基于高通量測(cè)序分析黔中金蕎麥內(nèi)生菌及其根際土壤微生物多樣性

張濤，周思旋，唐遠(yuǎn)江，陶小艷，盧昱希，趙宇，史開志，李婷，楊粵黔

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550005)

植物內(nèi)生菌是指生活在健康植物組織內(nèi)并不引起明顯病害癥狀的一類菌，包括真菌、細(xì)菌、放線菌和卵菌，幾乎在所有植物組織中都存在[1]。在與植物長(zhǎng)期共存中內(nèi)生菌會(huì)產(chǎn)生與宿主植物類似的生理活性次級(jí)代謝產(chǎn)物，在很大程度上豐富了人類藥用寶庫(kù)[2]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)生活中，藥用植物內(nèi)生菌不僅可提高宿主自身抗性，還可用來(lái)開發(fā)動(dòng)物飼料或添加劑，或開發(fā)獸藥等[3]。目前，藥用植物內(nèi)生菌的研究主要集中在其次級(jí)代謝產(chǎn)物上，對(duì)其內(nèi)生菌的分離主要通過(guò)體外培養(yǎng)法純化得到，由于部分菌株無(wú)法在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)[4，5]，即使使用多種培養(yǎng)基對(duì)菌株進(jìn)行分離，也無(wú)法保證寄生于植物體內(nèi)全部的內(nèi)生菌都能被分離出來(lái)。高通量測(cè)序技術(shù)為全面分析植物組織中微生物多樣性提供了便利，可準(zhǔn)確反映植物內(nèi)生微生物的種類組成和比例，已廣泛應(yīng)用于微生物多樣性及群落分析等研究[6]。

黔中金蕎麥(Fagopyrum dibotrysQian Zhong)是貴州省畜牧獸醫(yī)研究所以貴州黔中地區(qū)野生金蕎麥為原始材料馴化而成的牧草新品種[7]，是一種高蛋白牧草，具有產(chǎn)量高、適口性好、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)[8，9]。同時(shí)，也是一種價(jià)值高的中草藥，含苷類、萜類以及黃酮類等多種化學(xué)成分，具有清熱解毒、活血化瘀、健脾利濕等功效。目前，黔中金蕎麥以藥飼兼用、綠色無(wú)污染的優(yōu)質(zhì)飼草資源被廣泛應(yīng)用在仔豬和肉雞等畜禽飼料中作為減抗替抗飼料添加制品[10，11]。本研究以黔中金蕎麥為研究對(duì)象，采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)其內(nèi)生菌16S rDNA V3－V4 和ITS1 區(qū)擴(kuò)增系列進(jìn)行分析，揭示黔中金蕎麥內(nèi)生菌及根際土壤微生物的組成和豐度，為進(jìn)一步對(duì)黔中金蕎麥資源的可持續(xù)利用及其內(nèi)生菌優(yōu)質(zhì)菌株開發(fā)提供可靠菌種來(lái)源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于2021年7月分別采集貴州省黔西市(27°4′0″N，105°49′4 E，海拔1 330 m)、貴州省貴陽(yáng)市龍洞堡(26°31′49″N，106°47′26″E，海拔1 100 m)、花溪區(qū)麥坪鎮(zhèn)(26°25′49″N， 106°20′26″E，海拔1 100 m)3 個(gè)地點(diǎn)的新鮮健康黔中金蕎麥樣本各4 株，所有植株均為整株采挖，采集對(duì)應(yīng)植株根際土壤，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，24 h 內(nèi)進(jìn)行處理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣本表面消毒 將不同地區(qū)新鮮健康的黔中金蕎麥沖洗干凈并晾干，根、莖剪成0.5～1.0 cm 的小段，葉片剪成0.5 cm × 0.5 cm 小方塊。組織塊表面消毒:0.1%吐溫表面活化3～5 min，無(wú)菌水沖洗3 次；75%乙醇浸泡3 min，無(wú)菌水沖洗3次，用無(wú)菌濾紙吸干表面水分；再用70%乙醇＋3% H2O2混合液消毒，根莖5～7 min，葉1～2 min，無(wú)菌水沖洗3 次，無(wú)菌濾紙吸干，置于50 mL 無(wú)菌離心管中，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因組DNA 提取及PCR 擴(kuò)增 采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)方法對(duì)樣本的基因組DNA 進(jìn)行提取，利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNA 進(jìn)行檢測(cè)，取適量于離心管中，無(wú)菌水稀釋至1 ng/μL。利用16S rRNA V3－V4 區(qū)引物341F(5′－CCTAYGGGRBGCASCAG－ 3′)、 806R (5′ － GGACTACNNGGGTATCTAAT－3′)對(duì)內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系:2×Phusion master mix 15 μL，引物(2 μmol/L)各1.5 μL，DNA 模板10 μL，ddH2O 2 μL；擴(kuò)增程序:98℃1 min；98℃10 s，50℃30 s，72℃30 s，共30 個(gè)循環(huán)；72℃10 min。利用ITS1-1F 區(qū)引物ITS1-1F-F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)、 ITS1-1F-R ( 5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)對(duì)內(nèi)生真菌進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系:5×FastpfuBuffer 4 μL，引物(5 μmol/L)各0.8 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL，DNA 聚合酶0.4 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 補(bǔ)加至20 μL；擴(kuò)增程序:95℃3 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃45 s，共30 個(gè)循環(huán)；72℃10 min。采用TruSeq?DNA PCRFree Sample Preparation Kit 構(gòu)建文庫(kù)，經(jīng)Qubit 和Q－PCR 定量和文庫(kù)檢測(cè)合格后，使用NovaSeq 6000 上機(jī)測(cè)序。高通量測(cè)序由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.2.3 測(cè)序數(shù)據(jù)處理與分析 將測(cè)試得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拆分、拼接、過(guò)濾及校正后得到優(yōu)化序列。再經(jīng)去除嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)。

利用UPARSE 對(duì)所有樣品的全部有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類成為分類操作單元( operational taxonomic units，OTUs)，選取出現(xiàn)頻率最高的序列作為OTUs 代表序列，采用Mothur 方法與SILVA138 中SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋分析。基于OTUs 聚類結(jié)果，利用Qiime 軟件進(jìn)行樣本復(fù)雜度分析(alpha diversity)，計(jì)算Observed species、Chao 1、Shannon、Simpson 及ACE 指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黔中金蕎麥內(nèi)生菌及根際土壤微生物OTUs分析

經(jīng)Illumina NovaSeq 測(cè)序，內(nèi)生細(xì)菌按照97%相似性進(jìn)行聚類注釋得到OTUs 1 675 條；內(nèi)生真菌注釋得到OTUs 2 045 條。各樣品序列統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。莖葉、根及根際土壤間細(xì)菌共有OTUs為87 個(gè)，特有OTUs 分別為12、38 個(gè)和1 213 個(gè)；莖葉、根及根際土壤中真菌共有OTUs 為233 個(gè)，特有OTUs 分別為358、141 個(gè)和812 個(gè)(圖1)。

表1 各樣品序列統(tǒng)計(jì)

圖1 細(xì)菌(左)和真菌(右)OTUs 分布韋恩圖

2.2 Alpha 多樣性分析

由圖2 可知，隨著測(cè)序深度的增加，所有樣本OTUs 數(shù)量先增加后逐漸趨于平緩，說(shuō)明樣本量充足，測(cè)序數(shù)據(jù)合理，能夠較好地反映黔中金蕎麥內(nèi)生菌菌群信息。Chao 1 和ACE 指數(shù)用來(lái)估計(jì)群落中生物豐富度；Simpson 和Shannon 指數(shù)用來(lái)描述物種均勻度和多樣性。由表2 可知，黔中金蕎麥莖葉內(nèi)生細(xì)菌Chao1 指數(shù)、ACE 指數(shù)、Simpson指數(shù)、Shannon 指數(shù)分別為117.01、130.14、0.37、1.13，均低于根部；而真菌的Chao 1 指數(shù)、ACE 指數(shù)、Simpson 指數(shù)、Shannon 指數(shù)分別為652.71、656.73、0.92、5.30，均高于根部。表明黔中金蕎麥莖葉的內(nèi)生細(xì)菌群落豐富度及多樣性低于根部，真菌的豐富度及多樣性則比根部的高。根際土壤微生物的Alpha 多樣性各指數(shù)均高于黔中金蕎麥莖葉和根部，說(shuō)明土壤中微生物種類最為復(fù)雜、數(shù)量最多。根據(jù)Observed species 指數(shù)直觀觀測(cè)到的細(xì)菌物種數(shù)目為根際土壤>黔中金蕎麥根>黔中金蕎麥莖葉，真菌物種數(shù)目為根際土壤>黔中金蕎麥莖葉>黔中金蕎麥根。

圖2 樣本中細(xì)菌(左)和真菌(右)稀釋曲線圖

表2 黔中金蕎麥內(nèi)生菌及根際土壤微生物的Alpha 多樣性指數(shù)

2.3 內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)組成

由表3 可知，黔中金蕎麥莖葉和根中內(nèi)生細(xì)菌群落在門水平上主要為藍(lán)藻菌門(Cyanobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)和厚壁菌門(Firmicutes)，其在莖葉中的相對(duì)豐度分別為75.23%、14.07%、5.35%、4.94%，在根中的相對(duì)豐度分別為63. 83%、34.01%、0.64%、0.30%。根際土壤中主要有變形菌門、放線菌門和厚壁菌門，相對(duì)豐度分別為36.12%、13.52%、1.41%。真菌群落門水平要包括子囊菌門(Ascomycota)和擔(dān)子菌門(Basidiomycota)，在莖葉中的相對(duì)豐度分別為67.45% 和23.07%，在根中的相對(duì)豐度分別為35.77%和33.53%，根際土壤中的相對(duì)豐度分別為37.10%和14.12%。

表3 黔中金蕎麥內(nèi)生菌及根際土壤微生物門水平相對(duì)豐度(%)

由表4 可知，在屬水平上，黔中金蕎麥莖葉中內(nèi)生細(xì)菌有變形菌門未知屬(unidentified＿Chloroplast)、藍(lán)藻菌門未知屬(unidentified＿M(jìn)itochondria)、痤瘡丙酸桿菌(Cutibacterium)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)，相對(duì)豐度均大于3%，其中變形菌門未知屬相對(duì)豐度最高，占所有菌屬的75.23%，被鑒定出來(lái)的優(yōu)勢(shì)屬為痤瘡丙酸桿菌(5.03%)。黔中金蕎麥根中內(nèi)生細(xì)菌有變形菌門未知屬(unidentified＿Chloroplast)、藍(lán)藻菌門未知屬(unidentified＿M(jìn)itochondria)和Ellin6067 屬，相對(duì)豐度分別為63.82%、32.48%和3.08%。根際土壤中內(nèi)生細(xì)菌主要有赫黃嗜鹽囊菌屬(Haliangium)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、Dongia屬、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、Ellin6067 屬、MND1 屬，相對(duì)豐度均大于1%，其中赫黃嗜鹽囊菌屬相對(duì)豐度最高，占所有菌屬的2.96%。黔中金蕎麥莖葉真菌群落屬水平上主要為枝孢菌屬(Cladosporium)、腥擲抱菌屬(Tilletiopsis)、間座殼屬(Diaporthe)、織球殼菌(Plectosphaerella)、刺盤孢屬(Colletotrichum)，其中枝孢菌屬相對(duì)豐度最高，占所有菌屬的16.10%，為莖葉中的優(yōu)勢(shì)菌屬。黔中金蕎麥根內(nèi)生真菌群落屬水平上主要有灰球菌屬(Bovista)、斜蓋傘屬(Clitopilus)、織球殼菌(Plectosphaerella)、刺盤孢屬(Colletotrichum)、枝鼻菌屬(Cladorrhinum)，其中灰球菌屬相對(duì)豐度最高，占所有菌屬的17.67%，為根中的優(yōu)勢(shì)菌屬。根際土壤真菌群落屬水平主要有鐮孢菌屬(Fusarium)、織球殼菌(Plectosphaerella)、赤霉菌屬(Gibberella)、刺盤孢屬(Colletotrichum)、枝孢菌屬(Cladosporium)、斜蓋傘屬(Clitopilus)，其中鐮孢菌屬相對(duì)豐度最高，占所有菌屬的21.09%，為根際土壤中的優(yōu)勢(shì)菌屬。

表4 黔中金蕎麥內(nèi)生菌及根際土壤微生物屬水平相對(duì)豐度(%)

3 討論與結(jié)論

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展，高通量測(cè)序技術(shù)因其具有免培養(yǎng)、信息量大等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于環(huán)境微生物、腸道微生物、植物內(nèi)生菌等微生物多樣性及群落分析研究中[12－14]。高通量測(cè)序技術(shù)不僅能獲得植物內(nèi)生菌菌群結(jié)構(gòu)情況，用于分析組織內(nèi)部生態(tài)水平與環(huán)境因子間的關(guān)系，還可篩選得到具有生物防治、發(fā)酵產(chǎn)物優(yōu)良及能進(jìn)行藥材道地性鑒別的優(yōu)質(zhì)菌株。魏玉潔等[15]通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)分析新疆產(chǎn)區(qū)葡萄果實(shí)、葉片及土壤微生物多樣性，得到包括5 個(gè)菌門、237 個(gè)真菌菌屬和8 個(gè)菌門、314 個(gè)細(xì)菌菌屬，為葡萄酒相關(guān)微生物多樣性及葡萄種植產(chǎn)區(qū)提供理論支持。靳松等[16]利用Illumina MiSeq 高通量測(cè)序技術(shù)從石蟬草組織樣本中分離得到167 個(gè)OTUs，歸屬于11 個(gè)門、26 個(gè)綱、48 個(gè)目、82 個(gè)科和104 個(gè)屬，其中以變形菌門為優(yōu)勢(shì)菌群(62.48% ～93.24%)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌與石蟬草的抗炎抗腫瘤等活性有關(guān)。吳媛等[17]利用高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合高效液相色譜在朝鮮淫羊藿葉片中分離得到686 種內(nèi)生真菌，歸屬于451 個(gè)屬，其中橫斷孢屬、念珠菌屬、線黑粉酵母屬等菌屬與黃酮類化學(xué)成分呈正相關(guān)。宋昭昭等[18]從巨菌草分離得到1 株可用于生物防治的內(nèi)生菌菌株JK7－2，并通過(guò)Illumina MiSeq 高通量測(cè)序分析得到該菌株有349 個(gè)與次級(jí)代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因，為相關(guān)次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成機(jī)制研究提供參考依據(jù)。郭偉強(qiáng)等[19]采用宏基因測(cè)序技術(shù)分析得出野生及栽培人參內(nèi)生細(xì)菌主要有變形菌門、硬壁菌門及放線菌門，其中類芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬在野生人參和栽培人參內(nèi)生細(xì)菌中均為優(yōu)勢(shì)種群。

本研究表明黔中金蕎麥莖葉的內(nèi)生細(xì)菌群落豐富度及多樣性低于根部，真菌的豐富度及多樣性則比根部高。根際土壤各指數(shù)均高于黔中金蕎麥莖葉和根部，微生物種類最為復(fù)雜、數(shù)量最多。可見植物內(nèi)生真菌具有一定的器官組織特異性。從內(nèi)生菌群落組成來(lái)看，黔中金蕎麥內(nèi)生細(xì)菌在門水平主要為藍(lán)藻菌門(Cyanobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)和厚壁菌門(Firmicutes)，真菌門水平上主要包括子囊菌門(Ascomycota)和擔(dān)子菌門(Basidiomycota)，與其他植物內(nèi)生菌研究結(jié)果[20]一致，說(shuō)明植物內(nèi)生菌在較大分類級(jí)別單元存在相似性；根際土壤細(xì)菌、真菌群落均較黔中金蕎麥組織豐富，目前普遍認(rèn)為植物內(nèi)生菌主要來(lái)源于根際土壤，微生物由土壤進(jìn)入根，隨著蒸騰作用、營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸?shù)角o葉。

隨著對(duì)藥用植物內(nèi)生菌研究的不斷深入，挖掘與植物生長(zhǎng)代謝相關(guān)的益生菌，篩選具有抗菌活性的菌株，可為解決藥用植物資源緊缺、充分利用其藥用資源提供新思路。黔中金蕎麥內(nèi)生細(xì)菌和真菌具有一定的多樣性，下一步將對(duì)黔中金蕎麥內(nèi)生菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，對(duì)可培養(yǎng)菌株進(jìn)行多樣性分析，篩選具有生物活性的優(yōu)勢(shì)菌株，為進(jìn)一步對(duì)黔中金蕎麥內(nèi)生菌的開發(fā)利用和資源保護(hù)提供理論依據(jù)。