腸道類器官在畜禽營(yíng)養(yǎng)中的研究進(jìn)展

王 丹 劉玉蘭

(武漢輕工大學(xué)，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430023)

腸上皮是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，其具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞特征，不僅參與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，而且在機(jī)體免疫防御中也發(fā)揮著重要作用。以往腸道體外研究主要以2D培養(yǎng)的腸道上皮細(xì)胞系為模型，但這些細(xì)胞系不能充分反映腸道形態(tài)生理的相關(guān)性和腸道分化功能，且在培養(yǎng)過(guò)程中也易突變。隨著腸道干細(xì)胞研究的發(fā)展，產(chǎn)生了一種新的研究模型，稱為腸道類器官。腸道類器官不僅能還原腸道組織復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，也能模擬腸道的生理環(huán)境，是腸道研究比較精準(zhǔn)的體外模型。腸道類器官由位于隱窩底部的腸道干細(xì)胞分化而來(lái)。腸道干細(xì)胞增殖產(chǎn)生過(guò)渡擴(kuò)增(transit amplifying,TA)細(xì)胞，這些細(xì)胞由隱窩底部向絨毛頂端遷移并分化，形成成熟的完全分化的腸道功能細(xì)胞，構(gòu)成了腸道的隱窩-絨毛結(jié)構(gòu)[1]。腸道類器官的培養(yǎng)受多種信號(hào)通路的精準(zhǔn)調(diào)控，例如Wnt、Notch和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)等。目前，隨著豬、雞、牛和羊等畜禽腸道類器官培養(yǎng)技術(shù)的建立[2-6]，腸道類器官已應(yīng)用于畜禽營(yíng)養(yǎng)吸收評(píng)價(jià)、腸上皮發(fā)育以及腸道微生物等方面的研究。本文將綜述腸道類器官在畜禽營(yíng)養(yǎng)中的研究進(jìn)展，旨在為畜禽飼料添加劑的開(kāi)發(fā)、動(dòng)物腸道疾病的治療提供嶄新的思路和方向。

1 腸道干細(xì)胞與腸道類器官

1.1 腸道干細(xì)胞

腸道由單層上皮細(xì)胞組成，并具有典型的隱窩-絨毛結(jié)構(gòu)。腸上皮通常3～4 d完成1次更新。這種快速更新使得腸道在復(fù)雜的環(huán)境中具有良好的屏障功能和自我保護(hù)能力。腸道干細(xì)胞是一種位于隱窩基底部，具有自我更新和分化為腸上皮功能細(xì)胞的成體干細(xì)胞。目前的研究認(rèn)為，腸道干細(xì)胞存在2種類型：一種是位于隱窩基部的隱窩基部柱狀(crypt base columnar，CBC)細(xì)胞，也稱為活躍型腸道干細(xì)胞；另一種是位于隱窩+4位置(隱窩基底部之上的第4層細(xì)胞)的干細(xì)胞，也稱為沉默型腸道干細(xì)胞。2007年，有研究團(tuán)隊(duì)使用體內(nèi)譜系追蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)，CBC細(xì)胞特異性表達(dá)富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體5(Lgr5)基因，并發(fā)現(xiàn)整個(gè)隱窩的各種成熟細(xì)胞(包括潘氏細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和腸內(nèi)分泌細(xì)胞)均來(lái)源于Lgr5細(xì)胞，首次證明隱窩底部的Lgr5+細(xì)胞為腸道干細(xì)胞[1]。CBC干細(xì)胞除分子標(biāo)志物L(fēng)gr5外，還包括嗅質(zhì)蛋白4(Olfm4)和Achaete-Scute家族BHLH轉(zhuǎn)錄因子(Ascl2)等，這類細(xì)胞具有增殖快速且對(duì)放射線敏感等特點(diǎn)[7]。沉默型腸道干細(xì)胞的分子標(biāo)志物有Bmi1、僅有同源結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)同源框(Hopx)和小鼠端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(m-Tert)等，這類細(xì)胞的特點(diǎn)是增殖緩慢且對(duì)放射線不敏感[7]。在正常生理?xiàng)l件下，CBC干細(xì)胞快速增殖為TA細(xì)胞并分化成各種腸道功能細(xì)胞來(lái)維持腸道自我更新和再生。當(dāng)腸道受損時(shí)，Lgr5干細(xì)胞會(huì)大量的丟失，且無(wú)法滿足腸上皮的快速修復(fù)，會(huì)進(jìn)一步啟動(dòng)沉默型腸道干細(xì)胞的功能。沉默型腸道干細(xì)胞會(huì)轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)gr5干細(xì)胞或功能細(xì)胞的前體細(xì)胞(如潘氏細(xì)胞的前體)，進(jìn)而分化為各種腸道功能細(xì)胞促進(jìn)腸上皮再生[8]。

1.2 腸道類器官

腸道類器官由腸道干細(xì)胞增殖和分化而來(lái)，首先形成具有單個(gè)中央管腔的空心小球，隨后向外突出形成具有隱窩狀的萌芽結(jié)構(gòu)。2009年，Sato等[9]首次分離了小鼠的單個(gè)Lgr5腸道干細(xì)胞，將其與基質(zhì)膠混合形成3D骨架結(jié)構(gòu)，并添加一些必需生長(zhǎng)因子，如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、Noggin(BMP通路抑制劑)、Wnt3a和R-spondin1(Wnt信號(hào)激活)，成功培養(yǎng)了具有球狀3D結(jié)構(gòu)的腸道類器官。腸道類器官包含單層腸上皮的所有細(xì)胞，球體的內(nèi)部類似于腸腔，可容納脫落的細(xì)胞和代謝產(chǎn)物。腸道類器官成熟后，可通過(guò)出芽的方式形成更多的類器官，可持續(xù)傳代培養(yǎng)并保持遺傳信息的穩(wěn)定。與腸道組織類似，腸道類器官含有所有種類的腸上皮功能細(xì)胞，包括腸上皮吸收細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞和簇細(xì)胞[9]。腸上皮中復(fù)雜的細(xì)胞種類決定了腸道的多種生理功能，如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、激素的分泌、病原菌的抵御以及先天免疫反應(yīng)等。

2 腸道類器官生長(zhǎng)的信號(hào)通路

2.1 Wnt信號(hào)通路

腸道類器官的生長(zhǎng)主要依賴于腸道干細(xì)胞的增殖和分化。Wnt信號(hào)是調(diào)節(jié)腸道類器官生長(zhǎng)關(guān)鍵的信號(hào)通路之一，常與BMP、Notch等信號(hào)通路發(fā)生協(xié)同或拮抗的相互作用。Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號(hào)能激活腸道干細(xì)胞中的Lgr5和Bmi1表達(dá)，并誘導(dǎo)干細(xì)胞增殖[10]。Wnt配體和膜上的卷曲受體蛋白(Frizzleds)以及共受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6(LRP5/6)結(jié)合后，會(huì)抑制大腸腺瘤息肉蛋白(APC)對(duì)β-catenin磷酸化引起的降解，β-catenin與核膜蛋白互作，進(jìn)入細(xì)胞核與T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子4(TCF4)結(jié)合，啟動(dòng)下游靶基因c-Myc和細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞增殖。研究表明，激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路可以促進(jìn)干細(xì)胞對(duì)稱分裂和祖細(xì)胞去分化[11]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路不僅調(diào)控Lgr5的表達(dá)，同時(shí)也受Lgr5的反饋調(diào)控[12]。研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路只有在R-spondin存在的情況下才可能被激活，而腸道干細(xì)胞標(biāo)志物L(fēng)gr5作為R-spondin的受體通過(guò)穩(wěn)定結(jié)合β-catenin增強(qiáng)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)[13]。Lgr5在細(xì)胞膜上與Wnt受體LRP6和卷曲受體蛋白相互作用能增強(qiáng)Wnt/β-catenin信號(hào)通路[12]。因此，培養(yǎng)基中常添加Wnt信號(hào)通路的激活劑，如Wnt3a和R-spondin等生長(zhǎng)因子來(lái)促進(jìn)腸道類器官的擴(kuò)增。

2.2 BMP信號(hào)通路

BMP參與腸道的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。BMP在腸上皮的絨毛區(qū)域中高度表達(dá)，但在隱窩底部表達(dá)量較低[14]。研究表明，BMP信號(hào)能夠促進(jìn)上皮細(xì)胞的分化，且抑制隱窩的生長(zhǎng)[15]。此外，BMP也能抑制β-catenin的活性以及負(fù)調(diào)控腸道干細(xì)胞的增殖[15]。轉(zhuǎn)基因表達(dá)Noggin能夠抑制BMP信號(hào)，誘導(dǎo)絨毛中異位隱窩的形成，并伴隨著腸道干細(xì)胞數(shù)量的增加[15]。條件性敲除BMP受體BMPr1a能夠引起腸道干細(xì)胞的過(guò)度增殖和隱窩數(shù)量的增加[15]。BMP的配體BMP2和BMP4通過(guò)結(jié)合其Ⅱ型受體和募集Ⅰ型受體(Bmpr1a或Bmpr1b)，將信號(hào)通過(guò)SMAD轉(zhuǎn)錄因子從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核。BMP能夠防止一種抑癌基因同源性磷酸酶-張力蛋白(PTEN)磷酸化失活，維持PTEN的活性。PTEN通過(guò)抑制磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)，進(jìn)而降低蛋白激酶B(Akt)的表達(dá)和β-catenin活性[15]。因此，培養(yǎng)基中常添加BMP拮抗劑Noggin以促進(jìn)腸道類器官隱窩的形成[16]。

2.3 Notch信號(hào)通路

Notch信號(hào)通路對(duì)于控制腸道干細(xì)胞的分化至關(guān)重要[17]。當(dāng)Notch受體和其配體Delta樣配體1(Dll1)、Delta樣配體4(Dll4)結(jié)合時(shí)，能夠在γ-分泌酶(γ-secretase)的作用下釋放出Notch胞內(nèi)片段(NICD)，NICD轉(zhuǎn)移到核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子CSL結(jié)合影響下游靶基因[Hes1和無(wú)調(diào)性同源蛋白1(Atoh1)]的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控腸道干細(xì)胞的增殖和分化。多項(xiàng)研究表明，Notch信號(hào)通路能夠控制腸道干細(xì)胞向分泌型細(xì)胞分化的命運(yùn)[18]。Notch能夠激活Hes1的表達(dá)進(jìn)而抑制Math1基因轉(zhuǎn)錄，而Math1是腸道干細(xì)胞向分泌型細(xì)胞分化的調(diào)控者。Hes1缺失能夠增加分泌型細(xì)胞，減少腸上皮細(xì)胞數(shù)量[19]；而Math1的缺失將導(dǎo)致所有分泌型細(xì)胞的缺失[20]；Math1過(guò)量表達(dá)引起小鼠腸絨毛變短、TA細(xì)胞減少，分泌型細(xì)胞增多以及腸細(xì)胞的缺失[21]。因此，激活Notch信號(hào)將會(huì)引起隱窩增殖細(xì)胞擴(kuò)增，并抑制其向分泌型細(xì)胞分化。在類器官培養(yǎng)中常通過(guò)添加Notch信號(hào)的調(diào)節(jié)因子如丙戊酸、組蛋白去乙?；敢种苿﹣?lái)維持干細(xì)胞的數(shù)量，促進(jìn)其向成熟的腸上皮細(xì)胞分化。

2.4 Hippo信號(hào)通路

Hippo信號(hào)通路最初在果蠅中被認(rèn)為是高度保守的信號(hào)。在哺乳動(dòng)物中，機(jī)械刺激會(huì)導(dǎo)致核心Hippo通路的激活，其中絲氨酸/蘇氨酸激酶MST1/2、SAV1、LATS1/2和MOBKL1A/1B參與激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄共激活因子YAP和TAZ的磷酸化。YAP和TAZ的磷酸化會(huì)導(dǎo)致它們被排除在細(xì)胞核之外并無(wú)法調(diào)控基因的表達(dá)。相反，在沒(méi)有Hippo通路信號(hào)傳導(dǎo)下，去磷酸化形式的YAP和TAZ位于細(xì)胞核，并與TEAD轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用并激活增殖相關(guān)基因的表達(dá)[22]。Hippo信號(hào)通路在腸道干細(xì)胞中的作用已被廣泛的研究。過(guò)表達(dá)YAP1的活性形式能抑制腸細(xì)胞的增殖并伴隨著Olfm4干細(xì)胞的丟失，而腸道上皮特異性敲除YAP1盡管不影響正常情況下的腸道功能，但在輻射損傷時(shí)會(huì)導(dǎo)致腸道過(guò)度生長(zhǎng)和Lgr5+干細(xì)胞大量擴(kuò)增[23]。相關(guān)研究表達(dá)，YAP1通過(guò)維持干細(xì)胞池參與早期腸道的再生，而晚期過(guò)度增殖與YAP和TAZ無(wú)關(guān)[24]。在腸道再生中，機(jī)械刺激調(diào)節(jié)Hippo通路可改變生態(tài)位和隱窩結(jié)構(gòu)來(lái)調(diào)控腸道干細(xì)胞的生物學(xué)功能。

3 腸道類器官在畜禽營(yíng)養(yǎng)研究中的應(yīng)用

3.1 營(yíng)養(yǎng)素吸收研究

腸道類器官模擬體外器官組織培養(yǎng)，能夠精準(zhǔn)反映畜禽動(dòng)物體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)素的吸收代謝特性。腸道類器官中的一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的關(guān)鍵酶和基因與腸道組織具有高度的一致性。研究表明，吸收細(xì)胞的分子標(biāo)志物[腸道堿性磷酸酶(ALPI)、角蛋白20(KRT20)]、消化酶(蔗糖酶-異麥芽糖酶)和離子/營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(MCT1)、鈉依賴型葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(SGLT1)和鈉氫交換蛋白3(NHE3)]均在豬、兔、雞和牛腸道類器官中表達(dá)[2-6,25-29]。在豬和雞的腸道類器官中也能觀察到成熟腸道組織的微絨毛[27,30]。此外，豬、兔和牛的腸道類器官中也表達(dá)內(nèi)分泌細(xì)胞的標(biāo)記基因酪酪肽(PYY)和嗜鉻粒蛋白A(CHGA)，這些基因參與消化酶的分泌[27,29]。以往的研究常用2D單層細(xì)胞來(lái)評(píng)價(jià)營(yíng)養(yǎng)素的吸收能力，即營(yíng)養(yǎng)素從頂端轉(zhuǎn)運(yùn)到上皮細(xì)胞的基底外側(cè)的過(guò)程[31]。最近，越來(lái)越多研究者采用腸道類器官來(lái)評(píng)價(jià)營(yíng)養(yǎng)素對(duì)腸上皮穩(wěn)態(tài)的影響。Hou等[32]采用精氨酸處理雞腸道類器官后發(fā)現(xiàn)，精氨酸能通過(guò)維持腸道干細(xì)胞增殖和潘氏細(xì)胞數(shù)量來(lái)緩解炎性刺激引起的腸道類器官損傷。Zhu等[33]以豬的腸道類器官為模型探究了谷氨酸對(duì)腸上皮細(xì)胞自我更新的影響。Wang等[34]采用維生素A處理仔豬腸道類器官后發(fā)現(xiàn)，維生素A能減少分化細(xì)胞的出芽和標(biāo)志基因的表達(dá)，同時(shí)增加干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)?？傊?，以腸道類器官替代腸道細(xì)胞系為模型將會(huì)是未來(lái)營(yíng)養(yǎng)學(xué)體外研究的重要方向。

3.2 病原菌與宿主互作研究

腸道類器官模型可用于模擬病原菌對(duì)腸道上皮的感染過(guò)程。借助腸道類器官，研究者可以深入剖析病原菌的入侵方式(在基底外側(cè)或頂端)、細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和繁殖以及逃逸的分子機(jī)制。目前，已成功建立了多種病原體感染畜禽腸道類器官的模型。在豬的腸道類器官上，已成功建立了豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬三角冠狀病毒(PDCoV)的感染模型[35-37]。在牛上，也成功建立了感染鼠傷寒沙門氏菌、剛地弓形蟲和輪狀病毒的腸道類器官模型[38]。這些感染模型可以完全替代試驗(yàn)動(dòng)物，大大降低了動(dòng)物的使用成本。采用類器官培養(yǎng)，研究者可以更進(jìn)一步探究病原體的入侵機(jī)制，如病菌主要黏附于哪種腸上皮細(xì)胞類型或識(shí)別哪段腸道部位。例如，PEDV和PDCoV主要感染豬的腸上皮細(xì)胞、腸道干細(xì)胞和杯狀細(xì)胞，在豬小腸的易感性要比結(jié)腸高[28]。另外，腸道類器官也可用于研究由腸道病原體引發(fā)的上皮細(xì)胞先天免疫反應(yīng)，而用單一的腸道細(xì)胞系是無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。

3.3 腸道微生物與上皮互作研究

腸道微生物在維持腸道上皮的消化吸收、屏障和防御功能中發(fā)揮著重要作用。腸道類器官作為一種精準(zhǔn)的體外模型，已被廣泛地研究腸道微生物與上皮細(xì)胞之間的互作關(guān)系。這方面的研究目前主要集中在小鼠和人，在畜禽動(dòng)物中的研究較少。以小鼠腸道類器官為模型，Hou等[39]發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌能保護(hù)腸道的屏障功能并激活腸道干細(xì)胞的增殖來(lái)促進(jìn)腸道的損傷修復(fù)。在結(jié)腸類器官中通過(guò)顯微注射能成功建立一個(gè)模擬人類復(fù)雜的腸道微生物群與結(jié)腸互作的模型[40]。Pierzchalska等[41]以雞胚腸道類器官為模型，發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌能促進(jìn)了雞胚腸道上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。最近一項(xiàng)研究以兔盲腸類器官為模型來(lái)探究斷奶后腸道微生物死亡變化對(duì)腸道發(fā)育的影響，結(jié)果顯示，從哺乳到斷奶的過(guò)渡期腸道微生物代謝物的變化會(huì)調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞中的基因表達(dá)，并有助于腸道屏障的成熟[42]。腸道微生物與類器官共培養(yǎng)體系的建立是微生物研究領(lǐng)域的重大突破。未來(lái)的研究需要進(jìn)一步開(kāi)發(fā)不同畜禽動(dòng)物腸道類器官-微生物的共培養(yǎng)體系，以及多種腸道微生物與類器官共培養(yǎng)體系。

4 小 結(jié)

腸道類器官的培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展為畜禽動(dòng)物的腸道研究提供了許多便利。經(jīng)過(guò)多年的努力，目前已成功培養(yǎng)了多種畜禽動(dòng)物的腸道類器官。盡管如此，這些畜禽動(dòng)物的腸道類器官培養(yǎng)體系還不夠完善，培養(yǎng)條件仍需要進(jìn)一步優(yōu)化。例如：1)目前類器官的3D培養(yǎng)主要依賴動(dòng)物來(lái)源的基質(zhì)膠，而這些基質(zhì)膠成分復(fù)雜，批次穩(wěn)定性不高，在質(zhì)控上難以把控；2)目前腸道類器官僅僅包含了腸上皮細(xì)胞，而不含有成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞、血管細(xì)胞等基質(zhì)細(xì)胞，這些特征與腸道組織的環(huán)境還存在一定的差異，在很大程度上限制其在其他領(lǐng)域的應(yīng)用；3)由于腸道類器官的生長(zhǎng)存在一定的邊緣效應(yīng)，往往處于基質(zhì)膠外圍的類器官尺寸較大，而處于基質(zhì)膠中間的尺寸偏小，導(dǎo)致腸道類器官的均一性較差，該一系列特點(diǎn)使得類器官的定量分析存在一定的難度。腸道類器官的共培養(yǎng)僅僅能反映營(yíng)養(yǎng)素或微生物與腸道隱窩的互作，而體內(nèi)的這些物質(zhì)是直接與腸上皮細(xì)胞接觸的。因此，類器官腸腔顯微注射技術(shù)也許能更好地解決這一難點(diǎn)。目前，大多數(shù)畜禽動(dòng)物腸道類器官僅僅是作為一種研究模型，未來(lái)可能在干細(xì)胞治療、器官移植等方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值。