基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討隔山消積顆粒治療功能性消化不良的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制*

潘大波 ，姜德文 ，龍治峰 ，李小飄 ，王小霞 ，何文生

（1. 黔東南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 凱里 556001； 2. 重慶市大足區(qū)人民醫(yī)院，重慶 402360）

功能性消化不良（FD）是常見的功能性胃腸道疾病，多表現(xiàn)為早飽、上腹痛等［1］，在普通人群中的發(fā)病率為5%～20%［2］。FD 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病程較長，易反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［3］。中醫(yī)認(rèn)為，F(xiàn)D 與“胃脘痛”“胃痞”“胃滿”的臨床癥狀相似。中醫(yī)治療FD 臨床療效顯著，中藥較緩和，長期服藥毒副作用小，患者臨床癥狀改善明顯［4］。目前，用于治療FD的中藥方劑有三仁湯、半夏瀉心湯、復(fù)方藏茴香和枳實(shí)消痞丸等。苗藥復(fù)方隔山消積顆粒（以下簡稱苗藥復(fù)方）由隔山消和馬蘭草2 味苗藥配伍。方中，隔山消具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、益精血、健脾消食、解毒療瘡功效；馬蘭草又名魚鰍串、路邊菊等，有理氣、消食、清利濕熱之功效，用于治療胃脘脹痛、痢疾、水瀉、尿路感染等。本研究中采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，從苗藥復(fù)方多成分、多靶標(biāo)的視角闡明其治療FD 的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制，為后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 活性成分篩選

通過SciFiner、中國知網(wǎng)、萬方、維普數(shù)據(jù)庫檢索獲取苗藥復(fù)方中隔山消、馬蘭草的化學(xué)成分。隔山消Cynanchum wilfordii是蘿藦科鵝絨藤屬植物，其基源植物有耳葉牛皮消Cynanchum auriculumRoyle ex Weight.、隔山 牛 皮 消Cynanchum wilfordii（Maxim.）Hemsl和戟葉牛皮消Cynanchum bungei，且隔山消與傳統(tǒng)中藥白首烏的主要來源一致，故以“隔山消”“Cynan?chum wilfordii”“ 耳 葉牛 皮消 ”“ 隔山 牛皮 消 ”“戟 葉 牛皮消”“白首烏”為關(guān)鍵詞檢索獲取隔山消的化學(xué)成分；馬蘭草為馬蘭Kalimeris indica（L.）Sch - Bip 的干燥全草，故以“馬蘭”“Kalimeris indica”“馬蘭草”為關(guān)鍵詞檢索獲取馬蘭草的化學(xué)成分。運(yùn)用ADMETlab 2.0 軟件（https：// admetmesh. scbdd. com/）［5］在線預(yù)測其化學(xué)成分的性質(zhì)，選取人體腸道吸收（HIA）在0～3 且符合Lipinski Rule（MW ≤ 500，logP ≤ 5，Hacc ≤ 10，Hdon ≤ 5，滿足3個(gè)及以上條件）的化學(xué)成分作為苗藥復(fù)方的活性成分。

1.2 活性成分靶標(biāo)預(yù)測及FD 疾病靶標(biāo)

采用基于配體的靶標(biāo)預(yù)測在線服務(wù)器SwissTarget?Prediction［6］預(yù)測苗藥復(fù)方活性成分的作用靶標(biāo)。以“Functional dyspepsia”作為關(guān)鍵詞，分別在GenCLip 3數(shù)據(jù)庫（http：//ci.smu.edu.cn/genclip3/analysis.php）［7］和 GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：// www. genecards. org/）［8］檢索收集靶標(biāo)，合并去重后運(yùn)用Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）校正整合，獲得FD 相關(guān)靶標(biāo)。將FD疾病靶標(biāo)與苗藥復(fù)方活性成分作用靶標(biāo)進(jìn)行疊合，獲得苗藥復(fù)方活性成分治療FD的靶標(biāo)。

1.3 藥味-活性成分-治療FD 靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)

將獲得的苗藥復(fù)方活性成分治療FD 的靶標(biāo)映射到相應(yīng)活性成分中，獲得活性成分與其對應(yīng)治療FD 靶標(biāo)信息。采用Cytoscape 3.8軟件［9］構(gòu)建苗藥復(fù)方藥味-活性成分 - 靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)用插件Centi?ScaPe2.2 分析，提取網(wǎng)絡(luò)中度值大于中介值的節(jié)點(diǎn)作為關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，即苗藥復(fù)方治療FD 的關(guān)鍵活性成分及關(guān)鍵作用靶標(biāo)。

1.4 關(guān)鍵靶標(biāo)-靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將獲得的苗藥復(fù)方治療FD 的關(guān)鍵作用靶標(biāo)導(dǎo)入String 11.5 數(shù)據(jù)庫（https：/ /string-db.org/）［10］，預(yù)測靶標(biāo)與靶標(biāo)間的相互作用，選取有證據(jù)的相互作用進(jìn)行分析。運(yùn)用Cytoscape 3.8軟件進(jìn)行可視化顯示。

1.5 關(guān)鍵靶標(biāo)GO 聚類分析和KEGG 通路富集分析

將獲得苗藥復(fù)方治療FD 的關(guān)鍵作用靶標(biāo)導(dǎo)入David 6.8 數(shù)據(jù)庫（https：// david. ncifcrf. gov/）［11］進(jìn)行GO 聚類分析和KEGG 通路富集分析。選取同時(shí)≥4 個(gè)基因且P<0.05的項(xiàng)目進(jìn)行分析。

1.6 分子對接

選取度值排名靠前的苗藥復(fù)方治療FD 的關(guān)鍵作用靶標(biāo)，運(yùn)用Autodock vina 軟件［12］將苗藥復(fù)方活性成分對接到上述靶標(biāo)中，考察活性成分與靶標(biāo)的結(jié)合親和力及作用模式，對接打分熱圖用TBtools［13］顯示。

2 結(jié)果

2.1 活性成分及其作用靶標(biāo)

通過文獻(xiàn)檢索，收集到隔山消和馬蘭草的化學(xué)成分分別為116個(gè)和114個(gè)。隔山消的化學(xué)成分主要為C21甾苷類、多糖類、苯酮類等，馬蘭草的化學(xué)成分主要為黃酮類、酚酸類、三萜類、揮發(fā)油等。采用Chemdraw 2015軟件繪制上述化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)并用ADMETlab 2.0軟件在線預(yù)測其性質(zhì)，選取HIA 在0～3 且符合Lipinski Rule（MW ≤ 500，logP ≤ 5，Hacc ≤ 10，Hdon ≤ 5，滿足3個(gè)及以上條件）的化合物。符合條件的隔山消和馬蘭草的化學(xué)成分分別有35 個(gè)和71 個(gè)，其中1 個(gè)活性成分（β-谷甾醇）相同，即得到105個(gè)苗藥復(fù)方活性成分。

采用SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫預(yù)測其作用靶標(biāo)，4 個(gè)化學(xué)成分（Diallyl carbonate，cynabungolide，coniferylalcohol和3，7，11-trimethyl-1，6-dodecadien-3，10，11 - triol）未預(yù)測到靶標(biāo)，共作用于 821 個(gè)靶標(biāo)，即101個(gè)化學(xué)成分作用于821個(gè)靶標(biāo)。

2.2 FD 相關(guān)靶標(biāo)

運(yùn)用“Functional dyspepsia”作為關(guān)鍵詞在GenCLiP 3數(shù)據(jù)庫中檢索到127 個(gè)靶標(biāo)、GeneCard 數(shù)據(jù)庫中大于Relevance score 中介值（2.87）的靶標(biāo) 1 267 個(gè)，Uniprot數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)化且去重后得到FD 相關(guān)靶標(biāo)1 304 個(gè)。將FD 相關(guān)靶標(biāo)與苗藥復(fù)方活性成分預(yù)測靶標(biāo)疊合，得到共有靶標(biāo)293 個(gè)（圖1），即293 個(gè)靶標(biāo)可能是苗藥復(fù)方治療FD的作用靶標(biāo)。

圖1 苗藥復(fù)方活性成分預(yù)測靶標(biāo)與FD相關(guān)靶標(biāo)韋恩圖Fig.1 Venn diagram of predicted targets of active ingredients of Miao medicine compound Geshan Xiaoji Granules and FD - related targets

2.3 藥味-活性成分-靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)

將2.2 項(xiàng)下的共有靶標(biāo)映射到100 個(gè)活性成分（其中1 個(gè)活性成分未找到），即苗藥復(fù)方的100 個(gè)活性成分通過作用于293 個(gè)靶標(biāo)發(fā)揮治療FD 作用。獲得由2 442 條邊、395 個(gè)節(jié)點(diǎn)（其中，藥味 2 個(gè)、活性成分 100個(gè)、靶標(biāo)293 個(gè)）組成的苗藥復(fù)方藥味-活性成分-靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)。

度值不低于40的活性成分有20個(gè)（表1），其中來源于隔山消8個(gè)、馬蘭草12個(gè)。度值排名前10的化學(xué)成分有12-O-ikemaoyl-20-dihydro-lineolon、告達(dá)亭、芫花素、開德苷元、羅索他明、漢黃芩素、千層紙素A、山柰酚-7-葡萄糖苷、methyltrans-ferulate和加加米寧。

表1 度值不低于40的活性成分Tab.1 Active ingredients with a degree ≥40

度值不低于22 的靶標(biāo)有20 個(gè)（表2），度值排名前10 的靶標(biāo)為細(xì)胞色素P450 19A1（CYP19A1）、雄激素受體（AR）、碳酸酐酶Ⅱ（CA2）、雌激素受體β（ESR2）、睪丸特異性雄激素結(jié)合蛋白（SHBG）、雌激素受體α（ESR1）、HMG-CoA 還原酶（HMGCR）、花生四烯酸5-脂肪氧化酶（ALOX5）、聚［ADP - 核糖］聚合酶 - 1（PARP1）和乙酰膽堿酯酶（ACHE）。選取度值大于中介值（12.364 5）的節(jié)點(diǎn)作為關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，提取關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)間的相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖2），共2 個(gè)藥味、70 個(gè)化學(xué)成分、61 個(gè)靶標(biāo)和125 1條邊。

圖2 苗藥復(fù)方隔山消積顆粒藥味-活性成分-靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Drugs-active ingredients-targets interaction network of Miao medicine compound Geshan Xiaoji Granules

表2 度值不低于22的靶標(biāo)Tab.2 Targets with a degree ≥22

2.4 靶標(biāo)- 靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)

將61個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)導(dǎo)入Srting數(shù)據(jù)庫，用Centoscape 3.8軟件繪制靶標(biāo)- 靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖3）。度值大于20 的靶標(biāo)有17 個(gè)，排名靠前的有表皮生長因子受體（EGFR）、酪氨酸蛋白激酶（SRC）和環(huán)加氧酶2（PTGS2）等。

圖3 靶標(biāo)-靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Targets-targets interaction network

2.5 靶標(biāo)功能GO 聚類分析和KEGG 通路富集分析

將從苗藥復(fù)方藥味-化學(xué)成分-靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)提取的61個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)導(dǎo)入David數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO功能聚類和KEGG通路富集分析，滿足≥4個(gè)基因且P<0.05的細(xì)胞組成（CC）、生物過程（BP）和分子功能（MF）的分別得到18，74，35條項(xiàng)目。CC 主要集中在nucleus（核）和nucleoplasm（核質(zhì)）等，BP主要集中在signal transduction（信號轉(zhuǎn)導(dǎo)）和negative regulation of apoptotic process（凋亡過程的負(fù)調(diào)控）等，MF 主要集中在protein binding（蛋白質(zhì)結(jié)合）和ATP binding（ATP 結(jié)合）等，苗藥復(fù)方關(guān)鍵作用靶標(biāo)的GO 聚類分析見圖4。提示苗藥復(fù)方活性成分通過作用于細(xì)胞核、細(xì)胞核質(zhì)及細(xì)胞膜等影響能量代謝、蛋白結(jié)合等，調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白質(zhì)磷酸化等，達(dá)到治療FD的目的。

圖4 苗藥復(fù)方關(guān)鍵作用靶標(biāo)的GO聚類分析Fig.4 GO clustering analysis of key targets of Miao medicine compound Geshan Xiaoji Granules

滿足 ≥ 4 個(gè)基因且P<0.05 的 KEGG 通路有 85 條，其中與FD 相關(guān)的靶標(biāo)調(diào)控的通路為Fc γ R 介導(dǎo)的吞噬作用（Fc gamma R-mediated phagocytosis）、逆行內(nèi)源性大麻素信號（retrograde endocannabinoid signaling）、膽堿能突觸（cholinergic synapse）、Toll 樣受體信號通路（toll-like receptor signaling pathway）、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（natural killer cell mediated cytotoxicity）、TRP 通道的炎性介質(zhì)調(diào)節(jié)（inflammatory mediator regula?tion of TRP channels）和花生四烯酸代謝（arachidonic acid metabolism）等。苗藥治療FD 的KEGG 通路富集分析結(jié)果見圖5。

圖5 苗藥復(fù)方治療FD的KEGG 通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis of Miao medicine compound Geshan Xiaoji Granules in the treatment of FD

2.6 分子對接分析

選取苗藥復(fù)方藥味-活性成分-靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)中靶標(biāo)度值較大，且與目前研究發(fā)現(xiàn)FD 的發(fā)病因素關(guān)系較大的靶標(biāo)CA2，HMGCR，ALOX5，PTGS2，ACHE作為受體（表3），將苗藥復(fù)方活性成分作為配體對接到受體中，分子對接打分熱圖見圖6。

圖6 苗藥復(fù)方活性成分分子對接打分熱圖Fig.6 Heat map of the molecular docking scoring of active ingredients of Miao medicine compound Geshan Xiaoji Granules

表3 分子對接的FD相關(guān)的靶標(biāo)蛋白Tab.3 FD-related target proteins in the molecular docking

對接打分低于-8.0 kcal/mol的活性成分-靶標(biāo)作用有119 對，其中打分最好的是活性成分cynandione E（白首烏酮E）與ACHE 間的作用，為 - 11.4 kcal/ mol。為進(jìn)一步探討靶標(biāo)與活性成分的相互作用模式，分別選取每個(gè)靶標(biāo)與活性成分打分最優(yōu)的組合進(jìn)行分析（圖7）。

與CA2 結(jié)合最好的活性成分為加加米寧，對接打分為 - 9.3 kcal/ mol。加加米寧（gagamine）與 CA2 和THR200 形成 1 個(gè)氫鍵、ASN62 側(cè)鏈氨基形成 2 個(gè)氫鍵、ASN67側(cè)鏈羰基形成2個(gè)氫鍵，共5個(gè)氫鍵，與HIS64和HIS94 形成π - π 堆積作用（圖7 A）。在HMG - CoA 還原酶體系中，與青陽參苷元（qingyangshengenin）對接打分為- 8.8 kcal/ mol。由于青陽參苷元含有羥基較多，與HMG-CoA 形成很強(qiáng)的極性相互作用，共存在11 個(gè)氫鍵（圖7 B）。α-香樹脂醇（α-amyrin）嵌入ALOX5口袋中，與ASN554形成2個(gè)氫鍵（圖7 C）。cynandione E 與ACHE 的對接打分為 - 11.4 kcal/ mol。cynandione E 占據(jù)ACHE的2個(gè)活性空腔，且在2個(gè)空腔均與ACHE有氫鍵作用，即與SER293，PHE295，TYR341，THR75形成5個(gè)氫鍵（圖7 D）。大黃酚（chrysophanol）很好嵌入PTGS2 活性口袋中，與SER530和TYR355形成2個(gè)氫鍵（圖7 E）。

圖7 苗藥復(fù)方活性成分與靶標(biāo)作用分子對接模式Fig.7 Molecular docking mode of the active ingredients of Miao medicine compound Geshan Xiaoji Granules and targets

3 討論

研究表明，F(xiàn)D的發(fā)病原因包括胃腸動力障礙、內(nèi)臟高敏感性、腦- 腸軸功能紊亂、精神心理因素、十二指腸黏膜屏障受損、低度炎癥和腸道菌群失調(diào)等。苗藥復(fù)方由苗族常用藥隔山消和馬蘭草配伍，采用水煎煮制備而成，具有消積行氣功效，用于脾胃氣滯所致的食積內(nèi)停、脘腹脹痛等。

本研究結(jié)果顯示，苗藥復(fù)方隔山消積顆粒中有100個(gè)活性成分與FD 相關(guān)的293 個(gè)靶標(biāo)作用。上述靶標(biāo)主要 集 中 在 AR，ESR2，ESR1，CA2，HMGCR，ALOX5，ACHE 等。其中，AR 能通過調(diào)控 Bmp 分泌，調(diào)控 Wnt 信號而控制腸干細(xì)胞增殖［14］；ESR1 和 ESR2 與胃食管反流病、食管癌、消化性潰瘍、胃癌、炎性腸病、腸易激綜合征和結(jié)腸癌的發(fā)生關(guān)系密切［15］；CA2 主要分布在胃腸道、腎遠(yuǎn)曲小管等，與消化系統(tǒng)炎癥相關(guān)［16］；HMGCR抑制劑對幽門螺桿菌誘導(dǎo)的胃炎模型小鼠具有抗炎作用［17］；ALOX5是花生四烯酸合成白三烯的關(guān)鍵酶，產(chǎn)物白三烯與炎性疾病密切相關(guān)，包括胃炎、哮喘等［18］；ACHE 抑制劑阿考替胺能通過抑制ACHE 的活性來增強(qiáng)胃肌肉收縮，提高胃動力［19］。選擇性PTGS2抑制劑不影響胃十二指腸黏膜，同時(shí)具有與非選擇性非甾體抗炎藥（NSAID）相似的抗炎和鎮(zhèn)痛功效［20］。上述靶標(biāo)主要調(diào)控幽門螺桿菌感染中的上皮細(xì)胞信號傳導(dǎo)、膽堿能突觸、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路和花生四烯酸代謝等通路，涉及炎癥、腦- 腸軸功能紊亂、精神心理因素等，與FD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

由表1可知，苗藥復(fù)方活性成分-靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)獲得度值大于40的20個(gè)活性成分有告達(dá)亭、開德苷元、加加米寧、漢黃芩素、neoechinulin A和大黃素甲醚。其中，告達(dá)亭在隔山消的含量為（1.354 ± 0.609）μg/g［21］，從5.7 kg 耳葉牛皮消中可提取80 mg 告達(dá)亭、32 mg 開德苷元和 50 mg 加加米寧［22］；從 20 kg 馬蘭全草中可提取漢黃芩素22 mg、千層紙素A 6 mg、7，4'-二羥基異黃酮10 mg［23］；從 15 kg 馬蘭全草中可提取芫花素 22 mg、aurantiamide金色酰胺醇10.5 mg、neoechinulin A 16.3 mg、鄰苯二甲酸二丁酯 5.6 mg、大黃素甲醚 53.4 mg［24-26］；從11 kg 馬蘭中可提取山柰酚-7-葡萄糖苷3.31 ng、methyltrans- ferulate 3.8 mg、槲皮素 6.3 mg、山柰酚5.7 mg［27］。在隔山消或馬蘭草中的含量較大，均超過1 mg/kg，可能是苗藥復(fù)方的特異性成分。

隔山消中的C21甾苷類活性成分在治療FD中起著關(guān)鍵作用。白首烏提取物能調(diào)控Toll 樣受體4/骨髓分化因子88/核轉(zhuǎn)錄因子κB（TLR4/MyD88/NF- κB）信號通路，抑制炎性反應(yīng)［28］。C21 甾苷類成分能上調(diào)核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）和血紅素氧合酶 - 1（HO - 1），抑制H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷和炎性反應(yīng)，其中告達(dá)亭能減輕肝中的炎性癥狀，下調(diào)白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）和單核細(xì)胞趨化因子的表達(dá)［29］。加加米寧抑制脂質(zhì)過氧化物的形成，具抗氧化性［30］，且抑制5 - 脂肪氧化酶的半數(shù)抑制率（IC50）為26 μmol/ L。千層紙素A 通過保護(hù)腸黏膜和改變腸道微生物群來緩解結(jié)腸炎［31］。馬蘭草中的漢黃芩素激活Nrf2，促進(jìn)抗氧化酶包括醌氧化還原酶-1（NQO-1）、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）、HO-1、超氧化物歧化酶1（SOD1）和超氧化物歧化酶2（SOD2）在肝細(xì)胞中的表達(dá)，并抑制NF-κB 調(diào)節(jié)的促炎信號傳導(dǎo)，即通過激活Nrf2 的同時(shí)改善氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)［32］。槲皮素可抑制ERK和p38MAPK 的磷酸化，穩(wěn)定 NF - κB/IκB 而阻止IκB 的脫落，抑制下游IL - 1β，IL - 6，TNF - α，NO/ iNOS 的表達(dá)，降低炎性因子的水平，同時(shí)能抑制COX - 2 的表達(dá)［33］。Cynan?dione A 通過調(diào)控 α7 - nAChR 依賴性 IL - 10/ β - 內(nèi)啡肽信號通路抑制神經(jīng)性疼痛［34］。隔山消積顆粒的活性成分通過作用于胃腸道炎性相關(guān)靶點(diǎn)IL-6，IL-1β，TNF - α，5 - 脂肪氧化酶，ESR2，ESR1，CA2，AR，HMGCR和ALOX5等，促進(jìn)胃動力靶點(diǎn)和神經(jīng)調(diào)控靶點(diǎn)ACHE等，通過調(diào)控炎性信號通道TLR4/MyD88/NF-κB、腦- 腸軸功能紊亂、胃腸動力障礙和精神心理因素等相關(guān)通路達(dá)到治療FD的作用。