宋嘉寶，王明鋒，羅昭標(biāo)，曹慶梅，夏長劍，侯寧寧，郭林青，馬 林，李 萌，陳德鑫*，饒 智*

1. 鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)科學(xué)大道136 號 450001

2. 紅云紅河煙草（集團(tuán)）有限責(zé)任公司，昆明市紅錦路367 號 650231

3. 江西省煙草公司撫州市公司，江西省撫州市迎賓大道1666 號 344000

4. 湖北中向生物工程有限公司，湖北省宜昌市宜都市紅花套鎮(zhèn) 443300

5. 中國煙草總公司海南省公司?？谘┣蜒芯克？谑屑t城湖路120 號 571100

6. 四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，成都市成龍大道二段與成龍立交交叉口西南200 米 610021

煙葉具有較強(qiáng)的吸濕性且含有微生物生長繁殖所需要的糖類、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸等物質(zhì)，在適宜的條件下容易滋生各種微生物而發(fā)生霉變［1-2］。據(jù)統(tǒng)計，每年我國煙葉因霉變造成的損失達(dá)70 億元左右［3-7］。引起煙葉霉變的微生物主要為真菌，包括曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）、根霉屬（Rhizopus）、毛霉屬（Muor）和鏈格孢屬（Alternaria）等［8-13］霉變微生物。朱桂寧［14］發(fā)現(xiàn)曲霉屬微生物是引起廣西倉儲煙葉霉變的主要微生物，其次是青霉屬微生物。晏衛(wèi)紅等［12］從廣西鐘山、富川和柳州等地?zé)焸}霉變煙葉中分離出曲霉屬、青霉屬、毛霉屬和根霉屬霉變微生物，其中曲霉屬菌株為優(yōu)勢菌群。煙葉霉變常見的防治方法為化學(xué)防治［15-16］、物理防治［17］和生物防治［18］。生物防治具有綠色、無公害且不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點，已成為煙葉防霉重要的研究方向。趙文姬［18］運(yùn)用混合平板法從烤煙煙葉表面分離出5株解淀粉芽孢桿菌，通過煙葉防霉試驗發(fā)現(xiàn)菌株B055具有很強(qiáng)的拮抗效果。朱大恒等［19］從煙草根際土壤分離出1 株對倉儲霉變菌株有較強(qiáng)拮抗效果的芽孢桿菌，可以影響霉菌的生長繁殖或使菌絲畸變。

近年來我國雪茄煙消費(fèi)呈現(xiàn)高速增長趨勢，煙葉原料的持續(xù)供給是保障雪茄煙產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。雪茄煙葉在晾制、發(fā)酵和儲藏過程中普遍存在霉變現(xiàn)象，而目前煙葉霉變研究主要集中于烤煙和卷煙，有關(guān)雪茄煙葉霉變微生物鑒定及生物防治相關(guān)的研究報道較少。為此，從海南發(fā)生霉變雪茄煙葉上分離、純化霉變菌株，并篩選致霉菌的拮抗菌株，應(yīng)用形態(tài)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法鑒定霉變微生物和拮抗菌株，旨在為雪茄煙葉霉變的綜合防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

材料：雪茄煙葉（古引4號）采摘于海南省儋州市光村煙田，在海南省儋州市光村鎮(zhèn)建恒哈瓦那雪茄有限公司發(fā)酵房（平均溫度為30 ℃，相對濕度為80%）發(fā)酵380 d。采集典型霉變煙葉3.5 kg作為樣品。

試劑：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基、蛋白胨、酵母粉、氯化鈉、無水乙醇、香柏油和溴化乙錠核酸染液（鄭州翼增生物科技有限公司）；真菌基因組DNA快速抽提試劑盒、細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒、ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）通用引物、27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）通 用 引 物、ddH2O、瓊脂糖［生工生物工程（上海）股份有限公司］；2×Taq Plus Master Mix II（南京諾唯贊股份有限公司）；經(jīng)121 ℃滅菌30 min 后的LB培養(yǎng)基（蛋白胨1 g、酵母粉0.5 g、氯化鈉1 g、100 ml去離子水）。

儀器：DYY-6C 型電泳儀（北京市六一儀器廠）；Vetiti型梯度PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；Mini Bis Pro型凝膠成像分析系統(tǒng)（以色列DNR凝膠成像系統(tǒng)有限公司）；Microfuge 20R 型高速冷凍離心機(jī)（美國貝克曼庫爾特有限公司）；LX-C35L 型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器（合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司）；N-300M型普通光學(xué)顯微鏡（南京江南永新光學(xué)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 海南霉變雪茄煙葉微生物的分離、純化和致霉性驗證

稱取霉變雪茄煙葉10 g，無菌操作接入盛有90 mL 0.9%無菌生理鹽水的錐形瓶中，加2 顆玻璃珠，30 ℃條件下180 r/min搖床震蕩30 min，得到原始菌懸液，按照10-2、10-3、10-4、10-5進(jìn)行梯度稀釋后涂布于PDA 平板培養(yǎng)基，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，純化2 代，得到單一的菌落，編號后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

取適量雪茄煙葉置于培養(yǎng)皿中，121 ℃滅菌鍋滅菌20 min，將分離得到的霉變菌株接種于雪茄煙葉表面［13，20］，30 ℃培養(yǎng)5 d，觀察菌株對雪茄煙葉的致霉效果（煙葉霉變等級標(biāo)準(zhǔn)［13］：0級，未霉變；1級，葉柄發(fā)霉小于1 cm，葉片不發(fā)霉；2級，葉柄發(fā)霉大于1 cm，葉片不發(fā)霉；3級，葉柄發(fā)霉，葉片發(fā)霉面積為1%～25%；4級，葉柄發(fā)霉，葉片發(fā)霉面積為26%～50%；5 級，葉柄發(fā)霉，葉片發(fā)霉面積為50%以上），5 d 后，將煙葉表面霉變菌株接種于PDA 培養(yǎng)基中，觀察是否與原菌株一致。

1.2.2 霉菌的鑒定

菌株培養(yǎng)特征觀察：將分離得到的單一菌株分別接種至PDA平板培養(yǎng)基中央，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，觀察菌落的形態(tài)特征并拍照。

ITS基因序列的PCR擴(kuò)增和系統(tǒng)發(fā)育樹分析：用真菌基因組DNA 快速抽提試劑盒提取霉菌DNA。使用ITS1 和ITS4 通用引物對DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃變性50 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸6 min）。通過瓊脂糖凝膠電泳觀察產(chǎn)物條帶。PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST同源性比對［21］。利用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 拮抗菌株的篩選

從海南霉變雪茄煙葉未霉變部位篩選致霉菌拮抗菌。方法同1.2.1中致霉菌的分離與純化。

將得到的菌株分別與霉菌采用平板對峙法［19，22］進(jìn)行培養(yǎng)。用打孔器取6 mm菌片接種于PDA培養(yǎng)基中央，篩分出的菌株劃線［19］接種于距霉菌2 cm處，單獨接種霉變菌株做對照實驗，每組菌株3個重復(fù)，30 ℃培養(yǎng)5 d，測量并得出平均值，計算R值（R=霉菌菌落向拮抗菌株生長的距離/對照菌落半徑），篩選出拮抗菌株并對其進(jìn)行編號。

1.2.4 拮抗菌株的鑒定

菌株生長特征的檢測：對分離得到的拮抗菌株使用平板劃線法分別接種到LB 培養(yǎng)基平板中，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，觀察菌落的形態(tài)特征；挑取單菌落邊緣菌塊至滴有無菌水的載玻片上，用接種環(huán)將其涂抹均勻，對菌株進(jìn)行革蘭氏染色［23］，顯微鏡下鏡檢并拍照。

分子生物學(xué)鑒定：使用細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取菌株DNA。用27F和1492R通用引物對拮抗菌株進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸40 s，35個循環(huán)；最后延伸7 min）。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物條帶是否正常。將PCR未純化產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。將檢測序列拼接對齊后在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST同源性比對。利用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 海南霉變雪茄煙葉微生物菌落形態(tài)分析

通過平板涂布法分離純化得到3株霉變菌株，分別命名為MBYY-A1、MBYY-B1 和MBYY-C1，將菌株分別接種于PDA培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)5 d后觀察。菌株菌落特征及鏡檢結(jié)果見圖1。菌株MBYY-A1 在PDA培養(yǎng)基中生長速度一般，菌落為圓形，菌落邊緣整齊，中心呈凸起狀，菌落表面呈粉末狀，菌絲頂部以及菌落邊緣呈白色，菌絲內(nèi)部呈深綠色。在100倍油鏡下觀察，菌株孢子呈橢圓形，菌絲有隔膜，孢子與菌絲相連呈掃帚狀向外延伸。菌株MBYY-B1 在PDA培養(yǎng)基中生長速度較慢，菌落為圓形，邊緣整齊，菌落表面較為平整，菌絲長度較短，菌落整體呈土黃色，菌落邊緣呈白色。在100 倍油鏡下觀察菌株孢子呈圓形或橢圓形，菌絲有隔膜。菌株MBYY-C1在PDA培養(yǎng)基中生長速度緩慢，菌落為圓形，邊緣整齊，菌落表面不平整，呈棉絮狀，菌落整體呈白色，在100倍油鏡下觀察菌株孢子呈圓形，菌絲有隔膜。

圖1 菌株MBYY-A1、MBYY-B1和MBYY-C1菌落及鏡檢圖像Fig.1 Colonies and microscopic pictures of strains MBYY-A1，MBYY-B1 and MBYY-C1

霉變菌株在雪茄煙葉表面生長情況如圖2 所示。由圖可見，菌株MBYY-A1、MBYY-B1 和MBYY-C1 在無菌雪茄煙葉表面培養(yǎng)5 d 后，煙葉表面均出現(xiàn)大量霉變菌株菌絲，在煙梗處霉變菌株較多，根據(jù)1.2.1 中煙葉霉變等級的劃分可知3 株霉變菌株對煙葉的致霉性均達(dá)到4級。將霉變的煙葉中菌株接種至PDA 培養(yǎng)基中，可再次得到菌株MBYY-A1、MBYY-B1 和MBYY-C1，并且無雜菌出現(xiàn)，證明3株霉變菌株均為雪茄煙葉致霉菌。

圖2 菌株MBYY-A1、MBYY-B1和MBYY-C1致霉性圖像Fig.2 Mold causing ability pictures of strains MBYY-A1，MBYY-B1 and MBYY-C1

2.2 霉變微生物的鑒定

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在550 bp 處有單一且明亮的條帶，可用于菌株鑒定。菌株MBYY-A1、MBYY-B1和MBYY-C1 的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3～圖5 所示。BLAST比對 分析發(fā)現(xiàn)，菌株MBYY-A1、MBYY-B1 和MBYY-C1 分別與其匹配菌株的序列相似度為100%、100%和99.82%，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3～圖5，參考《真菌鑒定手冊》［24］相關(guān)形態(tài)學(xué)描述，初步確定菌株MBYY-A1、MBYY-B1 和MBYY-C1 分別為Talaromyces funiculosus、Scopulariopsis brevicaulis和Aspergillus occultus，分別屬于籃狀菌屬、帚霉屬和曲霉屬。

圖3 菌株MBYY-A1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain MBYY-A1

圖4 菌株MBYY-B1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain MBYY-B1

圖5 菌株MBYY-C1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain MBYY-C1

2.3 拮抗菌株的分離、篩選與鑒定

2.3.1 拮抗菌株的分離與純化

通過平板涂布法和對峙平板法篩選出2 株對霉變菌株具有拮抗效果的菌株，編號為a和C25。平板對峙試驗菌株拮抗效果如圖6所示。經(jīng)測量計算，可得菌株a 對MBYY-A1、MBYY-B1 和MBYY-C1 的R值分別為0.38、0.36 和0.4，菌株C25 對MBYY-A1、MBYY-B1 和MBYY-C1 的R值分別為0.33、0.32 和0.47，菌株a和C25拮抗效果良好。

圖6 菌株a和C25在PDA培養(yǎng)基中對菌株MBYY-A1、MBYY-B1和MBYY-C1的抑制效果Fig.6 Inhibitory effects of strains a and C25 against MBYY-A1，MBYY-B1 and MBYY-C1 in PDA medium

2.3.2 拮抗菌株的鑒定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1 500 bp處條帶明亮無明顯雜帶產(chǎn)生，可用于菌株鑒定。在100倍油鏡下菌株a和C25 鏡檢如圖7 所示，2 株菌株細(xì)胞均呈直桿狀、圓端，多以成對或鏈狀排列，革蘭氏染色結(jié)果為陽性。菌株系統(tǒng)發(fā)育樹如圖8和圖9所示，參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［25］可判斷菌株a 和C25 均為芽孢桿菌屬，分別為Bacillus subtilis和Bacillus halotolerans。

圖7 菌株a和C25鏡檢圖像Fig.7 Microscopic pictures of strains a and C25

圖8 菌株a系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8 Phylogenetic tree of strain a

圖9 菌株C25系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.9 Phylogenetic tree of strain C25

3 討論

從海南霉變雪茄煙葉中分離得到3 株對雪茄煙葉有較強(qiáng)致霉性的霉變菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定分別屬于籃狀菌屬、帚霉屬和曲霉屬菌株，其中曲霉屬微生物是報道較多的煙葉致霉菌，在云南和廣西等地烤煙中均有類似報道［14，18］?；@狀菌屬由于其最初只包括能產(chǎn)生裸囊殼和青霉?fàn)钪銧钪o性繁殖結(jié)構(gòu)的物種，故而被放在青霉的分類框架中來研究［26］。黃福新等［27］從廣西煙倉霉變烤煙中分離出4 個屬的霉變菌株，其中就包括青霉屬菌株。而由帚霉屬引起的煙葉霉變目前還未見報道。

在霉變雪茄煙葉未霉變部位篩選出2 株對霉變菌株有良好拮抗效果的芽孢桿菌，可為雪茄煙葉霉變的生物防治提供參考。目前生物防治雪茄煙葉霉變報道較少，僅見高地芽孢桿菌防控雪茄煙發(fā)酵霉變的專利［28］。本研究中僅運(yùn)用平板對峙法初步篩選出了拮抗菌株，并未將拮抗菌株應(yīng)用于雪茄煙葉的發(fā)酵，未來可模擬雪茄煙葉發(fā)酵條件，將芽孢桿菌用于雪茄煙葉的發(fā)酵試驗，并對發(fā)酵條件進(jìn)行深入研究。

4 結(jié)論

采用PDA培養(yǎng)基從海南霉變雪茄煙葉中分離出3株霉變菌株，經(jīng)鑒定分別為Talaromyces funiculosus、Scopulariopsis brevicaulis和Aspergillus occultus，3 株霉變菌株對雪茄煙葉均具有很強(qiáng)的致霉性。從海南霉變雪茄煙葉中分離純化出2株拮抗菌株，2株拮抗菌株對霉變菌株的R值在0.32 ～0.47之間，菌株拮抗效果良好。經(jīng)鑒定，2株拮抗菌株均為芽孢桿菌屬，初步鑒定為Bacillus subtilis和Bacillus halotolerans，可作為雪茄煙葉霉變生物防治的候選菌株。