邵燕秋 ，黃 卉，李來好，楊賢慶，陳勝軍，郝淑賢，吳燕燕，岑劍偉，鄧尚貴

1. 浙江海洋大學(xué) 食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 舟山 316022

2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東 廣州 510300

高血壓是常見的慢性疾病，可引起心力衰竭、視力喪失或者腎臟疾病等[1]。全世界約有25%的成年人患有高血壓[2]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 (Angiotensin-converting enzyme, ACE) 是一種含有鋅離子 (Zn2+)的二肽羧肽酶[3]，通過催化無升血壓活性的血管緊張素I (Angiotensin I, Ang I) 轉(zhuǎn)化為具有升血壓活性的血管緊張素II (Angiotensin II, Ang II)，并使具有血管舒張作用的緩激肽失活，從而導(dǎo)致血壓上升[4]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽是具有降血壓活性的生物活性肽。目前主要使用合成藥物治療高血壓，如賴諾普利、卡托普利、依那普利[5]，會使人體產(chǎn)生如過敏和皮疹等不良反應(yīng)[6]。食物蛋白來源的天然活性肽與合成藥物相比，具有來源可靠、無明顯不良副作用等優(yōu)點[7]。因此從天然的食物蛋白源中制備具有ACE抑制活性的肽作為開發(fā)降血壓藥物的基礎(chǔ)顯得極為重要[8]。近年來利用水產(chǎn)蛋白制備具有ACE抑制活性的多肽逐漸受到關(guān)注，如從大黃魚 (Larimichthys crocea)、龍須菜(Gracilariopsis lemaneiformis)、短鰭笛鯛 (Decapterus macrosoma)、環(huán)菱螺 (Bellamya bengalensis)、海參 (Acaudina molpadioidea)、狗母魚 (Synodus macrops) 以及青蛤 (Cyclina sinensis) 等[1,8-13]來源中已提取出具有ACE抑制活性的多肽。

鰻魚肉質(zhì)細(xì)膩、營養(yǎng)豐富，有“水中人參”的美譽。中國是最大的鰻魚養(yǎng)殖國，2020年中國鰻魚養(yǎng)殖產(chǎn)量高達(dá)25.07萬噸[14]。鰻魚的加工產(chǎn)業(yè)主要是以烤鰻為主，烤鰻加工過程中會產(chǎn)生魚骨、魚頭等副產(chǎn)物，目前副產(chǎn)物主要作為生產(chǎn)飼料的原料，附加值較低[15]。魚骨含有豐富的膠原蛋白，具有較好的開發(fā)利用前景。因此，本研究從鰻魚骨中提取膠原蛋白，采用不同蛋白酶酶解制備具有ACE抑制活性的多肽，通過單因素和響應(yīng)面試驗優(yōu)化提取工藝條件，測定其分子質(zhì)量分布及氨基酸組成，以期為鰻魚骨膠原蛋白制備ACE抑制活性肽的研發(fā)和資源再利用提供理論依據(jù)和思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰻魚魚排購于廣東順德東龍烤鰻有限公司。

堿性蛋白酶 (≥200 U·mg?1)、胃蛋白酶 (≥10 000 U·mg?1)、木瓜蛋白酶 (≥200 U·mg?1)、中性蛋白酶(≥100 U·mg?1)、胰蛋白酶 (≥250 U·mg?1) 購于合肥博美生物科技有限公司；細(xì)胞色素C (12 400 D)、抑肽酶 (6 511.44 D)、桿菌肽 (1 422.69 D)、氧化型L-谷胱甘肽 (612.63 D)、還原型谷胱甘肽 (307.3 D)購于北京睿博興科生物技術(shù)有限公司；ACE (≥2.0 U·mg?1) 購于上海源葉生物科技有限公司；馬尿酰-組氨酰-亮氨酸 (HHL) 購于南京嬌子騰科學(xué)器材有限公司；乙二胺四乙酸 (EDTA，分析純) 購于廣州都宏有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

THZ-C型臺式恒溫振蕩器 (太倉華美生化儀器廠)；H1850R型高速臺式冷凍離心機 (湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；α1-4型冷凍干燥機 (德國Christ公司)；LC-20AD高效液相色譜 (日本島津公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 鰻魚骨膠原蛋白的制備

參考錢躍威等[16]的方法加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的氫氧化鈉 (NaOH) 溶液浸泡魚排約40 min除去附著的魚肉；參考蔡路昀等[17]方法加入0.5 mol·L—1乙二胺四乙酸二鈉 (EDTA-2Na) 溶液浸泡魚骨72 h，每12 h更換一次溶液，以除去礦物質(zhì)。用蒸餾水反復(fù)沖洗、瀝干后備用。

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量預(yù)處理過的魚骨，料液質(zhì)量體積比為1∶40，調(diào)節(jié)pH至2.0，胃蛋白酶加酶量為1% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))，在37 ℃下振蕩提取2 h，滅酶，紗布過濾。在上清液加入氯化鈉 (NaCl) 使溶液質(zhì)量濃度為0.9 mg·mL?1，4 ℃靜置過夜，6 000 r·min?1離心15 min，沉淀物即膠原蛋白粗品。用0.1 mg·mL?1的乙酸溶液復(fù)溶，調(diào)節(jié)pH至中性，在4 ℃ 下用 0.1 mg·mL?1乙酸溶液透析 1 d、去離子水透析2 d，每8 h換一次透析液。透析完成后將樣品進(jìn)行冷凍干燥，即可得到膠原蛋白樣品，于—20 ℃ 下保存。

1.3.2 蛋白酶的篩選

將鰻魚骨膠原蛋白溶于超純水至質(zhì)量濃度為5 g?L?1，分別加入 3% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 的木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶以及胃蛋白酶，根據(jù)表1的試驗條件調(diào)節(jié)至各蛋白酶的最適pH和溫度，酶解4 h。酶解結(jié)束后90 ℃以上滅酶15 min，冷卻至室溫后，離心、濃縮、冷凍干燥，得到膠原蛋白肽粉，進(jìn)行ACE體外抑制活性測定。

表1 5種蛋白酶的最適酶解條件Table 1 Optimal enzymatic hydrolysis conditions of five proteases

1.3.3 單因素試驗

以ACE抑制活性、水解度為評價指標(biāo)，分別考察堿性蛋白酶的pH (7、8、9、10、11)、加酶量(1%、2%、3%、4%、5%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))、酶解時間(2、3、4、5、6 h) 以及膠原蛋白質(zhì)量濃度 [1、5、10、15、20 g·L—1] 4 個因素對評價指標(biāo)的影響。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇酶解時間 (A)、加酶量 (B) 以及pH (C) 為響應(yīng)因素，以ACE抑制率為響應(yīng)值，應(yīng)用Box-Behnken Design 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗 (三因素三水平)，因素和水平的具體參數(shù)見表2。

表2 響應(yīng)面試驗因素水平表Table 2 Response surface test factors and levels

1.3.5 水解度的測定

水解度 (DH) 指的是肽鍵在蛋白底物 (htot) 中裂解至總肽鍵的比例，采用pH-stat法測定[18-19]，在試驗中通過加入標(biāo)準(zhǔn)的NaOH溶液保持水解過程中pH不變，通過計算滴定膠原蛋白水解所消耗的標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液體積來計算膠原蛋白的DH (%)：

式中：B為保持pH不變所消耗的NaOH體積(mL)；Nb為 NaOH 的當(dāng)量濃度 (mol·L?1)；Mp為底物中蛋白總量 (g)；htot為底物蛋白質(zhì)中肽鍵總數(shù)(mmol·g?1)，本研究中 htot以 8.41[20]計；α 為水解過程中α-氨基酸的解離度，其計算公式為：

式中：pH為水解液的酸堿度；pK為α-氨基酸的解離常數(shù)。

1.3.6 ACE抑制活性測定

ACE抑制活性測定參考蘇億盛[19]的方法略作修改。將樣品用 pH 8.3、0.1 mol·L?1硼酸鹽緩沖液(含有 0.3 mol·L?1的 NaCl) 溶解。在 1.5 mL 離心管中加入 50 μL 樣品溶液和 50 μL 5 mmol·L?1的HHL，于37 ℃恒溫水浴鍋中水浴5 min，再加入50 μL 0.1 U·mL?1的 ACE 溶液，于 37 ℃ 恒溫水浴鍋水浴 30 min，加入 100 μL 1 mol·L?1的鹽酸 (HCl)終止反應(yīng)。以硼酸鹽緩沖液代替樣品作為空白對照組。反應(yīng)液離心后用高效液相色譜 (HPLC) 檢測馬尿酸生成量。

色譜柱：C18-WP，100 A，4.6×250 nm，5 μm；流動相：乙腈 (含0.1%三氟乙酸)∶水 (含0.1%三氟乙酸) =25∶75 (體積比)，等度洗脫；流速為0.5 mL·min?1；檢測波長為228 nm；進(jìn)樣量為10 μL。ACE抑制活性按照公式 (3) 計算。

式中：IA為ACE抑制活性；AS為加入抑制劑組中馬尿酸的峰面積；AC為空白對照組中馬尿酸的峰面積。

1.3.7 酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布測定

采用高效體積排阻色譜法 ( High performance size exclusion chromatography, HPSEC) 測定酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量 (Molecular weight, MW) 分布。參照Guo等[21]方法并略作修改。將凍干肽粉用超純水溶解后配制成2 mg·mL?1溶液；稱取適量的還原型谷胱甘肽、氧化型L-谷胱甘肽、桿菌肽、抑肽酶以及細(xì)胞色素C用超純水配置成2 mg·mL?1溶液，過0.22 μm微孔濾膜。據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間和相對分子質(zhì)量的對數(shù)來分析樣品的分子質(zhì)量分布；流動相：乙腈 (含0.1%三氟乙酸)∶超純水 (含0.1%三氟乙酸)=20∶80 (體積比)；等度洗脫；流速為0.5 mL·min?1；紫外檢測波長為 214 nm。

1.3.8 氨基酸組成測定

參考GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測定》的酸水解法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

單因素試驗結(jié)果采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行顯著性差異分析，響應(yīng)面優(yōu)化試驗采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行回歸分析，所有數(shù)據(jù)采用Origin 2015軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

在鰻魚骨膠原蛋白質(zhì)量濃度5 g·L?1、加酶量3% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 的條件下，于各蛋白酶的最適pH和溫度下酶解4 h，并測定ACE抑制活性。不同蛋白酶對膠原蛋白的酶解效果差異明顯，胃蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性分別為 (28.90±1.68)%、(52.75±1.75)%、(37.43±0.86)%、(23.52±4.02)%和 (6.86±1.46)% (圖1)。其中堿性蛋白酶酶解鰻魚骨膠原蛋白制備的酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性最高，這可能是因為不同的蛋白酶具有不同的作用位點和酶解產(chǎn)物[22-23]。該結(jié)果與朱迎春等[24]的研究結(jié)果相一致，其使用5種蛋白酶對鯰魚骨進(jìn)行酶解，發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性最高 (89.10%)。此外，李華亮等[25]使用堿性蛋白酶酶解鱷魚骨得到具有較好ACE抑制活性的多肽。因此，可選擇堿性蛋白酶為最佳酶，并進(jìn)一步優(yōu)化制備條件。

圖1 不同蛋白酶對ACE抑制活性的影響Fig. 1 Effect of different proteases on ACE inhibitory activity

2.2 單因素試驗結(jié)果

pH的改變可影響底物和酶的解離狀態(tài)，破壞酶的空間結(jié)構(gòu)，引起酶活性部位構(gòu)象的改變[26-27]。在pH 7～9范圍內(nèi)，ACE抑制活性逐漸增強，pH 9～11范圍內(nèi)ACE抑制活性逐漸降低，在pH 9時ACE抑制活性達(dá)到最高 (56.66%，圖2-a)，因此pH 9是較為合適的酶解pH。

隨著加酶量的增加，底物蛋白水解越充分，生成的小分子質(zhì)量的肽也會增多，則ACE抑制活性逐漸增加，水解度逐漸增強，在加酶量為2%～3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 時，活性迅速增加并達(dá)到最大值54.59%(圖2-b)。酶解液的ACE抑制活性隨著酶添加量的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢。當(dāng)酶的添加量繼續(xù)增加，酶會與底物繼續(xù)反應(yīng)，小分子多肽繼續(xù)降解，因此導(dǎo)致酶解液的抑制活性下降。因此，加酶量為3% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 時較為合適。

隨著酶解時間的增加，ACE抑制活性先上升后下降，水解度逐漸上升后趨于平緩 (圖2-c)。這是因為在初始階段底物中蛋白濃度較高，酶與底物作用位點結(jié)合程度高，使底物蛋白迅速降解為肽段，水解程度也逐漸升高，長肽被水解為短肽，活性增強；當(dāng)水解程度達(dá)到飽和時，隨著時間的增加，由于底物和酶的接觸幾率變小、酶切位點減少，從而導(dǎo)致水解程度逐漸變緩[28]。ACE抑制活性在第5 小時達(dá)到最大 (50.58%)，水解度為19.37%。因此，獲得活性較高的酶解產(chǎn)物需要嚴(yán)格控制酶解程度，5 h為較適合的酶解時間。

當(dāng)膠原蛋白質(zhì)量濃度為5 g·L?1時，ACE抑制活性較低，當(dāng)質(zhì)量濃度升高時，水解度逐漸上升后趨于平穩(wěn)，ACE抑制活性快速升高后趨于降低，當(dāng)膠原蛋白質(zhì)量濃度為15 g·L?1時ACE抑制活性最大 (60.45%，圖2-d)。這是因為底物中蛋白濃度較低時，在反應(yīng)過程中底物蛋白與酶的接觸幾率高，流動性強，提高了反應(yīng)的速率；當(dāng)膠原蛋白質(zhì)量濃度增大時，酶與底物的接觸達(dá)到飽和，酶促反應(yīng)不再增加，活性、水解度逐漸趨于平穩(wěn)[29]。因此，較適合的酶解膠原蛋白質(zhì)量濃度為15 g·L?1。

圖2 pH、加酶量、時間、膠原蛋白質(zhì)量濃度對水解度和ACE抑制活性的影響Fig. 2 Effects of pH, enzyme dosage, enzymatic hydrolysis time and collagen mass concentration on degree of hydrolysis and ACE inhibitory activity

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，在酶解溫度50 ℃、膠原蛋白質(zhì)量濃度為15 g·L?1的條件下，以酶解時間(A)、加酶量 (B)、pH (C) 3個因素為自變量，ACE抑制率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗，結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計和結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiment

運用Design Expert 軟件，對以上17個試驗點響應(yīng)值進(jìn)行二次回歸分析，經(jīng)回歸擬合后，得到多元回歸方程：

y=71.49+8.84A+1.44B+2.09C+1.12AB—5.04AC—0.21BC—15.89A2—8.18B2—2.02C2

2.3.2 回歸模型的建立及分析

對試驗結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，回歸方程的方差分析結(jié)果見表4。模型的F值為27.19，P為0.000 1，表明模型具有顯著性。酶解時間A以及二次項A2、B2對響應(yīng)值的影響極顯著 (P<0.001)；交互項AC對響應(yīng)值影響顯著 (P<0.05)。失擬項F=2.72，差異不顯著 (P>0.05)。表明該模型與堿性蛋白酶酶解鰻魚膠原蛋白制備具有ACE抑制活性多肽的試驗情況擬合程度較好。各因素對ACE抑制活性的影響程度排序為：酶解時間>pH>加酶量。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

2.3.3 各因素之間互相作用分析

等高線的圖形可反映交互作用的強弱，橢圓表示交互作用顯著，圓形表示交互作用不顯著[30]。圖3為回歸方程中的AB、AC、BC對應(yīng)的響應(yīng)面圖，時間對ACE抑制活性的影響最為顯著，pH和溫度對其影響較小。時間和pH交互作用對ACE抑制活性影響顯著，當(dāng)加酶量為3% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))時，時間越長，ACE抑制活性隨著pH的增加先升后降的趨勢越明顯；加酶量與時間、加酶量與pH之間的交互作用不顯著。

圖3 各因素相互作用對ACE抑制活性的響應(yīng)面及等高線圖Fig. 3 Response surface and contour lines of various factors on ACE inhibitory activity

2.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化驗證

由軟件分析得到堿性蛋白酶酶解鰻魚骨膠原蛋白制備具有ACE抑制活性的多肽的工藝條件為溫度50 ℃、膠原蛋白質(zhì)量濃度為15 g·L?1、時間5.250 06 h、加酶量3.103% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 、pH 9.202，預(yù)測活性值為72.87%。結(jié)合生產(chǎn)實際情況，將鰻魚骨膠原蛋白酶解工藝條件調(diào)整為：溫度50 ℃、膠原蛋白質(zhì)量濃度為 15 g·L?1、時間 5.25 h、加酶量3.1% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 、pH 9.2。在此條件下進(jìn)行試驗驗證，其抑制率和水解度分別為 (70.33±0.9)%和23.98%，與模型的預(yù)測值接近。表明該回歸模型對鰻魚骨膠原蛋白水解條件的優(yōu)化是可行的。

2.4 酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布

分子質(zhì)量的大小對生物活性有很大影響，不同分子質(zhì)量的肽段活性可能不同，一般小分子低聚寡肽易被人體吸收，能直接參與組織蛋白質(zhì)合成和代謝[28]。鰻魚骨膠原蛋白酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布如圖4所示，不同分子質(zhì)量的肽含量占比為：<1 kD的為57.02%，1～3 kD的為36.55%，3～5 kD的為4.72%，>5 kD 的為1.71%。丘娟等[31]從牡蠣中制備得到具有較好ACE抑制活性的多肽，其分子質(zhì)量在3 kD 以下的占比達(dá)到99.72%；Yu等[13]采用超濾法對青蛤酶解液進(jìn)行8 kD、5 kD、3 kD不同分子量的截留膜過濾，<3 kD的組分與其他組分相比具有較高的ACE抑制活性；Shi等[32]和Kim等[33]分別從海馬 (Hippocampus trimaculatus) 和鱈(Trichiurus lepturus) 中鑒定出ACE抑制活性較高的七肽 (721.39 D) 和五肽 (496.44 D)。這些研究表明，具有較高ACE抑制活性的多肽主要為小分子質(zhì)量的肽[34]。本研究得到的酶解產(chǎn)物在3 kD以下的多肽占93.57%，表明ACE抑制活性可能主要來源于分子質(zhì)量小于3 kD的肽。

圖4 鰻魚骨膠原蛋白酶解產(chǎn)物的高效體積排阻色譜圖 (a) 及分子質(zhì)量分布圖 (b)Fig. 4 HPSEC chromatogram (a) of hydrolysates of eel bone collagen and its molecular weight distribution (b)

2.5 氨基酸組成分析

為了研究酶解前后氨基酸組成的變化，對膠原蛋白及酶解產(chǎn)物的氨基酸進(jìn)行對比分析 (表5)。ACE抑制活性與氨基酸的疏水性有關(guān)，ACE抑制肽的C端是活性部位結(jié)合的關(guān)鍵，當(dāng)C端含有疏水性氨基酸殘基時更利于發(fā)揮ACE抑制活性[35-37]。其活性與疏水性氨基酸的含量和所在位置有關(guān)[38]。當(dāng)N端為纈氨酸 (Val)、異亮氨酸 (Ile)，C端為色氨酸 (Trp)、酪氨酸 (Tyr)、脯氨酸 (Pro) 以及苯丙氨酸 (Phe) 時會增強ACE抑制活性[39]。酶解前后疏水性氨基酸 [Pro、丙氨酸 (Ala)、Val、蛋氨酸(Met)、Ile、亮氨酸 (Leu)、Phe] 含量分別為29.91%和32.31%，酶解后疏水性氨基酸Pro、Val、Ile、Leu以及Phe含量增加。Pro是發(fā)揮ACE抑制活性的重要氨基酸[40]，酶解后Pro的含量增加了4.94%。這與于志鵬等[41]從文蛤 (Meretrix lusoria) 中提取得到的具有ACE抑制活性的多肽結(jié)果相近。

表5 鰻魚膠原蛋白氨基酸組成Table 5 Amino composition of collagen from eel bone

3 結(jié)論

本研究采用5種蛋白酶對鰻魚骨膠原蛋白進(jìn)行酶解，以水解度和ACE抑制活性為評價指標(biāo)，篩選出堿性蛋白酶為制備具有ACE抑制活性的多肽的最佳蛋白酶，通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化得到最佳酶解條件為：溫度50 ℃、膠原蛋白質(zhì)量濃度為15 g·L?1、時間 5.25 h、加酶量 3.1% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))、pH 9.2。在此條件下制備得到的酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性為 (70.33±0.9)%；酶解產(chǎn)物中分子質(zhì)量小于1 kD的肽含量為57.02%，1～3 kD的肽含量為36.55%。疏水性氨基酸是發(fā)揮ACE抑制活性的重要氨基酸，酶解前后疏水性氨基酸含量分別為29.91%和32.31%，酶解后疏水性氨基酸Pro、Val、Ile、Leu以及Phe含量增加。結(jié)果表明，鰻魚骨膠原蛋白是制備ACE抑制活性肽的較好來源，本研究的制備技術(shù)可為鰻魚骨的加工利用提供參考。但由于其作用機理和生物學(xué)評價尚未明確，需要對其做進(jìn)一步的序列鑒定和細(xì)胞實驗來分析驗證。