)果顯示，CLDN8診斷chRCC的sROC曲線AUC為0.93，靈敏度為0.86，特異度為0.87，陽性似然比為6.78，陰性似然比為0.17。提示對于chRCC，CLDN8具有較高的診斷效能。已有研究證明，CLDN8上調(diào)與多種惡性腫瘤相關(guān)，其在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，可能通過MAPK/ERK信號通路促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展[10]。ASHIKARI等[9]研究認(rèn)為，CLDN8是雄激素調(diào)節(jié)基因，可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增生和轉(zhuǎn)移。此外，miR-361-5p通過靶向抑制CLDN8的表達(dá)可抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤[16]。本研究結(jié)果顯示，CLDN8在chRCC中呈異常高表達(dá)趨勢，但其具體機制未知。提示，CLDN8在chRCC中上調(diào)，可能參與了chRCC的發(fā)展進(jìn)程。

綜上所述，CLDN8高表達(dá)可能與chRCC形成與進(jìn)展相關(guān)。本研究存在一定局限性：如納入樣本數(shù)不多、異質(zhì)性來源不清楚、沒有明確揭示CLDN8參與chRCC的機制。未來需要更多的研究來揭示CLDN8在chRCC中異常高表達(dá)的分子機制。