胎兒α-地中海貧血無(wú)創(chuàng)基因檢測(cè)的臨床可行性研究*

劉 潔，王曉賢，林雨虹，林 偉

福建醫(yī)科大學(xué)附屬福州市第一醫(yī)院，福建 福州 350009

地中海貧血（以下簡(jiǎn)稱地貧）是一種遺傳性溶血性疾病，它的發(fā)病原因?yàn)橹榈鞍谆蛉毕?，進(jìn)而引起血紅蛋白合成障礙導(dǎo)致貧血，是世界上發(fā)病率最高的單基因遺傳疾病。地貧主要分布在包括我國(guó)南方在內(nèi)的世界上熱帶和亞熱帶瘧疾高發(fā)地區(qū)［1］，福建省地貧總攜帶率為4.41%，其中，α-地貧占72.4%［2］。

地貧根據(jù)其基因改變的類型不同，主要分為α-地貧和β-地貧。β-地貧主要由β基因的點(diǎn)突變所致。α-地貧又分為缺失型α-地貧和非缺失型α-地貧，α-地貧大多數(shù)是由于α珠蛋白基因的缺失所致，即缺失型α-地貧,常見的變異類型有-α3.7/、-α4.2/、--SEA/；α-地貧少數(shù)由基因點(diǎn)突變?cè)斐杉捶侨笔挺?地貧,常見的變異類型有αWSα、αCSα、αQSα［3-5］。α-地貧表型的嚴(yán)重程度與染色體的單倍型密切相關(guān)，其中，兩個(gè)α基因都發(fā)生變異的疾病表型程度嚴(yán)重一些，輕者可無(wú)臨床癥狀，重者可致死、致殘、因而嚴(yán)重威脅人類健康。此外，部分點(diǎn)突變導(dǎo)致的α-地貧（如HbCS、HbQS）合并輕型α-地貧（--/α）表型加重，即（--/αCSα）和（--/αQSα）可能比（--/-α）更嚴(yán)重［6］。其中，巴氏胎兒水腫綜合征為最常見遺傳病，該疾病是HBA基因中由純合SEA缺失（--/--）引起［7］。攜帶巴氏水腫胎的孕婦通常會(huì)增加圍產(chǎn)期并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，如先兆子癇和產(chǎn)后出血［8］，危害孕婦及胎兒健康。

目前，對(duì)于地貧的檢測(cè)主要是依賴絨毛活檢、羊水穿刺及臍血穿刺等有創(chuàng)方法獲得胎兒基因信息，檢測(cè)時(shí)間窗較窄、具有胎兒損傷風(fēng)險(xiǎn)、實(shí)驗(yàn)室診斷周期較長(zhǎng)、工作量大。因此，臨床上需要更早期、快速、精準(zhǔn)、無(wú)創(chuàng)、安全的檢測(cè)方法。盡管有報(bào)道［9-10］顯示，超聲方法可以發(fā)現(xiàn)巴氏水腫胎，但該指標(biāo)缺乏特異性，不能有效預(yù)測(cè)地中海貧血的發(fā)生。分子診斷方法仍是預(yù)測(cè)地中海貧血的首選方法，隨著無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查（non-invasive prenatal testing，NIPT）染色體異常的技術(shù)得以應(yīng)用和成熟，孕婦血漿中胎兒DNA成分成為檢測(cè)胎兒基因組的重要工具，相較于有創(chuàng)方法取樣更簡(jiǎn)便，更容易被接受。胎盤來(lái)源于母體血漿的游離胎兒DNA（circulation free fetal DNA，cffDNA）的存在，使得非侵入性工具的發(fā)展能夠從母體血液中檢測(cè)胎兒基因異常。目前，常見非整倍體（如唐氏綜合征）的NIPT在臨床上可用作篩查試驗(yàn)，其準(zhǔn)確率大于99.9%［11-12］。最近，NIPT也可用于某些基因組微缺失（如DiGeorge綜合征、Cri-du-chat綜合征）。因此，有望基于cffDNA開展對(duì)α-地貧基因進(jìn)行檢測(cè)，判斷胎兒的α-地貧基因型。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年10月—2021年4月福州市第一醫(yī)院就診及轉(zhuǎn)診的22個(gè)α-地貧基因攜帶家系的孕婦作為研究對(duì)象，所有家系均攜帶α-地貧基因突變，除去家系2、21和22外（表1），所有家系的胎兒均有患巴氏胎兒水腫綜合征的風(fēng)險(xiǎn)。本研究不影響孕婦自身的臨床檢查流程。

表1 22例家系中無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)與有創(chuàng)診斷結(jié)果情況

1.2 方法

1.2.1 孕婦及其配偶血液采集和處理 用EDTA抗凝采血管從孕婦和其丈夫前臂收集2 mL外周血，參照地貧基因檢測(cè)試劑盒（PCR-反向點(diǎn)雜交法）（亞能生物）說(shuō)明書，檢測(cè)孕婦及其丈夫的地貧基因型。此外，在孕婦抽取羊水前，用EDTA抗凝采血管從孕婦前臂收集5mL外周血。采血后3 h內(nèi)在4℃下進(jìn)行兩次1 600 g離心10min的方法分離血漿，然后取其中1.2 mL血漿，使用MagPure circulating DNA kit提取游離DNA，然后在-80℃下保存。

1.2.2 羊水標(biāo)本采集和處理 入組孕婦在妊娠16～22周時(shí)，行羊膜腔穿刺術(shù)，抽取20 mL羊水。參照地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒（PCR-反向點(diǎn)雜交法）（亞能生物）說(shuō)明書，檢測(cè)胎兒地貧基因型。1.2.3 胎兒無(wú)創(chuàng)性地貧基因檢測(cè) 從冰箱取出游離DNA，根據(jù)Ion Plus Fragment library kit（Thermo-Fisher Scientific）說(shuō)明書進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，在文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中使用帶有8-bp隨機(jī)標(biāo)簽［13-14］的接頭替代原有接頭。采用特定區(qū)域捕獲探針富集文庫(kù)，捕獲區(qū)域中包含HBA和HBB區(qū)域，以及全基因組上2 088個(gè)質(zhì)控SNP位點(diǎn)。使用定量試劑和QPCR定量擴(kuò)增儀（ABI公司StepOnePlus）對(duì)文庫(kù)DNA進(jìn)行定量，得到文庫(kù)濃度。隨后在博奧生物的BES4000基因測(cè)序平臺(tái)完成測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)下機(jī)后，過(guò)濾短序列和低質(zhì)量數(shù)據(jù)，然后使用BWA軟件比對(duì)到參考基因組（hg19）。接著，根據(jù)公式1：RReadnumij=Readnumij×{50 0/R e a dn um，將目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以--SEA/αα孕婦懷有--SEA/αα胎兒的作為基線，應(yīng)用公式2：RReadnumij=Readnumij×R eadnumi/N]}，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化值。

根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)化值，應(yīng)用貝葉斯模型，公式3：PFn（A/Rationm）=[PFn（Ratiom/A）PFn（Ratiom/A）×PF（nRatiom/B）×PF（nRatiom/C）×PF（nC）]（Fetal fractiom∈Fn），計(jì)算胎兒為三種不同基因型（αα/αα，--SEA/αα，--/--）的P值，最終根據(jù)P值來(lái)判斷胎兒基因型。

2 結(jié)果

本研究中一共納入22個(gè)家系，其中19個(gè)家系中夫婦雙方α-地貧基因型均為--SEA/αα，2個(gè)家系中一方為-α3.7攜帶者，1個(gè)家系為點(diǎn)突變?chǔ)罳S攜帶者。夫婦雙方為--SEA/αα的家系中，按照孟德爾定律，其胎兒將有25%可能性患巴氏胎兒水腫綜合征。

應(yīng)用本研究中的方法，依據(jù)貝葉斯模型的P值，可以通過(guò)無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)的方法清楚判斷出胎兒為三種基因型（αα/αα，--SEA/αα，--/--），當(dāng)胎兒為其中基因型時(shí)，另外兩種基因型的P值則明顯降低。通過(guò)與產(chǎn)前診斷結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，本研究中無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)對(duì)胎兒地貧基因中所有缺失型的判斷，均與產(chǎn)前診斷結(jié)果保持一致，見表1。

除了能夠準(zhǔn)確判斷胎兒缺失型α-地貧的基因型外，本研究中還發(fā)現(xiàn)可以準(zhǔn)確判斷出父源的地貧點(diǎn)突變型。如家系21中，丈夫攜帶點(diǎn)突變?chǔ)罳S，而在無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)數(shù)據(jù)中，αQS對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的測(cè)序深度為198X，且100%均為野生型，可以推斷此胎兒不攜帶父源突變。如家系22中，父方攜帶βCD37/β0，母方攜帶βCD41-42/β0，而無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)結(jié)果提示，βCD37測(cè)序深度為268X，而全部均為野生型，推斷此胎兒不攜帶父源突變，若無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)結(jié)果提示，家系22不會(huì)生出重型地貧胎兒，可無(wú)需進(jìn)行產(chǎn)前診斷。

3 討論

孕期并發(fā)癥在攜帶巴氏水腫胎的孕婦中是很常見。羊水過(guò)多和早產(chǎn)經(jīng)常發(fā)生，其報(bào)告發(fā)病率分別高達(dá)29%和66%［15］。另一個(gè)與胎兒水腫相關(guān)的母體風(fēng)險(xiǎn)是鏡像綜合征，這是一種罕見但嚴(yán)重的疾病。Braun等［16］在文獻(xiàn)回顧中指出，在56例鏡像綜合征患者中，母親的主要發(fā)病率為肺水腫，占21%。重度先兆子癇有30%會(huì)發(fā)生母親與水腫胎兒共存。產(chǎn)前診斷是早期發(fā)現(xiàn)這種疾病風(fēng)險(xiǎn)的必要條件，可以通過(guò)有創(chuàng)性胎兒取樣或連續(xù)超聲檢測(cè)受累胎兒，然后進(jìn)行有創(chuàng)性檢測(cè)。而自從在母體血漿中發(fā)現(xiàn)cff-DNA以來(lái)，cff-DNA已被廣泛應(yīng)用，有望通過(guò)母體血漿中的胎兒DNA來(lái)無(wú)創(chuàng)性的檢測(cè)出這類疾病。

目前，利用cffDNA進(jìn)行地貧基因檢測(cè)的研究仍不多［17-18］。Ge等［19］對(duì)5對(duì)SEA缺失的雜合子α-地中海貧血父母進(jìn)行了384種不同條形碼的靶區(qū)捕獲測(cè)序。以母體血漿相對(duì)拷貝率為指標(biāo)，結(jié)合R-score和L-score分析，與正常對(duì)照組比較，實(shí)現(xiàn)了估計(jì)胎兒基因型信號(hào)。Wang等［20］對(duì)2個(gè)家族采用靶向捕獲測(cè)序和單倍型輔助分析方法，對(duì)東南亞缺失型α地中海貧血基因突變進(jìn)行了無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷。同時(shí)，也有團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用Taqman實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和熒光定量PCR檢測(cè)孕婦血漿進(jìn)行無(wú)創(chuàng)性檢測(cè)［21］。上述這些方法可以檢測(cè)或排除胎兒中不同于母體基因組的父系遺傳突變，或者評(píng)估相對(duì)突變劑量或相對(duì)單倍型劑量，最終實(shí)現(xiàn)胎兒地貧基因的無(wú)創(chuàng)性判讀。前面提到的研究已經(jīng)證明了用cffDNA篩查Bart胎兒水腫的潛力。

而本研究中，我們提出了一種基于目標(biāo)區(qū)域捕獲結(jié)合高通量測(cè)序的方法，可無(wú)創(chuàng)性地判斷胎兒患巴氏水腫綜合征的概率。巴氏胎兒水腫綜合征是由α-地貧基因同源20 kb純合缺失導(dǎo)致的。由于懷有Bart水腫胎的孕婦的等位基因本身是雜合子，她攜帶野生型等位基因和SEA缺失型等位基因的數(shù)量相等。從巴氏水腫胎傳給母體血漿的胎兒DNA僅含有SEA等位基因，會(huì)導(dǎo)致母體血漿中SEA等位基因總量增加，因此我們通過(guò)建立貝葉斯模型，可以根據(jù)讀取計(jì)數(shù)確定胎兒基因型。由于不同胎兒基因型對(duì)計(jì)數(shù)變化微小，我們通過(guò)一組2 088個(gè)高變異性SNP作為質(zhì)控，可以實(shí)現(xiàn)胎兒計(jì)數(shù)精確量化。結(jié)果表明，胎兒基因型的最終確定由胎兒分?jǐn)?shù)和基于貝葉斯模型的計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)組成，在所有22個(gè)家系中，均與產(chǎn)前診斷結(jié)果完全吻合，具有很高的準(zhǔn)確性。因此，有望通過(guò)本研究中的方法對(duì)巴氏胎兒水腫綜合征進(jìn)行無(wú)創(chuàng)性地產(chǎn)前檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)避免侵入性操作分析α-珠蛋白基因和排除連續(xù)超聲檢查，更重要的一點(diǎn)，由于胎兒游離DNA在6周的時(shí)候就可以在母體血漿中發(fā)現(xiàn)，理論上，無(wú)創(chuàng)性地產(chǎn)前檢測(cè)可以在妊娠6周進(jìn)行，早發(fā)現(xiàn)，早診斷。此外，本研究中還發(fā)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前檢測(cè)通過(guò)高深度的測(cè)序結(jié)果，可以輕松排除與母體不同的父源點(diǎn)突變。

綜上所述，我們有理由相信無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前檢測(cè)地貧基因，可以在判斷缺失型α地貧導(dǎo)致巴氏胎兒水腫綜合征，以及判斷夫婦雙方攜帶不同型地貧基因時(shí)，起到非常重要的作用，在孕早期獲得結(jié)果，避免非必要的侵入式取樣。減輕孕婦心理壓力，符合臨床要求。