孔蕾，杜鵬宇，冉啟玉，孫冰

（濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)寧 272013 ）

0 引言

國際糖尿病聯(lián)合會（IDF）估計[1]，2021年全球成年人群的糖尿?。╠iabetes mellitus,DM）患病人數(shù)約5.366億人，到 2045年將上升至7.832 億，在收入群體中，中等收入國家的患病率最高，其中包括中國。DM的并發(fā)癥也隨之增加。糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy, DR）是2型糖尿病（type 2 diabetes, T2DM）常見慢性并發(fā)癥，也是成人可預(yù)防失明的主要原因。該病程初期無明顯臨床癥狀，隨著病程的進(jìn)展，逐漸出現(xiàn)視物模糊，嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致失明。所以對于預(yù)防DR導(dǎo)致的視力喪失最重要的就是早期發(fā)現(xiàn)和治療。DR分級的金標(biāo)準(zhǔn)是彩色眼底照片[2]，這需要專業(yè)的眼科醫(yī)生和儀器設(shè)備，所以需要一種更直觀、方便的指標(biāo)可早期發(fā)現(xiàn)DR的方法以便早期干預(yù)，延緩病程的進(jìn)展和改善預(yù)后。CysC作為半胱氨酸蛋白酶的細(xì)胞外抑制劑，通過與目標(biāo)酶的活性位點(diǎn)互補(bǔ)以發(fā)揮抑制作用，并參與機(jī)體各種生理與病理過程。有研究發(fā)現(xiàn)[3]，CysC參與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，血管壁重塑與新生血管生成及神經(jīng)變性等病理過程，及與視網(wǎng)膜血管分形維數(shù)及直徑、基因多態(tài)性密切相關(guān)。CysC的生物特性及作用使其成為DR研究中的熱點(diǎn)，探討及闡明CysC參與DR發(fā)展的分子機(jī)制可以為開發(fā)新的治療方法以預(yù)防眼部并發(fā)癥提供了基礎(chǔ)。目前大量研究表明CysC在DR的發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用，本文就目前CysC與DR的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行如下綜述。

1 胱抑素C的生物特征

半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(Cystatin C,CysC)又稱為胱抑素C，屬于半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族Ⅱ家族成員，是半胱氨酸蛋白酶的有效抑制劑[4]，有研究[5]對雞胱抑素應(yīng)用X射線散射技術(shù)形成的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，雞CysC的分子中心在5個反平行的β折疊片層結(jié)構(gòu)附近有一個長的α螺旋，在β貼片的末端露出第一β發(fā)夾環(huán)，N端區(qū)域和第二發(fā)夾環(huán)位于兩側(cè)。這三個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成楔形結(jié)構(gòu)，該楔形結(jié)構(gòu)與目標(biāo)酶的活性位點(diǎn)互補(bǔ)以發(fā)揮抑制作用。CysC的CST3編碼基因?qū)儆诠芗一?，由所有有核?xì)胞以恒定速率產(chǎn)生，且有明顯非組織特異性表達(dá)，在人的很多組織中均有表達(dá)[6]；CysC是一條單一非糖基化多肽鏈由120個氨基酸殘基組成的，分子量為13,343-13,359 Da[7]。CysC可以由腎小球自由的過濾，然后在近端腎小管處吸收并完全分解代謝。胱抑素C不受性別、年齡、身高、炎癥、肌肉質(zhì)量、惡性腫瘤的影響，其產(chǎn)生速率通常是恒定的，CysC的穩(wěn)定性很好[8]，所以CysC被作為早期腎損傷的標(biāo)志物。近年來有研究發(fā)現(xiàn)[9]，包含肌酐和胱抑素C但省略種族的新腎小球?yàn)V過率方程比單獨(dú)使用肌酐或胱抑素C但省略種族的方程更準(zhǔn)確，使不同種族人群之間的差異更小，所以胱抑素C已被公認(rèn)為慢性腎衰的早期和準(zhǔn)確的生物標(biāo)志物。而糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)和DR同屬于糖尿病微血管病變(diabetic microangiopathy, DMAP)，所以兩者可能存在相同的危險因素，一旦發(fā)現(xiàn)其中一種并發(fā)癥，可能提示另一種并發(fā)癥也已經(jīng)正在發(fā)生、進(jìn)展。

2 CysC與DR的關(guān)系

CysC 可能通過以下機(jī)制參與DR的發(fā)展。

2.1 氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激是由活性氧（reactiveoxygen species, ROS）的產(chǎn)生與生物抗氧化系統(tǒng)之間的不平衡引起的[10]，在人體內(nèi)線粒體、質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和過氧化物酶體均可產(chǎn)生ROS，其中線粒體呼吸是ROS的主要細(xì)胞來源，這種產(chǎn)生通過抗氧化系統(tǒng)清除來平衡，其中包括超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶等[11]。在糖耐量受損和糖尿病等高血糖狀態(tài)下，通常已經(jīng)存在胰島素抵抗和β細(xì)胞功能受損[12]。慢性高血糖通過多種分子途徑誘導(dǎo)胰島內(nèi)的自由基生成，ROS的積累并導(dǎo)致對DNA、蛋白質(zhì)和其他分子的非特異性氧化損傷[11]。氧化應(yīng)激通過多種分子機(jī)制損害細(xì)胞功能。其顯著減少了胰島素的產(chǎn)生，損害了胰島素原囊泡進(jìn)入質(zhì)膜，并減少了葡萄糖進(jìn)入循環(huán)時的胞吐作用。而且還誘導(dǎo)胰腺細(xì)胞的凋亡過程，導(dǎo)致細(xì)胞的功能下降和凋亡[13,14]。氧化應(yīng)激通過脂質(zhì)過氧化、DNA 損傷和線粒體功能障礙，在糖尿病各種并發(fā)癥的病理生理學(xué)中起關(guān)鍵作用[15-17]。同樣的，同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)也可通過一系列反應(yīng)促進(jìn)氧自由基的形成。由于高濃度的CysC可以抑制Hcy的分解，使Hcy濃度升高，促進(jìn)大量氧自由基的形成[18]，從而導(dǎo)致血管平滑肌的增生，血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，促進(jìn)血小板黏附和聚集、進(jìn)一步血栓形成，繼而導(dǎo)致組織缺氧、微血管循環(huán)障礙，從而誘發(fā)DR[19]。

2.2 炎癥反應(yīng)

CysC經(jīng)過一系列反應(yīng)可激活中性粒細(xì)胞[20]，進(jìn)而誘發(fā)血管炎性反應(yīng)，從而加重血管硬化程度。而DR的病理基礎(chǔ)為持續(xù)處于高血糖水平而導(dǎo)致微血管損傷，亦進(jìn)一步表明CysC水平與糖DR密切相關(guān)[21]。還有一些研究表明[5]，CysC可能參與免疫細(xì)胞中酶和其他底物的蛋白水解加工，抗原呈遞，樹突狀細(xì)胞的成熟，蛋白功能的調(diào)節(jié)以及皮膚屏障的形成，參與免疫防御的第一道防線。由此可以看出，CysC與許多炎癥性疾病之間有著密切的關(guān)聯(lián)，所以CysC水平具有診斷價值或被用作許多炎癥性疾病預(yù)后的標(biāo)志物。

2.3 血管壁重構(gòu)與新生血管形成

有動物實(shí)驗(yàn)表明[22]，CysC單克隆抗體可以通過降低CysC水平減輕血管周細(xì)胞的活化、增殖和表型調(diào)節(jié)，減輕外膜成纖維細(xì)胞向內(nèi)膜的遷移，抑制平滑肌細(xì)胞的增殖。表明血清CysC水平可能在兔球囊損傷腹主動脈的血管重塑中起重要作用。在糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)展過程中，CysC可增加視網(wǎng)膜血管的通透性，可促進(jìn)血管壁重構(gòu)，從而導(dǎo)致視網(wǎng)膜新生血管的形成。

2.4 神經(jīng)變性

DR的病理生理改變與黃斑的異常沉淀物、黃斑水腫、視網(wǎng)膜新生血管、炎性反應(yīng)有關(guān)[23-24]。最近的研究表明[25]，DR可能不僅是一種微血管疾病，而且還是神經(jīng)視網(wǎng)膜變性的結(jié)果。神經(jīng)視網(wǎng)膜變性結(jié)構(gòu)上包括無長突細(xì)胞和穆勒細(xì)胞的凋亡、反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)增生、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層/內(nèi)叢狀(ganglion cell layer,GCL)厚度、視網(wǎng)膜厚度和視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層厚度，以及最小邊緣寬度的神經(jīng)視網(wǎng)膜邊緣減小。DR的病理生理改變與視神經(jīng)病變及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的過表達(dá)有關(guān)[23-24]。視網(wǎng)膜中的小膠質(zhì)細(xì)胞作為炎癥細(xì)胞，除了參與免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，還參與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的發(fā)育和維持。在非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變（nonproliferativediabetic retinopathy,NPDR）中，其增加的血管周圍小膠質(zhì)細(xì)胞沉降到視網(wǎng)膜叢狀層，并表現(xiàn)出輕度肥大。在增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變（proliferative diabetic retinopathy，PDR）中，小膠質(zhì)細(xì)胞聚集在缺血區(qū)域，新血管嚴(yán)重擴(kuò)張。小膠質(zhì)細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞之間的接觸也位于視網(wǎng)膜前膜。這些發(fā)現(xiàn)表明，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞參與DR的所有階段，甚至可能加速DR的進(jìn)展[26]。CysC則通過提高黏附分子的表達(dá)水平，來活化小膠質(zhì)細(xì)胞，通過參與神經(jīng)元退行性變等病理生理過程，參與DR的形成。

3 CysC在DR中的診斷應(yīng)用

DR診斷是依據(jù)初步散瞳和全面的眼科檢查，這需要眼科醫(yī)生或驗(yàn)光師及專業(yè)的儀器設(shè)備[27]。DR造成的視力損害及失明對于個人和社會來說成本都非常大[28]，所以DR的篩查就顯得非常重要。眼底檢查可較為準(zhǔn)確地診斷是否DR，熒光素眼底血管造影可以更好地分期，但因不便捷、對人力和物力的依賴性高,患者仍然希望有更經(jīng)濟(jì)、簡單便捷和可靠的檢測指標(biāo)來早期診斷DR。以下將從CysC在早期診斷、視網(wǎng)膜血管直徑、基因多態(tài)性及中醫(yī)證型等方面與DR的關(guān)系展開討論。

3.1 CysC水平與DR早期發(fā)病密切相關(guān)

國內(nèi)外均有相關(guān)研究。Hye Jeong Kim等人選取了806例DM患者的血糖控制情況，排除腎病患者，受試者按血清CysC水平的四分位數(shù)分為四組，DR (P＜0.001)患者在血清CysC四分位數(shù)中比例增加，調(diào)整混雜因素后，最高血清CysC水平仍然是DR的重要危險因素，由此得出血清CysC可能有助于識別無腎病2型糖尿病患者[29]。鄭德莎[19]等選取了3032例研究對象，Meta分析結(jié)果顯示，與健康對照組比較，單純DM組血清CysC水平升高0.79mg/L；與單純DM組比較，DM并發(fā)NPDR組血清CysC水平升高0.98mg/L；與DM并發(fā)NPDR組比較，DM并發(fā)PDR組血清CysC水平升高1.34mg/L，由此得出CysC水平與DR的嚴(yán)重程度有關(guān)。王前明等收集 144 例 T2DM 患者的臨床資料，根據(jù)眼底拍照結(jié)果分成視網(wǎng)膜病變組和單純糖尿病組，得出CysC與DR呈正相關(guān)，CysC對DR診斷有重要價值，聯(lián)合檢測高密度膽固醇脂蛋白、胱抑素C、糖化血紅蛋白等指標(biāo)，對于DR的早期風(fēng)險評估有重要意義[30]。綜上所述，血清CysC水平與DR呈正相關(guān)，血清CysC水平可作為DR的早期診斷、臨床分期及預(yù)后評價的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。

3.2 CysC水平與視網(wǎng)膜血管直徑密切相關(guān)

有研究[31]納入1689名T2DM患者，對其視網(wǎng)膜血管幾何測量，在調(diào)整多個變量后，得出較小的小動脈分形維數(shù)即分支結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和密度與CysC水平偏高相關(guān)；對視網(wǎng)膜血管直徑測量后，得出較窄的中央和中小動脈直徑及較寬的中央、中部和外周小靜脈直徑與CysC水平偏高相關(guān)，由此可以得出T2DM患者的多種視網(wǎng)膜血管分形維數(shù)和直徑測量與CysC相關(guān)。研究表明[32]，在DM患者中某些內(nèi)皮產(chǎn)生的血管收縮劑會產(chǎn)生增加，如內(nèi)皮素-1，而內(nèi)皮產(chǎn)生的血管擴(kuò)張劑則會產(chǎn)生減少，如一氧化氮，這導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管收縮進(jìn)而導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管密度降低；內(nèi)皮素-1還可能導(dǎo)致入球小動脈和出球小動脈的同等收縮，并減少腎血漿流量和腎小球?yàn)V過率，這可能導(dǎo)致CysC的增加。還有研究表明[33]谷胱甘肽過氧化物酶-3(glutathione peroxidase-3, GPx3)可以通過調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜微循環(huán)血管細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)而起作用，這些可能是較小的視網(wǎng)膜小動脈分形維數(shù)與CysC相關(guān)的機(jī)制。視網(wǎng)膜小靜脈直徑通過炎癥介質(zhì)增加導(dǎo)致腎小球損傷內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致CysC升高[33]。這可能是視網(wǎng)膜小脈直徑增寬和CysC升高的相關(guān)機(jī)制。

3.3 CysC基因多態(tài)性與DR關(guān)系尚存在爭議

在DM病程足夠長的情況下，DR的發(fā)病也存在個體化差異性，這除了環(huán)境、飲食習(xí)慣外，遺傳也在DR發(fā)病中發(fā)揮著重要作用，基因多態(tài)性可能會導(dǎo)致個體化差異。而DR的基因參與多種途徑，包括醛糖還原酶途徑，腎素-血管緊張素系統(tǒng)，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，多元醇途徑，非酶糖基化，內(nèi)皮功能障礙，血管張力維持和細(xì)胞外基質(zhì)重塑。而參與這些途徑的基因則是DR的候選基因，其中包括醛糖還原酶，血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)換酶，血管緊張素Ⅱ1型受體，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1，晚期糖基化終產(chǎn)物，血管緊張素原，血管內(nèi)皮生長因子，誘導(dǎo)型和組成型一氧化氮合酶，內(nèi)皮素亞型及其細(xì)胞受體和轉(zhuǎn)化生長因子β[34]。人類CysC基因編碼區(qū)的 DNA變異已可以通過直接測序檢測到，多態(tài)性，即G/A轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致信號肽倒數(shù)第二個氨基酸的丙氨酸/蘇氨酸變異[35]。有研究表明[36]，CST3基因的單核苷酸多態(tài)性(rs1064039)與血清CysC水平的關(guān)系，則為具有G等位基因的患者血清CysC水平將更高，而具有A等位基因的患者將血清CysC水平將更低。CysC通常以無活性單體或二聚體形式存在，但在分泌前在細(xì)胞中轉(zhuǎn)化為活性單體形式。突變CysC產(chǎn)生的二聚體具有更高的穩(wěn)定性，盡管有少數(shù)二聚體仍可以轉(zhuǎn)化后分泌，但突變的總體影響是CysC分泌活性降低。但仍有研究顯示[37]CysC基因位點(diǎn)在DM患者和正常人中分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義，CysC水平不受基因多態(tài)性的影響。還有研究表明[38]STAT4基因多態(tài)性（rs3821236、rs11893432、rs11889341、rs7574865、rs897200）與中國漢族人群T2DM風(fēng)險存在潛在關(guān)聯(lián)。STAT4rs11893432、rs7574865和 rs897200分別與溶血磷脂酸、胱抑素C和甲狀腺素T4顯著相關(guān)。所以CysC基因多態(tài)性與DR的關(guān)系仍存在爭議，未來需要更多不同種族人群更深入的研究來探討兩者的關(guān)系。

4 小結(jié)與展望

CysC作為半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族的一員，基因表達(dá)無組織特異性，所以在各個組織中均有表達(dá)，其生物學(xué)功能廣泛，不僅參與生理過程，而且還參與血管壁重塑，血管生成，炎癥和神經(jīng)變性等病理過程，這些病理過程與黃斑水腫、視神經(jīng)病變、視網(wǎng)膜新血管形成、炎癥過程和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞過度表達(dá)有關(guān)[42]，CysC參與的病理生理反應(yīng)與DR的發(fā)生過程有著共同通路，同時CysC與DR在早期診斷、視網(wǎng)膜血管直徑、基因多態(tài)性等方面也有密切的關(guān)系，綜上所述，血清CysC是DR的獨(dú)立預(yù)測因子，可以作為DR的早期診斷指標(biāo)。雖然較多研究探討了血清CysC水平與DR的相關(guān)性，但對于血清CysC水平的劑量效應(yīng)與DR關(guān)系的探究較少，其超出生理水平狀態(tài)對DR進(jìn)展的影響更值得進(jìn)一步探究。