鄭文, 洪暉娟, 蔡娟娟, 陳赟, 黃春美

樹蘭(杭州)醫(yī)院 1藥學(xué)部， 2腎臟病科(浙江杭州 310015)； 3浙江省立同德醫(yī)院感染管理科(浙江杭州 310012)

目前治療腎功能衰竭較為有效的方法便是腎移植。但急性排斥反應(yīng)(acute rejection)又是導(dǎo)致新發(fā)終末期腎病的主要原因[1-2]。急性排斥表現(xiàn)為移植術(shù)后1 h至6個(gè)月內(nèi)，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱疼痛、移植物腫大、移植物功能突然減退等。及時(shí)且有效地對(duì)腎移植排斥反應(yīng)進(jìn)行治療，可以大大提高腎移植成功率?？谷薚細(xì)胞兔免疫球蛋白(ATG-FreseniusS)是目前臨床常用的多克隆抗體，通過殺傷淋巴細(xì)胞而用于器官移植的免疫誘導(dǎo)及急性排斥反應(yīng)的治療[3]。美國和歐洲[4]多個(gè)大型肝、腎移植中心研究顯示：他克莫司治療比標(biāo)準(zhǔn)CsA療法急性排斥反應(yīng)的發(fā)生率低。目前臨床中主要采用他克莫司減輕腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)，雖然取得了一定的效果，但是患者的不良反應(yīng)較多。因此，本文主要探討抗人T細(xì)胞兔免疫球蛋白聯(lián)合他克莫司治療腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年12月至2021年9月接受治療的腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)患者90例為研究對(duì)象，男48例，女42例，年齡24～61歲，病程1～6 d。使用數(shù)字盲法進(jìn)行隨機(jī)分組，分為對(duì)照組、觀察組各45例。兩組患者年齡、性別、病程、臨床癥狀等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)根據(jù)組織學(xué)檢查結(jié)果或?qū)嶒?yàn)室檢查、影像學(xué)檢查的結(jié)果診斷為急性排斥反應(yīng)，診斷符合《泌尿外科學(xué)》[5]；(2)首次接受同種異體腎移植的受者；(3)突發(fā)不明原因發(fā)熱、尿量顯著減少、血壓升高，移植腎區(qū)脹痛、關(guān)節(jié)肌肉酸痛、心動(dòng)過速、全身乏力等臨床癥狀。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)聯(lián)合其他器官移植患者；(2)對(duì)本研究藥物過敏者；(3)精神異常者；(4)哺乳期或妊娠期。

本研究所有患者本人及家屬均知情，簽署知情同意書，經(jīng)我院倫理會(huì)批準(zhǔn)通過(KY2022023)。

1.2 治療方法 對(duì)照組給予他克莫司治療(杭州中美華東制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字：H20084386，規(guī)格；0.5 mg*50粒)餐后口服，10 mg/d。觀察組在對(duì)照組的基礎(chǔ)上聯(lián)合抗人T細(xì)胞兔免疫球蛋白(注冊(cè)證號(hào)S20090069，安斯泰來制藥(中國)有限公司，100 mg/5 mL)靜脈滴注，100 mg/d，兩組均進(jìn)行7 d治療。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 HLA-Ⅰ類抗原分型采用T磁珠分離 外周血T淋巴細(xì)胞,與補(bǔ)體一起加入Ⅰ類板中，孵育，染色，觀察結(jié)果，確定抗原分型。HLA-Ⅱ類DNA分型，采用順序特異引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法，外周血的模板DNA，將DNA與Tag酶的混合物加入含引物序列的擴(kuò)增管中，PCR擴(kuò)增，電泳，拍照，確定等位基因。PRA水平的檢測(cè)，將患者血清加入到包被HLA-Ⅰ、Ⅱ類抗原混合板中，用PRA檢測(cè)系統(tǒng)軟件分析結(jié)果。

1.3.2 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清IgG表達(dá) 對(duì)酶標(biāo)板進(jìn)行標(biāo)記、對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋，然后設(shè)置成標(biāo)準(zhǔn)、空白、檢測(cè)孔，標(biāo)準(zhǔn)孔添加標(biāo)準(zhǔn)品，空白孔添加終止液、顯色劑，檢測(cè)孔添加血清標(biāo)本及抗體，封膜并搖晃均勻，在35℃保溫箱內(nèi)靜置保存65 min后，給予去膜清洗，將水分吸干后各孔添加顯色劑并搖晃均勻，待顯色后加入終止液，空白孔為基準(zhǔn)，使用酶標(biāo)分析儀400 nm處測(cè)吸光值，計(jì)算IgG表達(dá)。

1.3.3 采用RT-PCR法測(cè)定IL-12P70、IL-4、IFN-γ相對(duì)表達(dá)量 采用IL-12P70、IL-4提取分離試劑盒(北京義翹神州科技有限公司)、IFN-γ試劑盒(上海繼和生物科技有限公司)提取血液內(nèi)RNA，用RTFQ-PCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將cDNA，產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。條件參數(shù)為預(yù)火90℃預(yù)變性15 s，取出降溫至80℃，變性10 s，迅速降溫至65℃，退火10 s，溫度保持55℃，延伸4 s，30個(gè)循環(huán)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算IL-12P70、IL-4、IFN-γ相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 治療效果評(píng)定[6]患者接受治療后，臨床癥狀減少(沒有出現(xiàn)或較少出現(xiàn)發(fā)熱疼痛狀況、移植物狀態(tài)穩(wěn)定等)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢查(通過在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行物理、化學(xué)的檢查來確定送檢物質(zhì)的內(nèi)容、性質(zhì)、數(shù)量等特性)、影像學(xué)檢查(包括X光檢查、CT檢查、磁共振檢查、超聲檢查以及核醫(yī)學(xué)檢查，觀察患者的影像檢查結(jié)果)發(fā)現(xiàn)病情改善為顯效(在實(shí)驗(yàn)室對(duì)患者血清的IL-12P70、IL-4、IFN-γ進(jìn)行物理、化學(xué)的檢查，檢查物表現(xiàn)均趨向良性發(fā)展；影像檢查中出現(xiàn)趨向好轉(zhuǎn)影像)；患者接受治療后，臨床癥狀較減少，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢查、影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)病情有所改善為好轉(zhuǎn)；患者接受治療后，臨床癥狀沒有發(fā)生變化甚至加重，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢查、影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)病情沒變化(檢查物仍然呈現(xiàn)出不良狀態(tài)、影像檢查無明顯變化)或加重(檢查物不良狀態(tài)加劇、影像檢查中不良影像表現(xiàn)增多)為無效。總有效率=(顯效例數(shù)+好轉(zhuǎn)例數(shù))/總例數(shù)×100%。觀察兩組患者不良反應(yīng)情況(低血壓、休克、高血壓、心悸),統(tǒng)計(jì)兩組患者不良反應(yīng)發(fā)生率。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者治療前后HLA及血清免疫球蛋白水平比較 兩組治療前HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ、IgG表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組治療后HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ、IgG表達(dá)水平低于兩組治療前；觀察組治療后HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ、IgG表達(dá)水平低于對(duì)照組治療后(P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者治療前后HLA及血清免疫球蛋白水平比較

2.2 兩組患者治療前后血清IL-12P70、IFN-γ、IL-4表達(dá)比較 兩組治療前IL-12P70、IFN-γ、IL-4表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組治療后IL-12P70、IFN-γ、IL-4表達(dá)低于兩組治療前；觀察組治療后IL-12P70、IFN-γ、IL-4表達(dá)低于對(duì)照組治療后(P<0.05)。見表3。

表3 兩組患者治療前后IL-12P70、IFN-γ、IL-4表達(dá)比較

2.3 兩組患者不良反應(yīng)發(fā)生情況比較 觀察組不良反應(yīng)發(fā)生率與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=1.047,P=0.306)。見表4。

表4 兩組患者不良反應(yīng)發(fā)生情況比較 例(%)

2.4 兩組患者治療有效率比較 觀察組治療總有效率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=7.601，P<0.05)。見表5。

表5 兩組患者治療有效率比較 例(%)

3 討論

移植腎失敗的主要原因是術(shù)后的急性排斥反應(yīng)所導(dǎo)致的，也是影響其長期存活和功能的重要因素[7]。伴隨著人們普遍應(yīng)用新型免疫抑制劑從而導(dǎo)致急性排斥反應(yīng)臨床表現(xiàn)不典型,增高了難治率,因此，抗人T細(xì)胞兔免疫球蛋白聯(lián)合他克莫司減輕腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)是目前的研究方向。

他克莫司又稱之為FK506，是鈣調(diào)磷酸酶抑制劑的一種，具有高度免疫抑制作用[8]。他克莫司的關(guān)鍵作用是通過抑制T細(xì)胞中產(chǎn)生的鈣離子依賴型信息傳導(dǎo)路徑，從而對(duì)淋巴因子基因的轉(zhuǎn)錄起到影響作用，不僅影響T細(xì)胞的活性還抑制T細(xì)胞依賴B細(xì)胞的增生作用[9]。他克莫司常用于治療器官移植后抑制急性排斥反應(yīng)，能夠使腎臟以及肝臟移植有特效，只要是因?yàn)闇p緩了T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫[10]?？谷薚細(xì)胞兔免疫球蛋白對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)既有極大的抑制作用，并對(duì)B細(xì)胞的活化具有選擇性預(yù)防，臨床主要用于預(yù)防、治療器官移植術(shù)后患者的排斥反應(yīng)，對(duì)治療排斥反應(yīng)有很好的效果[11]?？谷薚細(xì)胞兔免疫球蛋白具有免疫抑制作用，其安全性已經(jīng)得到證實(shí)。研究表明[12]，治療移植物急性排斥反應(yīng)使用抗人T細(xì)胞兔免疫球蛋白抗體誘導(dǎo)治療其效果較為顯著。本研究顯示抗人T細(xì)胞兔免疫球蛋白聯(lián)合他克莫司減輕腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)具有良好的效果。Esposito等[13]研究結(jié)果顯示肝移植、腎移植、心臟移植、胰腺移植等的排斥反應(yīng)與HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ有一定的聯(lián)系，移植體上的HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ會(huì)參與機(jī)體抗體的結(jié)合過程，對(duì)移植后的排斥反應(yīng)具有一定的影響作用。HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ主要存在于人類的血清以及體液中分子的可溶性形式，能夠很好地觀察移植排斥反應(yīng)情況。有報(bào)道[14]，在移植模型中，發(fā)現(xiàn)移植時(shí)受體已經(jīng)存在抗體的低水平IgG抗體，移植后這些IgG水平迅速上升，且在發(fā)生排斥時(shí)，異種移植物中有IgG和補(bǔ)體的廣泛沉積。本文研究指出，抗人T細(xì)胞兔免疫球蛋白聯(lián)合他克莫司治療可以降低HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ、IgG表達(dá)，從而控制患者病情發(fā)展。

他克莫司不僅作用于T細(xì)胞[15]，還能減少IL-12P70、IL-4及IFN-γ等生成以及受體的表達(dá)[16]。他克莫司經(jīng)常在移植出現(xiàn)的急性反應(yīng)中應(yīng)用，因?yàn)樗四究梢允筎淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫得到移植，療效較為顯著[17]。IL-12P70、IL-4及IFN-γ，可以讓淋巴細(xì)胞得到活化，還能是活化的T細(xì)胞得到分化，B細(xì)胞得到增殖，是機(jī)體調(diào)控免疫應(yīng)答的重要因子，IL-12P70、IL-4及IFN-γ能夠使免疫效應(yīng)器細(xì)胞得到激發(fā)，進(jìn)而是各種繼發(fā)的細(xì)胞因子得到產(chǎn)生[18]。免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生常伴有IL-12P70、IL-4及IFN-γ基因高表達(dá)，在器官移植后，通過減少IL-12P70、IL-4及IFN-γ等因子的分泌可以阻斷抗原遞呈作用，已被證實(shí)[19]?？谷薚細(xì)胞兔免疫球蛋白聯(lián)合他克莫司主要通過減少鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白磷酸酶來抑制活化的T細(xì)胞核因子的活性，減少IL-12P70、IL-4及IFN-γ的表達(dá)發(fā)揮免疫抑制作用[20]。本研究結(jié)果顯示抗人T細(xì)胞兔免疫球蛋白聯(lián)合他克莫司下降IL-12P70、IL-4及IFN-γ水平，從而減輕患者的腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)，提高治療有效率。

綜上所述，抗人T細(xì)胞兔免疫球蛋白聯(lián)合他克莫司降低患者HLA-I、HLA-II、IgG、IL-12P70、IL-4及IFN-γ的水平，有效減輕患者的腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)，改善患者的疼痛發(fā)熱及移植體腫大等狀況，提高有效率，加快康復(fù)進(jìn)程，值得在臨床推廣應(yīng)用。

利益相關(guān)聲明：作者均聲明無利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：鄭文：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫；洪暉娟：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；陳赟、黃春美：實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改；蔡娟娟：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。