程鳴威, 朱培君, 楊爍, 陳家豪, 羅柯, 劉倩, 徐淑蘭

南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院種植中心(廣東廣州 510280)

在口腔種植領(lǐng)域，引導(dǎo)骨再生是常用的骨增量手術(shù)之一，其中屏障膜與細(xì)胞的相互作用非常重要，理想的膜材料不只是被動的給細(xì)胞提供生長環(huán)境，更應(yīng)該積極的促進(jìn)細(xì)胞間信號傳遞，使細(xì)胞更好地行使生物功能[1-2]。人體組織與生物電有著密切關(guān)系，天然骨和骨膜中存在生理電位(-10～-90 mV)，已有研究表明，成骨細(xì)胞會對電信號產(chǎn)生回應(yīng)[3]，據(jù)此，本課題組前期設(shè)計出電活性P(VDF-TrFE)生物膜，通過極化處理，使得該電活性多聚物表面帶有電荷，將電信號直接傳遞給細(xì)胞，從而影響細(xì)胞黏附，增殖與分化。牛蒡子苷元(Arctigenin, ARG)是從中醫(yī)藥牛蒡子中提取的木質(zhì)素類化合物[4]。多項研究表明其具有抗炎，抗氧化，抗腫瘤以及促進(jìn)成骨的作用[5-7]，已有研究證實牛蒡子苷元抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成和羥基磷灰石再吸收[8]。而對于骨質(zhì)疏松患者，牛蒡子苷元能夠通過PI3K/Akt/PPARγ通路調(diào)節(jié)骨再生[9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)電活性P(VDF-TrFE)產(chǎn)生的微電環(huán)境能夠有效促進(jìn)骨再生，2021年5月至2022年5月在本研究中，將進(jìn)一步探索牛蒡子苷復(fù)合電活性P(VDF-TrFE)薄膜對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(ATCC)；P(VDF-TrFE)粉末(法國阿克瑪公司)；N，N-二甲基甲酰胺(上海阿拉丁試劑有限公司)；DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco，美國)；DMSO(北京索萊寶)；MTT試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；ALP試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；BCA蛋白測定試劑盒 (上海貝博生物科技有限公司)；茜素紅染液(上海賽業(yè)生物)；氯化十六烷基吡啶(上海遠(yuǎn)慕生物); 掃描電子顯微鏡觀察表面形貌(JSM6300，JEOL，Peabody，MA，USA);電熱鼓風(fēng)箱(GZ-140 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司)。

1.2 牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復(fù)合膜制備 按照前期研究實驗方法制備P(VDF-TrFE)膜[10]，在高溫下對P(VDF-TrFE)膜進(jìn)行油隅極化處理，電壓設(shè)置為6 kV/cm，加壓速率為100 V/min，120℃高溫極化1 h。將牛蒡子苷元粉末溶解于DMSO中，使用無水乙醇配置成4個工作濃度(2.5、5、10、20 μmol/L)，調(diào)整溶液pH為7.4。分為5組，對照組浸泡于無水乙醇，其余4組浸漬于不同濃度的牛蒡子苷元溶液中作為處理組，設(shè)置溫度為37℃，使得牛蒡子苷元吸附在P(VDF-TrFE)膜表面，經(jīng)過48 h后取出P(VDF-TrFE)膜，在空氣下自然干燥，所有樣品均經(jīng)過紫外消毒后備用。

1.3 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)購自賽業(yè)生物公司，BMSCs培養(yǎng)于T25培養(yǎng)瓶中，加入5 mL完全培養(yǎng)基，完全培養(yǎng)基為含10% 胎牛血清和1% 雙抗(青霉素/鏈霉素)的F12/DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞融合至70%～80% 時用0.25% 胰蛋白酶消化傳代。使用第3～4代BMSCs，將細(xì)胞按照密度為2×104個/孔分別種植在不同組別的牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復(fù)合膜上。

1.4 牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復(fù)合膜表面形貌和電學(xué)性能分析

1.4.1 掃描電鏡分析表面形貌 將牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復(fù)合膜裁剪成0.5 cm×0.5 cm大小，通過導(dǎo)電膠粘接在樣品臺上，進(jìn)行噴金(鉑)提高材料的導(dǎo)電性，使用掃描電子顯微鏡觀察表面形貌。

1.4.2 牛蒡子苷元釋放行為測定 取一定質(zhì)量的牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復(fù)合膜置于鼓風(fēng)烘箱中做釋放處理，溫度設(shè)置為室溫。按照設(shè)定的時間間隔，使用萬分之一天平來稱量纖維膜的質(zhì)量，記下復(fù)合膜質(zhì)量的變化，結(jié)果以失重質(zhì)量百分比表示。

1.4.3 電學(xué)性能表征 使用壓電測量儀(ZJ-3AN, IACAS, Beijing, China)測量牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復(fù)合膜的壓電系數(shù)(d33)。為了檢測電學(xué)穩(wěn)定性，將牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復(fù)合膜放置在DMEM/F12培養(yǎng)基中浸泡，在第30天時檢測d33。

1.5 細(xì)胞增殖實驗 細(xì)胞增殖實驗按照CCK8說明書進(jìn)行操作，BMSCs按照上述說明進(jìn)行培養(yǎng)，在24、48、72 h時用滅菌PBS沖洗3次，加入含有10% CCK8工作液的完全培養(yǎng)基，在 37℃下孵育 30 min。酶標(biāo)儀記錄450 nm波長下各孔的吸光度，實驗重復(fù)3次。

1.6 堿性磷酸酶實驗 BMSCs按照上述說明進(jìn)行培養(yǎng)，在3 d時，用滅菌PBS洗滌3次。在堿性磷酸酶染色實驗中，使用4% 多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，然后用堿性磷酸酶染色溶液(Beyotime Biotechnology Inc.)染色30 min。在堿性磷酸酶活性測定實驗中，使用BCA試劑盒檢測蛋白總量，用適量不含磷酸酶抑制劑的 RIPA 細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞，制備待測液。根據(jù)ALP試劑盒說明配置ALP活性測定工作液，并將工作液與待測液混合，用酶標(biāo)儀測定其在405 nm的吸光度，計算酶活力，結(jié)果以U/L表示。

1.7 茜素紅實驗 BMSCs按照上述說明進(jìn)行培養(yǎng)，在14 d時，用滅菌PBS洗滌3次。在茜素紅染色實驗中，使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，然后用茜素紅染液(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)染色10 min，在顯微鏡下觀察拍照觀察。向孔板內(nèi)加入2 mL 10% 十六烷基吡啶溶液，置于搖床上輕搖1 h，待染色物完全溶解后，取適量溶解液于 562 nm 的波長下測定其吸光度用于茜素紅染色定量分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 所有實驗數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計方法采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，SNK法進(jìn)行兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復(fù)合膜物理特征 所有樣本在浸泡牛蒡子苷元溶液后均無出現(xiàn)樣本損傷，從圖1可以看出，SEM結(jié)果顯示樣本表面形貌無明顯改變。將浸泡了牛蒡子苷元的P(VDF-TrFE)膜在室溫下對牛蒡子苷元釋放進(jìn)行測定， 從表1可以看出，不同濃度的4個組在10 h前均有藥物突釋行為，在96 h基本釋放完全，累積釋放率達(dá)到90%以上。對牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復(fù)合膜壓電常數(shù)的分析表明，浸泡牛蒡子苷元后，材料表面的仍具有良好電學(xué)性能，為了測試復(fù)合膜的壓電穩(wěn)定性，將其浸入DMEM/F12培養(yǎng)基中30 d，30 d結(jié)束時，浸沒樣品的壓電系數(shù)d33接近原始d33，見表2。說明牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復(fù)合膜在體外能夠穩(wěn)定的構(gòu)建微電環(huán)境。

表1 牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復(fù)合膜釋放率 %

表2 牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復(fù)合膜的壓電系數(shù)d33

注：A:對照組；B:2.5 μmol/L組

2.2 牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復(fù)合膜的細(xì)胞相容性 實驗在不同濃度水平檢測了牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復(fù)合膜對BMSCs增殖的影響，CCK8結(jié)果顯示(圖2)牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復(fù)合膜呈現(xiàn)出濃度依賴的細(xì)胞增殖抑制，與對照組相比，在濃度為20 μmol/L時呈現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性。

注：*與2.5 μmol/L組比較 P<0.05；#與5 μmol/L組比較 P<0.05；△與10 μmol/L組比較 P<0.05

2.3 牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復(fù)合膜促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的效能 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的效能通過ALP和茜素紅染色實驗表征。堿性磷酸酶染色實驗結(jié)果顯示(圖3)，在3 d時，5組復(fù)合膜表面均出現(xiàn)深染藍(lán)色物質(zhì)，說明均有堿性磷酸酶形成。堿性磷酸酶定量結(jié)果顯示(圖4)，牛蒡子苷元處理組的早期成骨分化效能均優(yōu)于對照組，在濃度為10 μmol/L時擁有最佳的早期成骨效能。

注：A:對照組；B：2.5 μmol/L組；C：5 μmol/L組；D：10 μmol/L組；E：20 μmol/L組

注：*與對照組比較 P<0.05；#與2.5 μmol/L組比較 P<0.05；△與5 μmol/L組比較 P<0.05；▲與10 μmol/L組比較 P<0.05

茜素紅染色結(jié)果顯示(圖5)，在14 d時，5組復(fù)合膜表面均出現(xiàn)紅褐色礦化結(jié)節(jié)，說明有鈣磷物質(zhì)沉積到細(xì)胞外基質(zhì)中，但茜素紅定量結(jié)果顯示(圖6)，相比對照組，處理組不會促進(jìn)BMSCs礦化結(jié)節(jié)生成。從細(xì)胞增殖實驗和成骨分化實驗結(jié)果來看，牛蒡子苷元濃度為10 μmol/L時，牛蒡子苷元P(VDF-TrFE)復(fù)合膜用有最佳的成骨效能。

注：A：對照組；B：2.5 μmol/L組；C：5 μmol/L組；D：10 μmol/L組；E：20 μmol/L組

圖6 茜素紅定量檢測

3 討論

骨改建是一個高度受控的過程，成骨細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)骨形成，破骨細(xì)胞降解細(xì)胞外基質(zhì)引起骨吸收。BMSCs定向遷移到損傷部位，分化為成骨細(xì)胞以及分泌生長因子，促進(jìn)受損骨組織的再生[11]。中醫(yī)藥作為促進(jìn)成骨分化的新思路近年來獲得廣泛關(guān)注，研究表明蛤蚧、補骨脂、淫羊藿、鹿茸等單味藥能夠有效促進(jìn)成骨，治療骨質(zhì)疏松，改善骨密度[12-15]。牛蒡子苷元提取自天然中藥牛蒡子，初期被用于抗炎、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)，最近有研究表明牛蒡子苷元能夠抑制破骨細(xì)胞分化從而治療骨質(zhì)疏松[8, 16]，但是對牛蒡子苷元促進(jìn)成骨細(xì)胞或BMSCs成骨分化的研究尚且較少。P(VDF-TrFE)因其具有良好的生物相容性，而被譽為適合生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的仿生電活性材料，相關(guān)研究表明P(VDF-TrFE)膜極化后表面帶有電荷，能仿生生物體內(nèi)的微電環(huán)境，從而提高成骨細(xì)胞的生物學(xué)活性[17]。此薄膜的設(shè)計規(guī)避了外源性電信號裝置易誘發(fā)感染的風(fēng)險，提高了仿生電活性材料的生物效應(yīng)及生物安全性，本課題組前期研究表明極化P(VDF-TrFE)通過免疫調(diào)節(jié)促進(jìn)BMSCs成骨分化[10]。因此，本研究進(jìn)一步將牛蒡子苷元負(fù)載在極化P(VDF-TrFE)薄膜上，研究其促成骨效能。

本研究采用浸泡的方式進(jìn)行藥物負(fù)載，極化P(VDF-TrFE)膜浸泡了不同濃度牛蒡子苷元后仍然具有穩(wěn)定的電學(xué)能力以及均勻的表面形貌，牛蒡子苷元釋放行為檢測結(jié)果顯示不同濃度的4個組在10 h前均有突釋行為，釋放量達(dá)到60%以上，而在96 h基本釋放完全，累積釋放率達(dá)到90%以上。浸泡是較為常用的一種方式，但是存在釋放時間過短，前期突釋效應(yīng)顯著等問題。藥物控制釋放能夠在生物體內(nèi)以可預(yù)測的方式完成較長時間的藥物釋放，目前包括納米控釋系統(tǒng)，水凝膠藥物釋放體系、微球控釋體系以及電仿纖維控釋體系[18]。有研究表明，靜電紡絲可以制備壓電材料并且具有生物活性[19]，因此在載中藥電活性生物材料中，靜電紡絲是一種具有前景的制備工藝。

在本實驗中，牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復(fù)合膜呈現(xiàn)出濃度依賴的細(xì)胞增殖抑制，在濃度為20 μmol/L時呈現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性。Li等[9]的研究發(fā)現(xiàn)牛蒡子苷元濃度為10 μmol/L以下時不具有細(xì)胞毒性，這與本實驗的研究結(jié)果一致。牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復(fù)合膜在早期促進(jìn)了ALP表達(dá)。實驗結(jié)果顯示牛蒡子苷元處理組的早期成骨分化效能均優(yōu)于對照組，同樣呈現(xiàn)出濃度依賴性，高濃度組(20 μmol/L)的堿性磷酸酶活性不如10 μmol/L組，這可能與細(xì)胞毒性有關(guān)。而對照組的促成骨效能則可能來自于極化P(VDF-TrFE)薄膜為BMSCs提供的微電環(huán)境。生物礦化從無定型的鈣磷沉積開始，無定型鈣磷沉積到膠原纖維形成的框架中，隨后礦物質(zhì)成核、生長，形成鈣結(jié)節(jié)，茜素紅通過與鈣結(jié)節(jié)中的鈣離子反應(yīng)形成紅褐色化合物，能夠反映細(xì)胞晚期成骨分化能力。實驗結(jié)果顯示對照組和處理組均有少量礦化結(jié)節(jié)形成，但是其差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)合牛蒡子苷元釋放實驗，本課題組推測由于藥物釋放時間過短從而影響了牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復(fù)合膜的晚期促成骨分化能力。

綜上所述，本研究在細(xì)胞水平探討了不同濃度牛蒡子苷元復(fù)合P(VDF-TrFE)生物膜促進(jìn)BMSCs成骨分化的能力，結(jié)果顯示極化P(VDF-TrFE)所創(chuàng)改造的微電環(huán)境能夠為細(xì)胞成骨分化提供良好的環(huán)境，同時牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復(fù)合膜能更進(jìn)一步促進(jìn)早期成骨，且在一定濃度范圍內(nèi)其成骨作用于藥物濃度呈正相關(guān)，而高濃度牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復(fù)合膜則會產(chǎn)生細(xì)胞毒性，減弱其促成骨效能。目前的載藥方式尚不足以達(dá)到藥物控釋的效果，牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復(fù)合膜只能在成骨早期釋釋放藥物，如何能夠提高牛蒡子苷元溶解度和生物利用度，使藥物持續(xù)作用于成骨分化的整個過程，仍需要進(jìn)一步研究。

利益相關(guān)聲明：所有作者聲明不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：徐淑蘭進(jìn)行了實驗設(shè)計，朱培君和楊爍構(gòu)建了牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復(fù)合膜并進(jìn)行了材料分析。羅軻和劉倩進(jìn)行了細(xì)胞實驗，程鳴威統(tǒng)計數(shù)據(jù)并撰寫論文。