王先柱 李長恩 張現(xiàn)歌 翟志毫 王譯澤 王 穎

新疆大學(xué) 紡織與服裝學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830017

醫(yī)用敷料是一種用于處理皮膚傷口的醫(yī)療用品。理想的醫(yī)用敷料應(yīng)具備保護(hù)傷口不受病原體侵襲，能吸收和控制滲出物的功能，并可通過保持傷口處的濕潤微環(huán)境，促進(jìn)傷口愈合[1]。納米纖維材料具有直徑小、比表面積大、孔隙率高以及力學(xué)性能良好等優(yōu)點(diǎn)[2]。此外，納米纖維的三維結(jié)構(gòu)與人體的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)相似，用納米纖維制備的傷口敷料具有止血、預(yù)防病原體入侵、促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移等功能[3]?；诖?，納米纖維已成為傷口敷料制備領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。靜電紡絲技術(shù)因易操作、成本低等優(yōu)勢，成為制備納米纖維的主要方式之一。通過向靜電紡納米纖維中添加化學(xué)藥物或活性物質(zhì)，還可增加納米纖維敷料的功能[4]。

微生物感染是造成傷口延遲愈合的主要原因。目前利用靜電紡絲技術(shù)制備納米纖維敷料時，添加的物質(zhì)多為抗生素類藥物[5]。這些化學(xué)藥物雖能夠有效抑制有害微生物的生長，加速傷口愈合，但長期使用抗生素類藥物不僅會導(dǎo)致有害微生物產(chǎn)生耐藥性，而且制備的靜電紡納米纖維敷料也功能單一?；诖?，純天然、多功能的植物提取物成為制備靜電紡絲納米纖維敷料的研究熱點(diǎn)。

石榴樹是一種石榴科石榴屬的落葉型喬木，其果實具有食用與藥用價值。新疆作為我國石榴的主要產(chǎn)區(qū)之一，年產(chǎn)石榴高達(dá)5萬～6萬t。石榴皮作為石榴果實中不能食用的一部分而被廢棄，造成了大量的資源浪費(fèi)[6]。研究表明，石榴皮提取物(pomegranate peel extract，PPE)中富含安石榴苷、鞣花酸等多種活性成分，具有抗菌、抗氧化、驅(qū)蟲、止血和澀腸等作用，是臨床上常用的中藥之一[7-8]。Aslam等[9]研究發(fā)現(xiàn)，石榴皮中的脂溶性成分對人體皮膚中成纖維細(xì)胞的生長有促進(jìn)作用。謝貞建等[10]研究發(fā)現(xiàn)，PPE可增強(qiáng)大豆油的抗氧化效果。Murthy等[11]研究發(fā)現(xiàn)，PPE對大鼠切除性傷口的愈合有促進(jìn)作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，石榴皮的主要活性成分是多酚類化合物，該類化合物具有明顯的抗氧化、抗菌、抗癌和促進(jìn)傷口愈合等作用[12]。然而，目前還未有利用PPE制備靜電紡納米纖維敷料的報道。

本文利用靜電紡絲技術(shù)，制備含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PPE的聚己內(nèi)酯(PCL)/PPE復(fù)合納米纖維膜，并對納米纖維膜的微觀形貌、抗菌性和抗氧化性等性能進(jìn)行測試與表征，探討PCL/PPE復(fù)合納米纖維膜在傷口敷料領(lǐng)域的潛在應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑

石榴皮，收集于新疆烏魯木齊地區(qū)；PCL、N-N-二甲基甲酰胺(N-N-Dimethylformamide，DMF)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和無水乙醇，購自烏魯木齊科華偉業(yè)生物科技有限公司；氫氧化鈉、氯化鈉、牛肉膏、蛋白胨和瓊脂，購自上海阿拉丁試劑有限公司；大腸埃希菌(E.coli，ATCC 25922)和金黃色葡萄球菌(S.aureus，ATCC 25923)，購自中國南通凱恒生物技術(shù)有限公司；白色念珠菌(C.albicans，BNCC 186382)，購自北納生物科技有限公司。

1.2 PPE的制備

將收集到的石榴皮用去離子水洗滌2次，去除雜質(zhì)，置于陰涼處晾干后粉碎，其粉末過粒徑為425 μm(40目)篩網(wǎng)。稱取過篩后的石榴皮粉100 g，加入600 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇，在60 ℃恒溫水浴中加熱回流提取4 h，共提取3次。過濾提取液后，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-5205A型，上海亞榮生化儀器廠)將提取液濃縮至浸膏狀，收集PPE浸膏并儲存于4 ℃環(huán)境下備用。

1.3 納米纖維膜的制備

以DMF為溶劑，制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的PCL溶液。向PCL溶液中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%、6%和9%的PPE，得到不同PPE質(zhì)量濃度(分別為30、60和90 mg/mL)的紡絲液，攪拌14 h，通過靜電紡絲技術(shù)制備納米纖維膜，分別命名為PCL/3PPE、PCL/6PPE和PCL/9PPE，并以PCL納米纖維膜作為空白對照。靜電紡絲工藝參數(shù)如下：針頭與收集器之間的電壓為21 kV，接收距離為18 cm，紡絲液流速為0.5 mL/h，針頭規(guī)格為23 G。

1.4 場發(fā)射掃描電子顯微鏡測試

將納米纖維膜裁剪成0.3 cm×0.3 cm大小并鍍金處理后，在10 kV加速電壓條件下，采用SU8010型場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM，日本Hitachi公司)觀察納米纖維的微觀形貌。從SEM圖中隨機(jī)選取100根納米纖維，利用Imagplus軟件測量纖維直徑，統(tǒng)計纖維的直徑分布情況。

1.5 傅里葉紅外光譜測試

采用VERTEX 70型傅里葉變換紅外光譜分析儀(德國Bruker公司)對納米纖維膜進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜分析(FTIR)，掃描范圍為4 500～250 cm-1。

1.6 水接觸角測試

將納米纖維膜試樣裁剪成3.0 cm×3.0 cm大小，將5 μL去離子水滴在納米纖維膜表面，采用DCAT 21型水接觸角分析儀(德國 Dataphysics公司)觀察并記錄相同時間間隔下不同納米纖維膜接觸角的變化情況。

1.7 力學(xué)性能測試

在室溫下，采用YG(B) 026P型電子單纖維強(qiáng)力儀(溫州大榮紡織儀器有限公司)對納米纖維膜的力學(xué)性能進(jìn)行測試。將納米纖維膜裁剪成3.0 cm×0.5 cm的長方形帶狀，以10 mm/min的拉伸速率將纖維膜拉伸至斷裂并記錄數(shù)據(jù)。納米纖維膜的拉伸強(qiáng)度按式(1)計算。

(1)

式中：T——試樣的拉伸強(qiáng)度，MPa；

F——試樣拉伸過程中的最大載荷，N；

S——試樣橫截面面積，mm2。

1.8 抗氧化性能測試

采用DPPH自由基清除法對復(fù)合納米纖維膜的抗氧化性能進(jìn)行測試。清除率越高，抗氧化性能越好。制備0.2 mg/mL的DPPH乙醇溶液，避光保存?zhèn)溆谩７Q取適量的PPE，制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%、6%和9%的PPE乙醇溶液。分別稱取25 mg PCL、 PCL/3PPE、PCL/6PPE和PCL/9PPE納米纖維膜，切成小塊浸泡于3 mL無水乙醇中，制備納米纖維膜樣品溶液。分別取2 mL纖維膜樣品溶液與2 mL的DPPH溶液混合后，用紫外分光光度計于517 nm處檢測吸光度(OD值)。DPPH自由基清除率(k)按式(2)計算。

(2)

式中：A0——無水乙醇與DPPH的OD值，作為空白組；

Ax，0——待測液與無水乙醇的OD值；

Ax——待測液與DPPH的OD值。

1.9 體外抗菌活性

利用圓盤擴(kuò)散法檢測PPE納米纖維膜對金黃色葡萄球菌(S.aureus)、大腸埃希(E.coli)及白色念珠菌(C.albicans)的體外抗菌活性。將納米纖維膜裁剪成1.0 cm ×1.0 cm大小的正方形，紫外滅菌后，將其分別放置于涂覆有S.aureus、E.coli及C.albicans的平皿中，于培養(yǎng)箱中(S.aureus、E.coli的培養(yǎng)溫度為37 ℃，C.albicans的培養(yǎng)溫度為28 ℃)培養(yǎng)24 h后，觀察并記錄抑菌圈直徑。重復(fù)試驗3次，結(jié)果取平均值。

1.10 統(tǒng)計分析

采用GraphPad Prisim 5.0軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行分析處理，利用單因素方差法對抗菌結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。當(dāng)P<0.05 時，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 場發(fā)射掃描電鏡分析

不同PCL/PPE復(fù)合納米纖維膜的SEM圖及纖維直徑分布如圖1所示。SEM圖顯示，PCL/3PPE、PCL/6PPE和PCL/9PPE復(fù)合納米纖維膜均呈三維網(wǎng)格結(jié)構(gòu)交錯排列，纖維表面光滑連續(xù)，無明顯串珠形成，與空白對照組(PCL納米纖維膜)形態(tài)相似。PCL納米纖維膜的纖維平均直徑為(96.88±12.02)nm。復(fù)合納米纖維膜的纖維直徑隨著PPE質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而逐漸增大，當(dāng)PPE的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9%時，PCL/9PPE復(fù)合納米纖維膜的纖維平均直徑最大，為(415.62±16.50)nm。原因可能是隨著復(fù)合納米纖維膜中PPE質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，紡絲液的黏度不斷增大，電導(dǎo)率降低，導(dǎo)致紡絲過程中紡絲液不易于分散，進(jìn)而造成PCL/PPE復(fù)合納米纖維直徑增大[13-14]。

圖1 納米纖維膜的SEM圖及纖維直徑分布圖

2.2 傅里葉變換紅外光譜分析

為證實PPE已負(fù)載至復(fù)合納米纖維膜中，對纖維膜進(jìn)行FTIR分析。PPE和不同納米纖維膜的傅里葉變換紅外光譜圖如圖2所示。圖2中，3 352 cm-1處為PPE中多酚類物質(zhì)—OH的特征吸收峰,1 733 cm-1處為PCL中羰基的特征吸收峰，2 954 cm-1是—CH2的非對稱伸縮振動峰，2 874 cm-1處是—CH2的對稱伸縮振動峰，1 067 cm-1處為C—O的伸縮振動峰，1 260 cm-1處為C—O—C 的非對稱伸縮振動峰。PCL/3PPE、PCL/6PPE和PCL/9PPE納米纖維膜的FITR光譜圖上均出現(xiàn)了PCL的特征峰。與PCL納米纖維膜的特征峰相比，PCL/PPE復(fù)合納米纖維膜在3 352 cm-1處出現(xiàn)了新的特征峰，這可能是PPE中多酚類物質(zhì)—OH的振動引起的，且該峰值隨著復(fù)合納米纖維膜中PPE質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而逐漸增大。此外，復(fù)合納米纖維中的PCL特征峰出現(xiàn)了略微偏移的情況，這可能是由于PPE中的酚羥基與PCL中的羰基間形成了氫鍵，使羰基電子云密度平均化，從而導(dǎo)致伸縮振動頻率降低。

2.3 水接觸角測試

理想的傷口敷料應(yīng)具有良好的吸水性[15]。因此，對納米纖維膜的親水性進(jìn)行了測試。不同納米纖維膜的水接觸角測試結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，隨著PPE質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，納米纖維膜表面的水接觸角逐漸減小，接觸10 s時，PCL、PCL/3PPE、PCL/6PPE與PCL/9PPE 納米纖維膜的水接觸角分別為134.00°±0.60°、12.95°±0.93°、10.93°±9.28°和10.00°±0.20°。當(dāng)納米纖維膜的水接觸角小于90°時，可認(rèn)為該材料為親水性材料[16]，并且水接觸角越小，親水性越好。據(jù)此結(jié)合圖3可知，復(fù)合納米纖維膜中PPE質(zhì)量分?jǐn)?shù)與納米纖維膜的親水性成正相關(guān)。這可能是因為PPE中富含酚羥基等極性基團(tuán)，其親水性遠(yuǎn)高于PCL等合成高分子材料[17]。PPE與紡絲基質(zhì)結(jié)合后，提高了復(fù)合納米纖維膜的親水性。

A——PPE；B——PCL；C——PCL/3PPE;D——PCL/6PPE；E——PCL/9PPE。圖2 PPE與納米纖維膜的紅外光譜圖

圖3 納米纖維膜在與水接觸1、5和10 s時的接觸角

2.4 力學(xué)性能測試

理想的傷口敷料應(yīng)具備與人體皮膚相匹配的力學(xué)性能，以防傷口皮膚受拉伸引起二次損傷。4種納米纖維膜的力學(xué)性能測試結(jié)果見表1。由表1可以看出，添加PPE后所得納米纖維膜的力學(xué)性能提高。PCL納米纖維膜的拉伸斷裂強(qiáng)力和斷裂伸長率分別為(1.11±0.02)MPa和(23.25±0.70)%。隨著復(fù)合納米纖維膜中PPE的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由3% 增加至9%，復(fù)合納米纖維膜的拉伸強(qiáng)力逐漸增大，由PCL/3PPE的(4.06±0.03)MPa增加至PCL/9PPE的(10.17±0.12)MPa。原因可能是PPE中多酚類化合物的酚羥基與PCL的羰基氧原子結(jié)合形成了氫鍵[18]。此外，PCL/9PPE復(fù)合納米纖維膜的彈性模量高達(dá)(51.90±5.38)MPa，而人體皮膚的彈性模量為5～150 MPa[19]。復(fù)合納米纖維膜的彈性模量在人體皮膚的彈性模量范圍內(nèi)，具有與人體皮膚相似的彈性模量。

表1 納米纖維膜的力學(xué)性能測試結(jié)果

2.5 抗氧化性能測試

傷口愈合的炎癥階段會產(chǎn)生大量的氧化自由基，通過消除或減少自由基的數(shù)量可提高巨噬細(xì)胞對死細(xì)胞的清除能力，縮短傷口愈合的時間[20]。不同材料對DPPH自由基的清除率測試結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，PPE溶液對DPPH自由基表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除能力，當(dāng)溶液中PPE的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9%時，PPE對自由基的清除率高達(dá)(83.00±0.85)%，明顯高于相應(yīng)PPE質(zhì)量分?jǐn)?shù)的復(fù)合納米纖維膜(PCL/9PPE)和PCL納米纖維膜對照組。原因可能是紡絲過程中有部分PPE損失，導(dǎo)致PCL/PPE復(fù)合納米纖維膜的抗氧化性降低。與對照組PCL納米纖維膜的DPPH自由基清除率(11.77±0.92)%相比，隨著PPE質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，PCL/PPE復(fù)合納米纖維膜對DPPH自由基的清除效果顯著增強(qiáng)，PCL/9PPE納米纖維膜對DPPH自由基的清除率高達(dá)(71.47±0.28)%。原因可能是復(fù)合納米纖維膜中釋放的PPE與DPPH自由基發(fā)生了氧化還原反應(yīng)[21]。

*** 表示P<0.01。圖4 DPPH自由基清除率

2.6 體外抗菌活性

理想的傷口敷料除了具備減輕傷口處的炎癥反應(yīng)，吸收傷口滲出液的功能外，還應(yīng)具有一定的抗菌性[22]。S.aureus、E.coli與C.albicans是導(dǎo)致傷口感染的常見病原體[23-24]。4種納米纖維膜的抗菌性能測試結(jié)果如圖5和表2所示。由表2可以看出，對照組PCL 納米纖維膜無明顯的抑菌效果。與對照組相比，隨著PCL/PPE復(fù)合納米纖維膜中PPE質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，對S.aureus、E.coli與C.albicans的抗菌效果顯著增強(qiáng)，PCL/9PPE與PCL/6PPE復(fù)合納米纖維膜對S.aureus的抗菌效果無顯著性差異，PCL/9PPE復(fù)合納米纖維膜對S.aureus、E.coli與C.albicans的抑菌圈直徑分別高達(dá)(29.47±1.29)、(19.83±0.46)和(16.39±1.40)mm，明顯高于對照組PCL納米纖維膜和PCL/3PPE試驗組。此外，PCL/PPE復(fù)合納米纖維膜對S.aureus和E.coli的抗菌效果均優(yōu)于C.albicans，原因可能是C.albicans的細(xì)胞壁上含有油脂類成分，不利于對親水性PPE的吸收[25]。PCL/PPE復(fù)合納米纖維膜對E.coli的抗菌效果不及對S.aureus的抗菌效果，原因可能是E.coli為革蘭氏陰性菌，其細(xì)胞壁中的肽聚糖、磷脂層和脂多糖層等復(fù)雜結(jié)構(gòu)，能夠阻止部分PPE進(jìn)入其細(xì)胞內(nèi)部[26]，減少了PPE對細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞。體外抗菌活性測試結(jié)果表明，PPE已成功復(fù)合至PCL纖維基質(zhì)中，使復(fù)合納米纖維膜具備抗菌性能。

*** 表示P< 0.01；** 表示 P<0.05；ns表示P>0.05。圖5 納米纖維膜的體外抗菌效果

表2 納米纖維膜的抑菌效果對比

3 結(jié)論

本文向PCL溶液中加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PPE，再通過靜電紡絲技術(shù)成功制備PCL/PPE復(fù)合納米纖維膜和純PCL納米纖維膜，并對纖維膜的物理和化學(xué)性能進(jìn)行測試與對比分析。研究結(jié)果表明，PCL/PPE復(fù)合納米纖維膜表現(xiàn)出良好的力學(xué)性能、親水性和抗氧化性等性能。此外，PCL/PPE復(fù)合納米纖維膜對S.aureus、E.coli和C.albicans具有明顯的抗菌效果。這種PCL/PPE復(fù)合納米纖維在傷口敷料領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。