血液標(biāo)本處理方式對(duì)IL-6、IL-10、IFN-γ和IL-2檢測(cè)結(jié)果的影響*

朱鈺力，談運(yùn)長(zhǎng)，汪 紅，毛衛(wèi)未，周會(huì)祥，胡志堅(jiān)，徐 煒△

九江學(xué)院附屬醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.胃腸外科,江西九江332000

血液中細(xì)胞因子是診斷疾病、監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)和疾病進(jìn)展的重要生物標(biāo)志物[1-4]。然而，血液中的細(xì)胞因子往往呈低水平狀態(tài)，標(biāo)本處理對(duì)血漿細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果會(huì)產(chǎn)生重大的影響[5]。有研究顯示，在血漿從全血分離之前，白細(xì)胞可以在體外繼續(xù)分泌細(xì)胞因子并改變其在血漿中的水平[6]。此外，血小板活化可能伴有細(xì)胞因子的釋放，可能導(dǎo)致血漿中細(xì)胞因子水平明顯升高[6]；細(xì)胞因子的穩(wěn)定性也可能對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生重大的影響，如一些細(xì)胞因子的半衰期特別短，溫度不穩(wěn)定，容易被蛋白降解[7]。因此，探討合適的血漿細(xì)胞因子檢測(cè)的標(biāo)本處理方法具有重要的意義。

1 資料與方法

1.1血液標(biāo)本的采集 本研究使用的血液標(biāo)本來(lái)自本院就診的30例志愿者，本研究中的血液離心均為室溫下3 000 r/min離心20 min。每位志愿者的全血標(biāo)本被分裝到1～7號(hào)乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，其中1號(hào)試管全血標(biāo)本被采集后立即3 000 r/min離心20 min，取血漿0.5 mL，并檢測(cè)血漿中白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-10、γ干擾素(IFN-γ)和IL-2水平，作為對(duì)照組，2～6號(hào)試管的血液標(biāo)本根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求給予不同的處理。所有志愿者簽署知情同意書(shū)，該研究得到了九江學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1全血在室溫(25 ℃)或4 ℃保存下的處理方法 為檢測(cè)在室溫或4 ℃保存下全血中細(xì)胞因子的穩(wěn)定性，每位志愿者的2號(hào)試管全血于室溫下保存，3號(hào)試管全血于4 ℃下保存，保存6、12、24 h后取出部分全血，離心取血漿，檢測(cè)血漿中的IL-6、IL-10、IFN-γ和IL-2水平。

1.2.2血漿在室溫或4 ℃保存下的處理方法 為檢測(cè)在室溫或4 ℃保存下血漿中細(xì)胞因子的穩(wěn)定性，每位志愿者的4、5號(hào)試管全血采集后立即離心收集血漿，血漿分別于室溫或4 ℃保存，保存6、12、24 h后取出血漿0.5 mL，并檢測(cè)IL-6、IL-10、IFN-γ和IL-2水平。

1.2.3強(qiáng)力處理導(dǎo)致輕度溶血的處理方法 為檢測(cè)強(qiáng)力處理后全血細(xì)胞因子的穩(wěn)定性，每位志愿者的6號(hào)試管全血在50 cm的距離左右反復(fù)搖動(dòng)，導(dǎo)致輕度溶血，然后離心收集血漿，檢測(cè)細(xì)胞因子的水平。

1.2.4反復(fù)凍融的處理方法 為檢測(cè)凍融對(duì)標(biāo)本細(xì)胞因子的影響，每位志愿者的7號(hào)試管全血采集后立即離心收集血漿，然后于-80 ℃冰凍，每8小時(shí)將血漿在室溫下解凍1 h后再次冷凍，該過(guò)程連續(xù)重復(fù)3次，然后測(cè)定血漿中IL-6、IL-10、IFN-γ和IL-2的水平。

1.2.5血漿細(xì)胞因子的檢測(cè)方法 人Th1/Th2/Th17亞群檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江西賽基生物技術(shù)有限公司，采用BD FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀按配套試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作流程檢測(cè)血漿中的細(xì)胞因子(IL-6、IL-10、IFN-γ和IL-2)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 7.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并繪制相應(yīng)圖表，呈非正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以M(P25,P75)表示，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1全血在室溫或4 ℃保存下細(xì)胞因子的穩(wěn)定性 與保存前比較，全血在室溫保存下4種細(xì)胞因子水平均有所下降，特別是保存12 h時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；全血在4 ℃保存時(shí)，4種細(xì)胞因子有較好的穩(wěn)定性，當(dāng)保存6、12 h時(shí)，4種細(xì)胞因子水平均較穩(wěn)定，與保存前比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；當(dāng)保存24 h時(shí)，IL-6、IFN-γ與保存前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 全血在室溫(25 ℃)或4 ℃保存下細(xì)胞因子的穩(wěn)定性[n=30,M(P25,P75)，pg/mL]

2.2血漿在室溫或4 ℃保存下細(xì)胞因子的穩(wěn)定性 血漿在常溫下保存12 h，4種細(xì)胞因子較保存前明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；血漿在4 ℃下保存有較好的穩(wěn)定性，當(dāng)保存24 h時(shí)，IFN-γ、IL-2水平較保存前下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 血漿在室溫(25 ℃)或4 ℃保存下細(xì)胞因子的穩(wěn)定性[n=30,M(P25,P75)，pg/mL]

2.3強(qiáng)力處理或反復(fù)凍融后全血細(xì)胞因子的穩(wěn)定性 與保存前比較，強(qiáng)力處理或反復(fù)冰融后血漿4種細(xì)胞因子IL-6、IL-10、IFN-γ和IL-2水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 強(qiáng)力處理或反復(fù)凍融后全血細(xì)胞因子的穩(wěn)定性[n=30,M(P25,P75)，pg/mL]

3 討 論

細(xì)胞因子包括IL、IFN、生長(zhǎng)因子、趨化因子家族、腫瘤壞死因子、集落刺激因子、轉(zhuǎn)化因子家族及其他[8]。眾多細(xì)胞因子在體內(nèi)通過(guò)旁分泌、自分泌或內(nèi)分泌等方式發(fā)揮作用，具有高效性、協(xié)同性、拮抗性等多種生理特性，形成了十分復(fù)雜的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，參與人體多種重要的生理功能[9]。多項(xiàng)研究顯示，血液中細(xì)胞因子表達(dá)水平變化具有重要的生物學(xué)意義，使其成為診斷疾病、監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)和疾病進(jìn)展的重要生物標(biāo)志物[10-13]。

汪廉等[10]研究顯示，Th2類(lèi)細(xì)胞因子是毛細(xì)支氣管炎嚴(yán)重程度的影響因素，IL-35及Th2類(lèi)細(xì)胞因子可用于輔助判斷毛細(xì)支氣管炎的嚴(yán)重程度。SINGH等[11]通過(guò)對(duì)PubMed、Medline和Google Scholar數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，對(duì)19篇符合納入標(biāo)準(zhǔn)的文章進(jìn)行系統(tǒng)分析，結(jié)果顯示患者血液中細(xì)胞因子水平可能是前列腺癌急性放射治療誘導(dǎo)毒性的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物，以及腫瘤組織中細(xì)胞因子的過(guò)度表達(dá)可能成為前列腺癌患者臨床預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)。GUNAWARDENE等[12]的一項(xiàng)Meta分析也顯示，多種細(xì)胞因子綜合評(píng)分有可能成為結(jié)直腸癌的預(yù)后指標(biāo)。

一方面，全血含有可以分泌細(xì)胞因子的白細(xì)胞，這可能導(dǎo)致細(xì)胞因子水平升高；另一方面，淋巴細(xì)胞來(lái)源的可溶性受體結(jié)合可能導(dǎo)致細(xì)胞因子水平降低[14]。全血中細(xì)胞因子的降解或不穩(wěn)定也可能導(dǎo)致細(xì)胞因子水平下降。在本研究中，全血在室溫或4 ℃下儲(chǔ)存6、12或24 h后，檢測(cè)其IL-6、IL-10、IFN-γ和IL-2水平，結(jié)果顯示，與保存前比較，全血在室溫下保存12 h，4種細(xì)胞因子的水平均顯著下降(P<0.05)；全血在4 ℃下保存時(shí)，4種細(xì)胞因子水平相對(duì)穩(wěn)定，當(dāng)保存24 h時(shí)，僅有IL-6、IFN-γ水平較保存前明顯下降(P<0.05)。這提示在室溫下儲(chǔ)存全血可能影響細(xì)胞因子的測(cè)量結(jié)果。

本研究進(jìn)一步評(píng)估了血漿在室溫或4 ℃下保存下的細(xì)胞因子穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，血漿4 ℃下保存，血漿中IL-6、IL-10、IFN-γ和IL-2的穩(wěn)定性較好。因此，為了防止由于標(biāo)本處理方式而導(dǎo)致的細(xì)胞因子測(cè)量的變化，全血采集后盡快離心成血漿，并在冷藏下保存。

在臨床實(shí)驗(yàn)室中，血液標(biāo)本常常是通過(guò)人工或運(yùn)輸系統(tǒng)送到臨床實(shí)驗(yàn)室。在運(yùn)輸過(guò)程中，血液標(biāo)本受到不同的氣壓、加速、減速和振動(dòng)的影響，細(xì)胞因子水平可能發(fā)生變化。本研究通過(guò)左右反復(fù)搖擺模擬強(qiáng)力處理導(dǎo)致輕度溶血，然后檢測(cè)血漿IL-6、IL-10、IFN和IL-2水平，結(jié)果顯示，保存前和強(qiáng)力處理或反復(fù)凍融后細(xì)胞因子水平變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在實(shí)際工作中，有些冰凍的標(biāo)本可能需要再次檢測(cè)，研究結(jié)果顯示，當(dāng)血漿標(biāo)本經(jīng)過(guò)3次凍融后，IL-6、IL-10、IFN-γ和IL-2水平是相對(duì)穩(wěn)定的。

全血采集后應(yīng)盡快離心成血漿，并在冷藏下保存，如果在室溫下保存，血液標(biāo)本應(yīng)在抽取后6 h內(nèi)進(jìn)行處理；如果在4 ℃下保存，血液標(biāo)本應(yīng)在抽取后24 h內(nèi)進(jìn)行處理。