潘平安 張宏彬 黃永華 韓 廈 陳 威 李 錚

（1 上海交通大學(xué)制冷與低溫工程研究所 上海 200240；2 上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院泌尿外科中心男科 男性健康評估中心 上海 200080）

生物樣本的低溫凍存是指通過降低溫度的方式抑制細(xì)胞代謝活動，實(shí)現(xiàn)樣品長期保存，并在需要時復(fù)溫解凍樣本，使其恢復(fù)到正常生理狀態(tài)的技術(shù)。低溫凍存技術(shù)的出現(xiàn)，消除了獲取和使用生物樣本之間的時間、空間差距[1-2]，緩解了生物樣本在輔助生殖、干細(xì)胞治療、再生醫(yī)學(xué)等生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的供需矛盾[3]，在推進(jìn)臨床醫(yī)學(xué)、生物科學(xué)等學(xué)科發(fā)展的同時，也創(chuàng)造了可觀的社會價值和經(jīng)濟(jì)價值。以輔助生殖為例，精子、卵母細(xì)胞等人類配子的成功凍存成為不孕不育輔助生殖治療的重要手段，有效緩解了全球范圍內(nèi)因人類不孕率升高所帶來的各類社會問題[4]，其全球市場價值預(yù)計(jì)在2025年超過454億美元[5]。在細(xì)胞低溫凍存過程中，冰晶生長被認(rèn)為是導(dǎo)致細(xì)胞受損甚至死亡的主要影響因素之一[6]。冰晶生長造成的冷凍損傷主要可分為兩類[7-9]：1）胞內(nèi)冰晶損傷，在快速降溫過程中，細(xì)胞外溶液生成的冰晶尖端刺破細(xì)胞膜造成機(jī)械損傷；2）溶質(zhì)損傷，在緩慢降溫過程中，由于細(xì)胞內(nèi)外溶液的凝固溫度不同，細(xì)胞外溶液因水分結(jié)晶濃度增大而產(chǎn)生較大的內(nèi)外滲透壓，使細(xì)胞膜發(fā)生破裂。因此，對細(xì)胞凍存技術(shù)而言，通過研究細(xì)胞內(nèi)外冰晶的生長特性從而降低冷凍損傷尤為重要。

配子凍存操作通常將細(xì)胞置于冷凍保護(hù)劑溶液中，以液滴或冷凍麥管的形式進(jìn)行冷凍保存，因此必然涉及水、冷凍保護(hù)劑及細(xì)胞內(nèi)液的冰晶生長過程。為深入研究冰晶生長機(jī)制，研究者們利用各種類型的生物低溫顯微鏡系統(tǒng)，對不同細(xì)胞的冷凍過程進(jìn)行了可視化實(shí)驗(yàn)研究。K. R. Diller等[10-11]研制了早期的生物低溫顯微鏡系統(tǒng)，以低溫氮?dú)鉃槔湓?，樣品冷卻速率約達(dá)100 ℃/min；K. R. Diller等[12-14]還利用該系統(tǒng)觀察了兔腎皮質(zhì)細(xì)胞、人體紅細(xì)胞凍結(jié)過程中的胞內(nèi)結(jié)晶現(xiàn)象。孫仲秋等[15]開發(fā)了類似的系統(tǒng)并研究了降溫及復(fù)溫速率對奶牛胚胎存活率的影響。郝保同等[16]研制了用于觀察方向性冰晶的定向固化冷凍平臺，并用顯微鏡觀察了不同濃度MeSO2低溫保護(hù)劑在不同降溫速率下的冰晶生長情況。T. Buttersack 等[17]利用聲波懸浮裝置，觀察了不同過冷度時純水液滴凍結(jié)時樹枝狀冰的生長過程并對其進(jìn)行了參數(shù)化研究。A. A. Shibkov等[19]結(jié)合冰晶生長動力學(xué)，研究了過冷純水薄層的冰晶生長過程中冰晶尖端生長速率、半徑等主要特征參數(shù)的變化情況。

上述研究中的冷卻速度通常無法達(dá)到大于等于1 000 ℃/min的快速冷凍條件，且在同等工況下，對某種冷凍保護(hù)劑與純水冰晶形成規(guī)律的對比研究較少。

本文研制了基于瞬態(tài)接觸法的快速冷凍新型低溫顯微成像系統(tǒng)，對純水、二甲基亞砜（DMSO）溶液分別以平板面自由液滴和模擬凍存管槽道內(nèi)冰晶生長特征進(jìn)行了可視化研究，并對比了鼠生精小管在純水和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% DMSO溶液中的冰晶形成特性。

1 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)及控溫方法

1.1 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)

考慮到生殖細(xì)胞實(shí)際凍存過程中樣本通常以液滴和凍存管形式凍存，設(shè)計(jì)了圖1中的部件11薄片載物臺。該載物臺為藍(lán)寶石玻璃材質(zhì)，低溫下的導(dǎo)熱系數(shù)在600 W/（m·K）以上，上表面布置了直徑為2 mm和0.5 mm的兩條半圓管槽來模擬凍存管環(huán)境；另一個側(cè)邊槽用于嵌接熱電偶溫度計(jì)。載物臺密封壓接在環(huán)境艙底部中心處，其底面相比環(huán)境艙底面微凸0.1 mm，使得在接觸瞬間來自液氮熱沉的冷量可以集中傳遞到載物臺而不是環(huán)境倉底面。

1 氣浮隔震平臺；2 數(shù)據(jù)采集儀；3 控制計(jì)算機(jī)；4 相機(jī);5 金相顯微鏡；6 真空泵；7 步進(jìn)電機(jī)；8 真空腔體；9 環(huán)境艙;10 液氮熱沉；11 藍(lán)寶石載物臺。圖1 基于瞬態(tài)接觸法的新型低溫顯微成像系統(tǒng)Fig.1 A new cryomicroscopy system based on the instant contact method

實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)主要由溫度測量系統(tǒng)、壓力測控系統(tǒng)和顯微成像系統(tǒng)組成。溫度測量系統(tǒng)主要包含精度為0.1 K的TT-36-T型熱電偶溫度傳感器（頭部直徑約為0.5 mm）、Keithley 2700六位半數(shù)據(jù)采集儀以及基于LabVIEW環(huán)境搭建的采集程序。壓力測控系統(tǒng)通過執(zhí)行機(jī)構(gòu)和設(shè)置的應(yīng)變片（位于圖1中部件7和部件9之間）形成負(fù)反饋PID控制載物臺與液氮熱沉之間的壓強(qiáng)。顯微成像系統(tǒng)主要包括光學(xué)顯微鏡和CCD相機(jī)兩部分，光學(xué)金相顯微鏡的最高放大倍率為50倍，高速工業(yè)相機(jī)有效像素為130萬，最高分辨率為1 280×1 024、幀率為211幀/s。

1.2 控溫方法

上述低溫顯微成像系統(tǒng)主要通過控制環(huán)境艙底部載物臺與液氮熱沉之間的壓強(qiáng)來控制樣品的降溫速率。不同壓強(qiáng)條件下載物臺的降溫曲線如圖2所示（對應(yīng)壓力分別為150、100、50 N）。在室溫220～300 K這一跨越液體結(jié)冰點(diǎn)的關(guān)鍵溫度區(qū)間內(nèi)，當(dāng)壓強(qiáng)超過3.2×105Pa時，載物臺的降溫速率平均約達(dá)1 600 K/min，遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)報(bào)道的對流型相關(guān)設(shè)備或?qū)嶒?yàn)臺數(shù)據(jù)[19-23]，克服了對流型設(shè)備在冷卻初期液氮進(jìn)入載物臺前受熱汽化，攜帶冷量小的問題。而冷凍操作啟動的最初幾秒時間正是影響冷卻效果最關(guān)鍵的部分。由圖2可知，載物臺在60 s內(nèi)溫度可降至約100 K；當(dāng)壓強(qiáng)減小后，載物臺的降溫速率減小。

圖2 不同壓強(qiáng)條件下載物臺的降溫曲線Fig.2 Cooling rates of the stage under different pressures

2 結(jié)果與分析

基于上述瞬態(tài)接觸法低溫顯微成像系統(tǒng)，開展了自由平板面和半圓管內(nèi)純水、DMSO溶液液滴在不同液滴直徑、液滴過冷度條件下的冰晶生長過程特性可視化研究。

2.1 平板面純水及DMSO溶液過冷液滴冰晶生長

純水液滴的凍結(jié)一般可分為兩個階段[24-26]，第一階段由于液體過冷狀態(tài)不穩(wěn)定，冰晶的凍結(jié)前端會產(chǎn)生一些小的隆起并不斷發(fā)展形成樹枝狀冰網(wǎng)，該階段持續(xù)時間非常短，當(dāng)冰網(wǎng)最終布滿整個液滴時進(jìn)入第二階段，第二階段中冰網(wǎng)間隙剩余的液態(tài)水繼續(xù)凍結(jié)，整個過程由相對穩(wěn)定的傳熱主導(dǎo)，可視為持續(xù)時間較長的準(zhǔn)等溫過程。本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)捕捉到的一個直徑為2 mm純水（雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于10 mg/kg）液滴的典型凍結(jié)過程如圖3所示。拍攝圖像中的亮斑是由于液滴凸面反射光源形成，通過對比0 ms和33 ms的瞬時圖像可知，液滴整體亮度瞬間發(fā)生顯著變化。這是由于樹枝狀冰網(wǎng)的產(chǎn)生改變了冰水混合物的折射率及密度，被樹枝狀冰網(wǎng)覆蓋的區(qū)域在視覺上呈現(xiàn)出變暗的特點(diǎn)，此時液滴內(nèi)已經(jīng)形成較為完整的樹枝狀冰網(wǎng)，而這一過程僅發(fā)生在33 ms內(nèi)。

圖3 直徑為2 mm純水液滴凍結(jié)過程Fig.3 Freezing process of a pure water droplet with 2 mm diameter

圖3中132 ms時已經(jīng)可以看到清晰的凍結(jié)前端由外向內(nèi)的推進(jìn)過程。該由外向內(nèi)的凍結(jié)過程指的并不僅是水平方向從液體邊緣到液體中心，事實(shí)上，由于局限于單一的俯視觀測方向，實(shí)驗(yàn)僅能觀察到液滴投影范圍內(nèi)的明暗變化，而實(shí)際是水平和垂直兩個維度的特征疊加。理論上，凍結(jié)過程應(yīng)該是由熱通量的負(fù)方向即液滴底面與載物臺接觸的部分開始向液滴頂部進(jìn)行。圖3中167 ms時凍結(jié)的第二階段已經(jīng)完成，從此角度觀察并未發(fā)現(xiàn)液體邊緣凍結(jié)前后的位移變化，故推測液滴凍結(jié)時體積的膨脹主要發(fā)生在垂直方向，期間液滴的表面張力起到了關(guān)鍵作用。

對3種不同直徑（2、3、4 mm）的純水液滴在不同過冷度條件下進(jìn)行了凍結(jié)實(shí)驗(yàn)，冰晶生長的平均速率（定義為單位時間內(nèi)冰晶邊緣移動的位移）如圖4所示。由圖4可知，3個直徑規(guī)格的純水液滴冰晶平均生長速率均隨過冷度的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢，且均在15～20 ℃的過冷度范圍內(nèi)達(dá)到最大值。出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因是由于純水的黏度隨溫度的降低而增加，在-15 ℃時其黏度已達(dá)到0 ℃時的3倍，黏度的增加在一定程度上阻礙了剩余水分子的移動，從而導(dǎo)致冰晶生長速率變緩。

圖4 純水液滴在不同過冷度條件下的冰晶生長速率Fig.4 Ice formation rates of pure water droplets under different degree of subcooling conditions

不同直徑純水液滴的冰晶平均生長速率差異顯著，總體上在一定直徑范圍內(nèi)冰晶生長速率隨液滴直徑的減小顯著提升。從傳熱學(xué)角度分析可得：當(dāng)液滴直徑較小時，凍結(jié)過程由導(dǎo)熱主導(dǎo)，可近似于一維固化過程。當(dāng)忽略液滴與周圍氣體的自然對流換熱時，冰晶生長速率較大程度上取決于液體的熱擴(kuò)散系數(shù)及與載物臺的換熱量[16]。其中換熱量與液滴底面積即液滴直徑的平方成正比，液滴凍結(jié)所需的冷量又與液滴體積即液滴直徑的三次方成正比，即冰晶的平均生長速率與液滴直徑成反比。因此，選用直徑較小的液滴在約20 ℃過冷度條件下進(jìn)行細(xì)胞冷凍可獲得較高的冷凍速率從而減少細(xì)胞損傷。

對3種不同直徑（2、3、4 mm）的DMSO溶液液滴也進(jìn)行了類似冷凍實(shí)驗(yàn)，不同過冷度條件下的冰晶生長速率如圖5所示。由圖5可知，在實(shí)驗(yàn)過冷度范圍內(nèi)，3個尺度的DMSO溶液液滴冰晶生長速率與過冷度的依變關(guān)系無明確的規(guī)律，且存在同一直徑的液滴，在相近的過冷度范圍內(nèi)冰晶生長速率也具有顯著差異的現(xiàn)象。但與純水相比，DMSO溶液的冰晶生長速率顯著低于純水。因此，若要達(dá)到相同級別的冰晶生長速率，DMSO溶液總體趨勢上需要更大的過冷度。

在1970年代，美國地質(zhì)調(diào)查局首先使用先進(jìn)的測量技術(shù)來測定圣安德烈斯斷層系上應(yīng)變積累的位置和速率。今天，許多研究小組每年使用足夠精確的全球衛(wèi)星定位接收器進(jìn)行幾個月的連續(xù)觀測來采集應(yīng)變數(shù)據(jù)，以便確定每年幾厘米的長期水平應(yīng)變積累速率。

圖5 DMSO溶液液滴在不同過冷度條件下的冰晶生長速率Fig.5 Ice formation rates of DMSO solution droplets under different undercooling conditions

通過對比直徑為2 mm的DMSO溶液在過冷度為7～8 ℃范圍內(nèi)冰晶的生長過程可知，該冰晶生長速率的巨大差異是由DMSO溶液液滴獨(dú)特的結(jié)晶方式引起的。圖6和圖7所示分別為液滴在過冷度為7.8、7.5 ℃兩個非常接近工況下的凍結(jié)過程。不同于純水液滴的結(jié)晶方式，DMSO溶液液滴結(jié)晶不再由液滴底部均勻開始，而是在液滴整體區(qū)域內(nèi)的隨機(jī)位置發(fā)生。由圖6可知，過冷度為7.8 ℃工況下，29 ms時液滴區(qū)域內(nèi)首次出現(xiàn)點(diǎn)狀晶核，隨后冰晶不斷擴(kuò)散生長，496 ms時在另一位置出現(xiàn)晶核，隨后兩者進(jìn)入同步并行生長過程。由圖7可知，過冷度為7.5 ℃工況下，點(diǎn)狀晶核出現(xiàn)在液滴中心位置附近，并向四周擴(kuò)散推進(jìn)，并在251 ms已基本處于生長末期。

圖6 過冷度為7.8 ℃，直徑為2 mm DMSO溶液液滴的凍結(jié)過程Fig.6 Freezing process of DMSO solution droplet with 2 mm diameter when degree of subcooling is 7.8 ℃

圖7 過冷度為7.5 ℃，直徑為2 mm DMSO溶液液滴的凍結(jié)過程Fig.7 Freezing process of DMSO solution droplet with 2 mm diameter when degree of subcooling is 7.5 ℃

綜上所述，DMSO溶液液滴中冰晶的生長過程相比純水液滴具有誘發(fā)點(diǎn)隨機(jī)性強(qiáng)的特點(diǎn)。冰晶生長初期，晶核在DMSO溶液液滴底部溫度最低處隨機(jī)生成，隨后呈輻射狀向三維空間內(nèi)生長，在此過程中有可能與其他位置的冰晶發(fā)生交匯，導(dǎo)致相同情況下的DMSO溶液液滴中冰晶生長速率差異較大。此外，DMSO溶液液滴中冰晶的生長速率顯著低于純水液滴，表明采用DMSO保護(hù)劑有助于減小冰晶對溶液中細(xì)胞的損傷。

2.2 半圓槽道內(nèi)純水冰晶生長

臨床應(yīng)用中的精子樣本通常置于冷凍管載體中進(jìn)行凍存，因此有必要進(jìn)行液體在圓管內(nèi)的冷凍實(shí)驗(yàn)。為消除細(xì)管自身的透明度及對光學(xué)觀察的影響，本實(shí)驗(yàn)采用半圓槽道的載體進(jìn)行液體裝載。圖8所示為直徑為2 mm半圓槽道（圖1部件11）內(nèi)純水在不同過冷度條件下的冰晶生長速率。由圖8可知，過冷度在0～10 ℃時，冰晶生長速率基本與過冷度呈線性相關(guān)，但冰晶生長較慢。主要原因是槽內(nèi)純水沿槽道方向也有分布，其體積和熱容遠(yuǎn)大于上述液滴，結(jié)晶前端推進(jìn)單位長度所需的冷量一般是液滴的數(shù)倍。同時圓形槽道壁面也對冰晶在水平方向的擴(kuò)展起到限制作用。

圖8 不同過冷度條件下半圓槽道內(nèi)純水的冰晶生長速率Fig.8 Ice formation rates of pure water in groove under different degree of subcooling conditions

槽道內(nèi)純水的冰晶生長一般由壁面開始。圖9～圖11所示為在不同過冷度條件下，冰晶生長的形貌變化。過冷度在0～4 ℃時，凍結(jié)前端呈現(xiàn)寬大圓潤的無分叉冰枝形態(tài)，冰晶生長平均速率為24 μm/s。單個冰枝的形態(tài)寬度和生長方向均無顯著規(guī)律，該結(jié)論與A. A. Shibkov等[19]在薄層水凍結(jié)實(shí)驗(yàn)中觀察到凍結(jié)尖端的分裂即分叉的樹枝狀冰晶現(xiàn)象不同。當(dāng)過冷度進(jìn)一步升至4～6 ℃時，冰枝尖端顯著變尖且整體變窄，冰枝的分布更均勻，冰晶生長的平均速率為86 μm/s；當(dāng)過冷度超過6 ℃時，冰枝已經(jīng)形成極窄的細(xì)針狀，在一定范圍內(nèi)具有一致的生長方向。無論從冰晶生長速率還是冰枝形態(tài)來看，低過冷度下純水的冰晶生長過程較溫和，而高過冷度條件下冰晶生長不僅具有更大的動量，且其尖端更鋒利，應(yīng)力更集中，更容易穿透細(xì)胞膜并對細(xì)胞造成損傷，此時冰晶生長平均速率已達(dá)到240 μm/s。因此，推測A. A. Shibkov等[19]的測試結(jié)果可能是在過冷度較大的條件下獲得。

圖9 0.5 ℃過冷度條件下槽道內(nèi)純水凍結(jié)過程Fig.9 Freezing process of pure water in groove when degree of subcooling is 0.5 ℃

圖10 4.3 ℃過冷度條件下槽道內(nèi)純水凍結(jié)過程Fig.10 Freezing process of pure water in groove when degree of subcooling is 4.3 ℃

圖11 9.5 ℃過冷度條件下槽道內(nèi)純水凍結(jié)過程Fig.11 Freezing process of pure water in groove when degree of subcooling is 9.5 ℃

2.3 生精小管的冰晶生長

在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開展了鼠生精小管的冷凍實(shí)驗(yàn)，過冷度設(shè)定為20 ℃。鼠生精小管在純水和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% DMSO溶液中的凍結(jié)過程如圖12、圖13所示。由圖12和圖13可知，純水中生精小管的凍結(jié)分為小管內(nèi)外兩部分，管外的純水冰晶呈細(xì)針狀快速生長，在達(dá)到管壁后，管內(nèi)靠近壁面部分也開始結(jié)晶，呈現(xiàn)零散的黑色點(diǎn)狀區(qū)域。在管內(nèi)冰晶生長的同時，管壁的另一側(cè)也觀察到細(xì)針狀冰晶從管壁處開始生長。但在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%DMSO溶液中，水分子通過與DMSO的作用使溶液黏性增加，冰點(diǎn)降低，顯著弱化了管外的冰晶生長，使其不再具有窄長細(xì)針狀的形態(tài)，降低了其對生精小管的機(jī)械損傷風(fēng)險(xiǎn)，使生精小管得以維持較完好的生理形態(tài)。

圖12 生精小管在純水中冷凍實(shí)驗(yàn)Fig.12 Freezing process of seminiferous tubules in pure water

圖13 生精小管在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%DMSO溶液中冷凍實(shí)驗(yàn)Fig.13 Freezing process of seminiferous tubules in 10% DMSO solution

3 結(jié)論

本文研制了一套基于瞬態(tài)接觸冷卻方法的新型低溫顯微成像系統(tǒng)，觀察了平板面和圓形槽道內(nèi)純水、DMSO溶液及鼠生精小管的冰晶形成現(xiàn)象，分析了水和冷凍保護(hù)劑在不同過冷度條件下的冰晶生長特征，得到結(jié)論如下：

1）在平板面上的液滴冷凍實(shí)驗(yàn)中，冰晶由純水液滴的熱通量負(fù)方向開始較均勻地生長，而DMSO溶液液滴內(nèi)的冰晶生長則呈現(xiàn)隨機(jī)性多點(diǎn)生長特征；DMSO溶液液滴內(nèi)的冰晶生長速率顯著低于純水，表明采用DMSO保護(hù)劑有助于減小冰晶對溶液中細(xì)胞的損傷。

2）在槽道內(nèi)的液滴冷凍實(shí)驗(yàn)中，純水冰晶生長速率隨過冷度增加近似呈線性增長，生長形態(tài)總體上為無分叉的樹枝狀冰晶，但其幾何形貌隨過冷度不同而呈現(xiàn)顯著差異。低過冷度時，冰枝尖端圓潤且間隔較寬，高過冷度時，冰枝呈細(xì)針狀。

3）在生精小管冷凍實(shí)驗(yàn)中，由于水分子與DMSO作用弱化了冰晶生長，鼠生精小管外的冰晶即使在大過冷度下也未出現(xiàn)在純水實(shí)驗(yàn)中觀察到的細(xì)針狀形態(tài)，降低了冰晶對生精小管的機(jī)械損傷風(fēng)險(xiǎn)，使生精小管得以維持更為完好的生理形態(tài)。

本文受上海市科委創(chuàng)新行動計(jì)劃（20S31903400）、上海市申康促進(jìn)創(chuàng)新能力三年行動計(jì)劃 （SHDC2020CR3077B）和上海交通大學(xué)醫(yī)工交叉研究基金（YG2021QN86）項(xiàng)目資助。（The project was supported by Innovation Action Plan of Shanghai Science and Technology Commission（No.20S31903400）, Three-year Action Plan of Shanghai Shenkang to Promote Innovation Ability（No.SHDC2020CR3077B） and Biomedical Engineering Interdisciplinary Fund of Shanghai Jiao Tong University （No.YG2021QN86）.）