羅崇玉，張利娜，姜 茜，周 璇，韓 麗，梁 燕，彭 晟，李作森，杜云龍*

1. 云南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，昆明市盤龍區(qū)灃源路452 號650201

2. 云南農(nóng)業(yè)大學煙草學院，昆明市盤龍區(qū)灃源路452 號 650201

3. 云南省蒙自市人民政府雨過鋪街道辦事處，云南省蒙自市尼蘇小鎮(zhèn)火把路1 號 661111

煙葉的香氣和香味是衡量煙葉及其制品質(zhì)量的重要指標。萜類化合物是香味物質(zhì)的重要組成部分［1］。萜類化合物通過參與合成次生代謝產(chǎn)物新植二烯、類胡蘿卜素和希柏烷類等香氣前體物質(zhì)，可以提高煙葉香氣品質(zhì)［2-4］。植物萜類化合物主要由甲羥戊酸途徑（Mevalonic acidpathway，MVA）合成，其代謝途徑利用MVA 生成萜類化合物中心前體異戊二烯焦磷酸（Isopentenyl pyrophosphate，IPP），并在IPP異構酶的作用下生成二甲基丙烯基二磷酸（Dimethylallyl Pyrophosphate，DMAPP），IPP 和DMAPP 以頭尾縮合的形式合成香葉基焦磷酸（Geranylpyrophosphate，GPP），在單萜環(huán)化酶的作用下形成單萜及其衍生物，GPP也可以與1分子IPP在法尼基焦磷酸合酶（Farnesyl pyrophasphate synthase，F(xiàn)PS）催化下反應生成法尼基焦磷酸（Farnesyl diphosphate，F(xiàn)PP），F(xiàn)PP是多萜化合物合成的原料，F(xiàn)PP 也可以在角鯊烯合酶（Squalene synthase，SS）的作用下經(jīng)過一系列的氧化還原反應得到三萜化合物及其衍生物［3,5］。薄荷中的萜類化合物合成關鍵基因FPS在煙草中異源過表達后，煙草中8種類胡蘿卜素降解產(chǎn)物及茄酮、新植二烯含量均有不同程度的提高［6］。酵母中的FPS基因轉入煙草后，煙草中的致香成分甾醇和類胡蘿卜素含量顯著增加［7］。SS所催化的反應是三萜化合物、甾醇、膽固醇等萜烯類物質(zhì)合成分支點，其活性高低決定著這些物質(zhì)的產(chǎn)量［8-9］。角鯊烯合成酶抑制劑Terbinafine處理煙草細胞會抑制煙草中的甾醇的合成［10］。角鯊烯合酶在不同物種間具有較高的同源性，酶活性中心高度保守，外源基因表達可提高相應的酶活性［11-12］。人參SS1的過表達可以增加轉基因刺五加［13］和人參［14］中植物甾醇和三萜類物質(zhì)的含量。煙草中異源表達反義的青蒿SS基因可降低植物甾醇的生物合成，并促進類異戊二烯途徑中以FPS為前體的其他代謝支路的生物合成［15］。三七（Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen）屬于五加科人參屬植物，是中國傳統(tǒng)的名貴中藥材。過表達三七的角鯊烯合成酶（Squalene synthase fromPanax notoginseng，PnSS）會增加三七中的三萜皂苷含量［16-17］，但PnSS 基因對煙草品質(zhì)的影響，以及能否在香料煙巴斯瑪14 號中表達PnSS基因來增加萜類物質(zhì)含量進而改善煙葉品質(zhì)尚不清楚。為此，克隆了PnSS基因，并轉化煙草品種巴斯瑪14 號，旨在為利用三七皂苷合成相關基因調(diào)節(jié)煙草萜類香味物質(zhì)含量并改善煙葉品質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

煙草品種巴斯瑪14號（Basma No. 14）由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院提供，含有PnSS基因的中間載體為本實驗室保存。

1.2 生物信息學分析

用 DNAMAN8 進 行PnSS（GeneBank no.KC953032）和NtSS（GeneBank no. NM_001325508）核酸序列和氨基酸序列的比對，用在線網(wǎng)站https：//prosite.expasy.org/prosite.html進行功能區(qū)域的預測。

1.3 植物表達載體構建

用引物對SSFP1和SSRP1（SSFP1：5'-ACGCGTC GACATGGGAAGTTTGGGGGCAATTC-3'，SSRP1：5'-TGGTTCTGCAGTCACTGTTTGTTCGGTAGTA G-3'）擴增PnSS基因的目的片段，并進行電泳驗證，然后膠回收DNA，通過測序檢測再次確認獲得的擴增目的片段。 將35S-GFP-terminator插入在pCAMBIA2300載體上的多克隆位點5'-EcoRI /HindIII-3'之間，獲得pCAMBIA2300-35S-GFP載體，之后用SalI及PstI切下GFP并插入PnSS基因替換GFP基因，用T4 DNA Ligase 進行連接，獲得表達載體pCAMBLA2300-35S::SS，并轉化農(nóng)桿菌GV3101 菌株。載體構建及菌株轉化由武漢雙螺旋生物科技有限公司完成。

1.4 煙草的轉化和陽性株系的鑒定

農(nóng)桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600= 0.5），通過葉盤法轉化煙草［18］。轉化PnSS的煙草在含有500 mg/L羧芐青霉素和50 mg/L 卡那霉素的MS 選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)。在篩選培養(yǎng)基上生長的苗長至0.5 cm 時，轉移到含有相應抗生素的1/2 MS 固體培養(yǎng)基上誘導生根。

取煙草葉片，利用CTAB法提取煙草DNA，用引物對SSFP2 和SSRP2（SSFP2：5'-ATGGGAAGTTTG GGGGCAATTCTGA-3'，SSRP2：5'-TCACTGTTTG TTCGGTAGTAGGTTT-3'）擴增PnSS基因。 PCR 程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性50 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 RNA提取、逆轉錄及real-time PCR分析

用EasyPure Plant RNA Kit（TransGen Biotech）試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）提取煙草根、莖、葉中的總RNA。對提取的總RNA 進行逆轉錄合成cDNA，逆轉錄反應體系：以5 μL總RNA為模板，加入4 μL 5 × TransScript All-in-One SuperMix for qPCR（北京全式金生物技術有限公司）和1 μL gDNA Remover，并加入10 μL RNase-free Water 配置成20 μL的反應體系。該反應體系在42 ℃金屬浴上孵育5 min，然后50 ℃反應15 min，75 ℃反應5 min 停止反應，獲得cDNA。通過ABI QuantStudio7 Flex（美國Applied Biosystems 公司）進行Real-time PCR 檢測煙草植株中PnSS基因的表達水平，Real-time PCR反應體系：以0.5 μL的cDNA為模板，加入5 μL 的Power Up TM SYBRTM Green Master Mix［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］，0.4 μL的正向引物（PnSS-rFP：5'-TTGCTGAAGTCCAAGGTTG ACA-3'）和0.4 μ L 的反向引 物（PnSS-rRP：5'-GGCTGAATTGTGTCCTGACTC-3'），并加入3.7 μL ddH2O 配置成10 μL 的反應體系。Real-time PCR 反應程序：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性45 s，56 ℃退火30 s，40 次循環(huán)；72 ℃延伸1 min。以NtActin1基因作為內(nèi)參基因（NaActin-rFP：5'-GGTCGTACCAC CGGTATTGTG-3'，NaAtin-rRP：5'-GTCAAGACGGA GAATGGCATG-3'）。進行3次生物學重復，采用2-ΔΔCt計算基因的相對表達量。使用SPSS 26.0 軟件分析基因的表達量差異。

1.6 香味物質(zhì)含量檢測

巴斯瑪14 號植株（野生型，OT5）和過表達PnSS基因的巴斯瑪14號植株（轉基因植株，PnSS）在生長4個月后，從植株頂部依次往下取第3～6片葉，單個株系所取樣品混合后在40 ℃烘箱中烘干，研磨成粉末，用0.42 mm篩子過濾殘渣，根據(jù)文獻［19］中的方法，采用456GC-TQ 固相微萃取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Bruker公司）檢測煙葉中的香味物質(zhì)含量（質(zhì)量分數(shù)）。

1.7 數(shù)據(jù)分析

對煙草植株株高和葉片大小的差異進行t檢驗。采用2-ΔΔCt分析轉基因煙草根、莖和葉中的PnSS基因的表達量，使用軟件SPSS 26.0分析基因的表達量差異。

2 結果與討論

2.1 PnSS基因的生物信息學分析

PnSS基因與煙草中的同源基因NtSS序列分析結果（圖1）顯示，PnSS與NtSS的核苷酸序列具有66.1%的一致性，氨基酸序列具有81.9%的一致性，并且都具有兩個角鯊烯和植烯合成酶（Squalene and phytoene synthases）結構域。

圖1 PnSS與NtSS氨基酸序列比對和功能區(qū)分析Fig.1 Amino acid sequence alignment and functional region analysis of PnSS and NtSS

2.2 過表達PnSS基因對煙株生長發(fā)育的影響

PnSS與NtSS具有較高的一致性（圖1），將含有PnSS基因的植物表達載體（圖2）通過農(nóng)桿菌介導的方法轉化到煙草中，獲得5株在篩選培養(yǎng)基上生長的轉化PnSS基因的煙草。隨機挑選4株經(jīng)抗生素篩選成功的轉化PnSS基因的煙株，通過PCR檢測轉基因植株中的PnSS基因，獲得2株含有PnSS基因的煙草植株（圖3A）。

圖2 含有PnSS基因的表達載體示意圖Fig.2 Schematic diagram of expression vector containing PnSS gene

對含有PnSS基因的轉基因煙草進一步進行植株表型觀察。表型結果（圖3A～圖3D）顯示，與野生型植株（n=11）相比，轉基因煙草植株（n=14）變矮，葉片變?。▓D3A～圖3D）。同時，在轉基因煙草植株的根、莖和葉中，PnSS基因在葉片中的表達量最高（圖3E）。表明過表達PnSS基因會抑制煙草植株的生長發(fā)育。

圖3 PnSS基因的過表達對煙草植株生長發(fā)育的影響Fig.3 Effects of overexpression of PnSS gene on growth and development of tobacco plant

2.3 過表達PnSS基因對煙草中香味物質(zhì)含量的影響

轉基因煙草葉片中香味物質(zhì)含量檢測結果（表1）表明，PnSS基因的過表達使煙葉中乙酸、糠醇、4，6-二甲基嘧啶、苯乙醛、3，5-二甲基苯甲醛、二烯煙堿、二氫獼猴桃內(nèi)酯、2-甲基吡嗪、壬酸、異戊醛、2-甲基丁醛、西松烯和煙堿13種香味物質(zhì)含量增加，2，3-二氫-3，5二羥基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮、2，3-聯(lián)吡啶、植醇、苯乙醇、新植二烯、苯甲醛和麥斯明7種香味物質(zhì)含量降低。表明PnSS基因的過表達影響了煙葉中香味物質(zhì)含量。

表1 煙葉樣品中香味物質(zhì)的含量Tab.1 Relative contents of aroma components in tobacco leaves

3 討論

萜類香味物質(zhì)在煙草品質(zhì)評價中具有重要作用。植物中SS基因和FPS基因是萜類物質(zhì)合成途徑中的關鍵基因，F(xiàn)PS基因位于SS基因上游［3,5,20］。在本研究中發(fā)現(xiàn)，過表達PnSS基因會抑制煙草植株的生長發(fā)育，這與前人的研究結果一致，茶樹FPS基因在煙草中異源過表達也會抑制煙草植株的生長發(fā)育［21］，這顯示萜類合成基因調(diào)控了植株的生長發(fā)育。但萜類物質(zhì)如二烯煙堿、植醇、新植二烯的含量變化如何影響過表達PnSS煙草植株的表型還需進一步試驗。

本研究中對煙草香味物質(zhì)含量變化的分析發(fā)現(xiàn)，在過表達PnSS基因的煙草中新植二烯含量減少，這與前人的研究結果不一致。薄荷FPS基因在煙草中過表達會導致煙葉中新植二烯含量增加［6］，這暗示在煙草中過表達PnSS基因時PnSS基因可能參與了不同代謝途徑，從而導致新植二烯含量發(fā)生變化，但煙草中FPS基因是否與PnSS基因共同調(diào)控煙草中新植二烯等萜類物質(zhì)的合成還需進一步深入研究。

4 結論

三七PnSS 的氨基酸序列與煙草中同源物具有高度一致性，在煙草中過表達PnSS基因后，PnSS基因的表達量在葉片中最高，同時過表達PnSS基因的煙草植株變矮、葉片變小、葉片中與香味有關的萜類物質(zhì)含量發(fā)生改變。因此，PnSS基因可影響煙葉中萜類物質(zhì)等香味物質(zhì)的合成并參與調(diào)控煙草植株的生長發(fā)育。